动物细胞融合与杂交

动物细胞融合与杂交第1页，共63页，2023年，2月20日，星期四第一节细胞融合与杂交概述一.概念和目的细胞融合：自然或人为条件下，两个或两个以上细胞相互接触，发生膜融合、胞质融合和核融合形成融合细胞的现象。细胞杂交：不同类型的细胞之间发生的融合叫做细胞杂交。（种间杂交、种内杂交）目的：获得杂种优势第2页，共63页，2023年，2月20日，星期四第二节细胞融合的方法一、细胞融合的一般过程第3页，共63页，2023年，2月20日，星期四细胞融合过程可分为：凝集：细胞凝集与细胞膜的糖蛋白有关蛋白质分子重新分布：是细胞融合的必要前提脂质分子重排：是实现细胞融合的关键胞质合并：后续的稳定步骤。第4页，共63页，2023年，2月20日，星期四二．融合方法

最早被采用病毒融合剂有疱疹病毒、天花病毒和副粘液病毒等在内的病毒类融合剂。灭活仙台病毒介导细胞融合过程可以大大提高融合频率。它在病毒类融合剂中最为有效，使用最广。1.病毒诱导融合：第5页，共63页，2023年，2月20日，星期四

灭活的病毒既保留了诱导细胞融合的能力，又不会感染细胞。灭活仙台病毒诱导融合的机理第6页，共63页，2023年，2月20日，星期四使用仙台病毒诱导细胞融合步骤先将亲本细胞分别制成悬液、混合离心将沉积细胞悬于1ml灭活的仙台病毒悬液，置冰浴间歇摇动20分钟，细胞凝集温度升至37℃

，间歇摇动30分钟，使其进行融合洗去病毒，即可将融合物悬浮于选择性培养基进行培养。第7页，共63页，2023年，2月20日，星期四2．化学诱导融合它们主要包括聚乙二醇（PEG）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、聚乙烯醇、聚甘油、溶血卵磷酯、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰胆碱、甘油－醋酸酯、油酸、油胺和二价阳离子载体等。其中则以PEG的使用最为广泛。第8页，共63页，2023年，2月20日，星期四PEG可能的促融合作用机理

1、PEG可能使细胞膜的脂类分子的物理结构发生重排，容易被PEG作用打开细胞膜，使细胞融合。

2、PEG可能会把细胞膜上的蛋白质分子排开，使脂质体扦入与膜结合。

3、PEG可能作用于膜磷脂极性基团和细胞膜表面蛋白。使膜磷脂的表面电位下降，同时使膜糖蛋白的排阻体积减少，最终使膜出现缺口，进而融合。第9页，共63页，2023年，2月20日，星期四PEG诱导细胞融合的效果：PEG分子量大小:1000－6000浓度:30－60％。PEG分子量和浓度越大，其融合率越高，但它的细胞毒性和粘度也随之增大。一般认为PEC浓度为30－50％时，以分子量1000的融合效果最佳。如果浓度增至50％和60％时则改变PEG400为好。PEG的处理时间。悬浮法，1－2分钟离心法，5－8分钟第10页，共63页，2023年，2月20日，星期四

若辅以5－15％的二甲亚砜或在融合前先用植物血凝素处理一下，则效果更好。

PEG诱导融合的优点：PEG来源广泛，操作简单，诱导率也相对于病毒诱导要高。使目前最常用的细胞融合诱导方法。第11页，共63页，2023年，2月20日，星期四3．电融合法：电融合技术的原理：悬于大小不同的两平行电极间的低导电率溶液中的细胞，在1－100MHz和100－1000V/cm的交流电场中，会向小电极移动，并极化成偶极子，而沿电场方向排列成串，此时再加上适当强度和持续时间的高压电脉冲、即可使相邻细胞膜的接触区产生可逆电击穿，从而触发细胞融合。第12页，共63页，2023年，2月20日，星期四第13页，共63页，2023年，2月20日，星期四第14页，共63页，2023年，2月20日，星期四第15页，共63页，2023年，2月20日，星期四电融合技术的优点①对细胞损伤小。②融合效率高。③融合方法快速，可重复性强。④融合细胞可在光镜下直接观察、跟踪、鉴定，可控性好。第16页，共63页，2023年，2月20日，星期四最大的不利之处是仪器的购置。在融合大小不同的细胞时存在问题。在融合膜成分不同的细胞时存在困难。电融合技术的不利之处：第17页，共63页，2023年，2月20日，星期四电融合技术的改进方法1、物理法磁-电融合法声-电融合法电-机融合法2、化学法利用化学试剂（刀豆蛋白A等）凝集细胞后电融合。3、特异性电融合法利用抗原抗体特异性结合凝集细胞电击。第18页，共63页，2023年，2月20日，星期四三、细胞融合的影响因素1.细胞种类和性质（细胞种类、细胞的表面性质、亲本细胞的亲缘关系）2.融合条件（温度、pH值、氧气）3.离子强度和种类（一般是Ca2+，50—100mmol/L）第19页，共63页，2023年，2月20日，星期四第三节融合子的检出与鉴定一、融合子的筛选遗传互补筛选法：HAT筛选营养缺陷型互补选择法抗性互补选择法形态特征选择法生长特性选择法第20页，共63页，2023年，2月20日，星期四脾细胞(B淋巴细胞)骨髓瘤细胞杂交瘤细胞脾细胞/脾细胞骨髓瘤细胞/骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞脾细胞筛选出不能长期存活不能长期存活第21页，共63页，2023年，2月20日，星期四HAT培养基筛选H,次黄嘌呤;A,氨基喋呤;T,胸腺嘧啶DNA内源性途径(主要途径)谷氨酰胺or单磷酸尿苷酸二氢叶酸还原酶AHT外源性途径(旁路途径)(Hypoxanthineguzninephosphoribosyltransferase)

次嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶

(HGPRT

)胸腺嘧啶激酶

(TK)(Thymidinekinase)B淋巴细胞：HGPRT+，

TK+骨髓瘤细胞：HGPRT-，

TK-存活死亡外源性途径(旁路途径)第22页，共63页，2023年，2月20日，星期四二、融合子的鉴定1.细胞学鉴定：染色体鉴定2.生化分析：同工酶谱分析3.分子生物学鉴定：DNA探针技术第23页，共63页，2023年，2月20日，星期四第四节杂交瘤技术一、基础知识：抗体：免疫球蛋白抗原：可诱导机体产生免疫应答，并可与应答产物结合的外来“异物”。免疫反应：指机体免疫系统对异己物质的识别与清除等一系列复杂过程。抗体分子组成：2Fab+1Fc单抗：单克隆抗体是指由一个B细胞分化增殖的子代细胞(浆细胞)产生的针对单一抗原决定簇的抗体。（均一性、特异性）第24页，共63页，2023年，2月20日，星期四第25页，共63页，2023年，2月20日，星期四第26页，共63页，2023年，2月20日，星期四二.B淋巴细胞杂交瘤技术基本原理：正常的可产生抗体的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞在融合剂的作用下产生融合，杂交的细胞在HAT选择培养基中进行培养，得到的为杂交瘤细胞，该细胞既具有可分泌抗体的功能又可在体外大量增殖的能力。第27页，共63页，2023年，2月20日，星期四KohlerandMilstein

第28页，共63页，2023年，2月20日，星期四脾细胞(B淋巴细胞)骨髓瘤细胞杂交瘤细胞长命不分泌抗体分泌抗体短命分泌抗体长命Köhler和Milstein,19751984年Nobel医学奖杂交瘤技术路线第29页，共63页，2023年，2月20日，星期四第30页，共63页，2023年，2月20日，星期四第31页，共63页，2023年，2月20日，星期四B淋巴细胞本身是一种终末分化细胞，通常不再进行细胞分裂，存活一段时间后便会死亡——短命细胞（一）、亲本细胞概述脾脏与B淋巴细胞(Blymphocytes)：一般来讲，脾脏有三大功能：1.它是“血库”，当人体休息安静时，它贮存血液；当处于运动、失血、缺氧等应激状态时，它又将血液排送到血循环中，以增加血容量。2.脾脏犹如一台“过滤器”，当血液中出现病菌、抗原、异物、原虫时，脾脏中的巨噬细胞、淋巴细胞就会将其吃掉。3.脾脏还可以制造免疫球蛋白、补体等免疫物质，发挥免疫作用。第32页，共63页，2023年，2月20日，星期四B淋巴细胞发育过程：祖B淋巴细胞前B淋巴细胞成熟B淋巴细胞抗原刺激、递呈细胞和Th细胞作用活化B淋巴细胞分化为浆细胞第33页，共63页，2023年，2月20日，星期四骨髓瘤细胞(myelomacells):恶性增殖的转化细胞，只要营养条件适合可永远分裂和存活——长命细胞。①能在体外连续生长，倍增期短于24小时；②缺乏HGPRT酶；③克隆效应高；④在动物中有致肿瘤性；⑤与小鼠淋巴细胞融合率相当高；⑥本身不合成Ig，且不抑制杂交瘤细胞中的Ig合成基因。骨髓瘤细胞的选择原则第34页，共63页，2023年，2月20日，星期四（二）、杂交瘤技术的操作流程1.动物免疫：目的：在细胞融合后获得尽可能多的分泌针对于该目标抗原的特异性抗体的杂交瘤细胞.特定目标抗原动物免疫脾脏中B淋巴细胞B淋巴细胞大量增殖刺激能分泌针对于该抗原的特异性抗体第35页，共63页，2023年，2月20日，星期四免疫动物的选择选择免疫动物，即供脾动物，通常选用小鼠。正常供体和骨髓瘤细胞种系发生越近缘，产生的杂交瘤就越稳定(反之亦然)。因为作为融合用的大多数小鼠骨髓瘤细胞是从BALB/C纯系小白鼠取得，所以用BALB/C作脾细胞供体最为合适。第36页，共63页，2023年，2月20日，星期四常规免疫法脾内一次性免疫法短程免疫法体外免疫法常用免疫方法：“稳妥；优势克隆”皮下注射腹腔注射静脉注射免疫途径：“省时；省抗原”“省时”“操作繁琐”第37页，共63页，2023年，2月20日，星期四免疫方案

a.颗粒性抗原免疫性较强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果。下面以细胞性抗原为例的免疫方案:初次免疫1×10７／0.5mlip(腹腔内注射)↓2～3周后第二次免疫1×10７／0.5mlip↓3周后加强免疫(融合前三天)

1×10７／0.5mlip或iv(静脉内注射)↓取脾融合第38页，共63页，2023年，2月20日，星期四

b.可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐剂;

初次免疫Ag

1～50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射│(一般0.8～1ml

0.2ml／点)↓3周后第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip│(ip剂量不宜超过0.5ml)↓3周后第三次免疫剂量同上，不加佐剂，ip│(5～7天后采血测其效价，检测免疫效果)↓2～3周后加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv↓3天后取脾融合第39页，共63页，2023年，2月20日，星期四（2）、细胞融合及HAT筛选1、细胞融合方法：1)脾细胞悬液的制备：最后一次加强免疫后第3天制备（机械分离法），培养基RPMI1640。

2)骨髓瘤细胞悬液的制备：于对数生长期挑选形态较好的细胞，台盼兰染色后计数，挑选80％以上存活率的细胞离心后重新悬浮。2)50%PEG配制：称取2gPEG（1000或4000）于青霉素瓶加塞，8磅（0.06MPa）15min，待冷至50℃加等量预热的不含血清的培养基。第40页，共63页，2023年，2月20日，星期四1）108小鼠脾细胞与107骨髓瘤细胞混合，离心（1000rpm，10min），弃上清。2）轻扣管底，混匀细胞，37℃水浴3）60s内滴加0.6ml50％PEG，边滴边摇动试管，30s内将细胞悬液吸入吸管静置30s，再在30s内缓慢转入离心管；5min内后加入10mlDMEM终止PEG作用。3）离心，弃上清，加15mLHAT培养基，混匀，转入96孔板（预先有HAT培养基培养的饲养细胞），每孔100ul。4）37℃孵箱孵育，2-3天换HAT一次，持续2周3)细胞融合：第41页，共63页，2023年，2月20日，星期四细胞融合注意事项：1、细胞比例：脾细胞/瘤细胞约5-10/1。2、反应时间：慢、转、柔。3、反应温度：37℃，所有用液均需提前预热。4、PEG选择：分子量、浓度（30—50%间）。5、不要使用含有血清的培养基（PEG能引起蛋白质沉淀）。第42页，共63页，2023年，2月20日，星期四2、HAT培养基的筛选融合后细胞混合液HAT培养基2weekslaterHT培养基正常培养基1weeklater第43页，共63页，2023年，2月20日，星期四HAT培养基筛选H,次黄嘌呤;A,氨基喋呤;T,胸腺嘧啶DNA内源性途径(主要途径)谷氨酰胺or单磷酸尿苷酸二氢叶酸还原酶AHT外源性途径(旁路途径)(Hypoxanthineguzninephosphoribosyltransferase)

次嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶

(HGPRT

)胸腺嘧啶激酶

(TK)(Thymidinekinase)B淋巴细胞：HGPRT+，

TK+骨髓瘤细胞：HGPRT-，

TK-存活死亡外源性途径(旁路途径)第44页，共63页，2023年，2月20日，星期四（3）、杂交瘤细胞的筛选（抗体的检测）一般在杂交瘤细胞布满孔底1／10面积时，即可开始检测特异性抗体，筛选出所需要的杂交瘤细胞系。检测抗体的方法应根据抗原的性质、抗体的类型不同，选择不同的筛选方法，一般以快速、简便、特异、敏感的方法为原则。可靠的筛选方法必须在融合前建立，避免由于方法不当贻误整个筛选时机。第45页，共63页，2023年，2月20日，星期四酶联免疫吸附法(ELISA)抗原第1抗体酶第2抗体待检杂交瘤培养上清液底物有色产物酶标仪检测技术原理：第46页，共63页，2023年，2月20日，星期四（4）、杂交瘤细胞的克隆培养克隆化一般是指将抗体阳性孔进行克隆化。经过HAT筛选后的杂交瘤克隆不能保证一个孔内只有一个克隆。在实际工作中，可能会有数个甚至更多的克隆。克隆化的原则是，对于检测抗体阳性的杂交克隆应尽早进行克隆化，否则抗体分泌的细胞会被抗体非分泌的细胞所抑制，因为抗体非分泌细胞的生长速度比抗体分泌的细胞生长速度快，二者竞争的结果会使抗体分泌的细胞丢失。第47页，共63页，2023年，2月20日，星期四杂交瘤细胞的克隆培养常用克隆化方法：有限稀释法软琼脂平板法80个细胞/96孔饲养细胞(feedercells)ELISA法检测单克隆杂交瘤细胞的培养上清，选出分泌特异性抗体的阳性孔，所分泌抗体即为单克隆抗体。第48页，共63页，2023年，2月20日，星期四1）、有限稀释法有限稀释法原理是从理论上将细胞稀释到10个/ml，然后装成每小孔(96孔板)0.1ml，使每孔理论上含有单个细胞，经过培养后即可获得单个细胞形成集落。有时为了加快克隆细胞生长速度，常采用腹腔巨噬细胞做饲养层细胞。第49页，共63页，2023年，2月20日，星期四1.取1.0ml5×104ml细胞+4ml培养基稀释，得1×104/ml.2.取0.5ml1×104ml细胞液+9.5ml培养基稀释，得1×103/ml.3.取1.0ml1×103ml细胞液+9.0ml培养基稀释，得1×102/ml.有限稀释法举例：

第50页，共63页，2023年，2月20日，星期四2）软琼脂培养法：本法对于某些抗原，可以把克隆化培养与特异性筛选测定结合起来进行，所以它的特点是效率较高，速度较快。但缺点是克隆率不高。第51页，共63页，2023年，2月20日，星期四利用单个细胞在软琼脂培养基上的局限化生长，待细胞集落长到肉眼可见后，用巴氏吸管从琼脂上挑出来(一般8—10天后)，再移到液体培养基中，进行生长繁殖，并检测培养上清液的活性。基本原理第52页，共63页，2023年，2月20日，星期四饲养细胞

在杂交瘤细胞筛选、克隆化和扩大培养过程中，需要加入饲养细胞。常用的饲养细胞有：小鼠腹腔巨噬细胞(较为常用)、小鼠脾脏细胞或小鼠胸腺细胞。

第53页，共63页，2023年，2月20日，星期四饲养层细胞的作用提高培养细胞的密度，使待克隆细胞容易生存与繁殖。腹腔细胞能清除培养中的死亡细胞，从而促进单个细胞克隆的生长。饲养细胞能释放诸如细胞生长因子类物质，起到促进细胞分裂、增殖的作用。第54页，共63页，2023年，2月20日，星期四目的：保种。方法：离心收集杂交瘤细胞悬液，用含10％DMSO和10％FBS的培养基调整细胞密度，若短期保存，可置-80度冰盒中；若长期保存，则从冰盒转入液氮中。复苏：如果冻存的细胞是来自96孔板的一孔，复苏后也应接种到96孔板的一个孔中（5）杂交瘤细胞的冻存与复苏第55页，共63页，2023年，2月20日，星期四

大量生产单克隆抗体的方法主要有两种：体外使用旋转培养管大量培养杂交瘤细胞，从上清中获取单克隆抗体。但此方法产量低，一般培养液含量为10～60μg／ml，如果大量生产，费用较高。体内接种杂交瘤细胞，制备腹水。（6）单克隆抗体的大量生产第56页，共63页，2023年，2月20日，星期四腹水的制备

常规是先腹腔注射0.5mlPristane(降植烷)或液体石腊于BaLb／c鼠，1～2周后腹腔注射1×106个杂交瘤细胞，接种细胞7～10天后可产生腹水，密切观察动物的健康状况与腹水征象，待腹水尽可能多，而小鼠频于死亡之前，处死小鼠，用滴管将腹水吸入试管中，一般一只小鼠可获1～10ml腹水。也可用注射器抽取