六糖脂和膜蛋白的糖基化

六糖脂和膜蛋白的糖基化第1页，共52页，2023年，2月20日，星期三动物的细胞表面含有丰富的糖缀合物。质膜糖蛋白和糖脂聚糖，产生一种突出细胞表面l0mm的网状结构（图）。这种被称为糖萼（glycocalyx）的网状物能够在薄切片电子显微镜下观察到。糖萼相当于细胞最外层表面，在细胞间的相互作用中，有明确规定的作用。与可溶性糖蛋白连接聚糖一样，质膜聚糖可以在信息和结构两方面起作用。第2页，共52页，2023年，2月20日，星期三红细胞表面糖萼的电镜图像第3页，共52页，2023年，2月20日，星期三

一、多数整合性膜蛋白都是糖基化的在前面已经讨论过一些膜蛋白形式的糖基化。但是，细胞膜糖蛋白中共同的固有特征，值得进行重点讨论。常把细胞表面结合的水溶性蛋白质，看作是胞外基质的一部分，而不是质膜的一部分。因此，主要的质膜糖蛋白都是整合性膜蛋白。一般说来，与这类蛋白质连接的N-连接聚糖和O-连接聚糖，与分泌的糖蛋白上发现的聚糖类似，而且这类聚糖合成和连接的机构与膜蛋白和分泌蛋白质是共同的。因此，某些结构，例如含有聚乳糖胺链的延伸结构，在膜蛋白质中就比较普遍。第4页，共52页，2023年，2月20日，星期三质膜表面糖基化位点的分布，没有固定的规律可循，但存在某种共同的模式（图）。在只有一个跨膜序列的膜蛋白中，普遍的情况是，离细胞膜最近的多肽部分，至少有一个N-糖基化位点。特别在寡聚膜蛋白中，在此区域的糖基化，可能从突出细胞表面的其他结构域茎部周围形成领圈。寡糖圆环可能对这类蛋白质确定其垂直于膜表面的位置有帮助。整合性膜蛋白O-连接糖基化的延伸区有类似的这种作用。这类聚糖的位置比较靠近细胞表面，而不是位于糖蕚的表面，使得它们不大可能成为识别事件的靶标。第5页，共52页，2023年，2月20日，星期三膜蛋白糖基化共有模式的概要图

单元分布体（monotopic）跨膜蛋白在任一方位只含一个跨膜序列；多元分布体（polytopic）膜蛋白含不同排列方式的多个跨膜序列；多数膜蛋白共有N-连接和O-连接的两种聚糖。第6页，共52页，2023年，2月20日，星期三

含多个跨膜节段的膜蛋白也常常带有N-连接糖基化。按常规，每个多肽链只有一个糖基化位点，这种情况常出现在含有30个或更多氨基酸的相对较大的环内。在蛋白质中，糖基化多发生在大小适当的胞外环的N-末端。每个多肽链只选择一个糖基化位点，表明这些蛋白质上的表面积可用空间有限，其中膜结构域密切地堆积着α螺旋。由此，这些糖在蛋白质上面形成了局部的保护伞。第7页，共52页，2023年，2月20日，星期三二、神经细胞黏附分子的聚唾液酸化阻止细胞黏附膜蛋白糖基化的一个重要作用是递呈可与凝集素结合的各种各样的末端结构。但是，糖基化也能以其他方式调控黏附作用。细胞表面聚糖E.添加聚唾液酸（polysialicacid）的作用是一个深人研究的例子。第8页，共52页，2023年，2月20日，星期三神经细胞黏附分子（neu-ralcelladhesionmolecule,NCAM）以同型相互作用的方式，介导细胞表面间的黏附作用。由8个至100个或更多N-乙酰神经氨酸（NeuAc）残基以α-2,8连键组成的链，能够特异地添加到神经细胞黏附分子上，阻止神经细胞黏附分子同型相互作用，因而排斥黏附作用。第9页，共52页，2023年，2月20日，星期三聚唾液酸链之所以产生排斥作用，是因为它体积庞大且带有负电荷。聚唾液酸化NCAM膜表面间的排斥作用，能够抑制其他细胞表面受体的黏附功能和NCAM本身介导的黏附作用。聚唾液酸的添加与细胞的迁移能力或形状的改变有密切的联系。因此，脑发育过程中的细胞迁移和轴突发育与NCAM的聚唾液酸化有关。脑发育变慢，NCAM聚唾液酸化水平急剧下降，表现为当成年人大脑神经回路（wiringcircuitry）建立起来时，神经元间稳定的相互作用次数增加。第10页，共52页，2023年，2月20日，星期三三、细胞膜含有糖脂和糖蛋白

聚糖除了在动物细胞表面与整合性蛋白连接外，也与脂质的头部基团连接。嵌入膜双层糖脂（glycolipid）脂质部分的结构分成两大类(图)。建构在脑酰胺（ceramide）的糖脂，称为糖鞘脂（glyco-sphingolipid），因为脑酰胺的形成是由酰胺连键的脂肪酸与长链氨基醇，即鞘氨醇（sphingosine）为基础的。与膜糖蛋白相同，糖鞘脂的作用是提供参与细胞和细胞相互作用的潜在识别标志。糖鞘脂也在特殊膜结构域的组成中起作用。相比之下，建构在磷脂酰甘油（phosphatidyl-glycerol）核心上的糖基磷脂（glycophospholipids）提供了一种蛋白质锚定在细胞表面上的机制。第11页，共52页，2023年，2月20日，星期三建构相同的精细末端结构。把末端结构和核心结构的两种多样性结合起来，意味着不同结构的糖脂有上千种。糖鞘脂的脂质部分和糖基磷脂共价结构及糖鞘脂共同的头部基团第12页，共52页，2023年，2月20日，星期三糖鞘脂有两大类主要的亚族，它们之间的区别在于鞘氨醇结合的第一个糖是半乳糖还是葡萄糖。最基本的半乳糖鞘脂（galactosphingolipid）是比较简单的硫苷脂（sulphatide）分子，它的半乳糖是在3位上二硫酸化的。一般说来，葡萄糖鞘脂（glucosphingolipid）的头部基团则更为精致，并且常与糖蛋白上的末端聚糖相同。第13页，共52页，2023年，2月20日，星期三很多糖鞘脂最初是从脑中分离的，最常见的一种结构系列神经节（ganglio）就是根据这一事实命名的。最短的神经节系列成员其核心葡萄糖上只连接一个半乳糖残基，被称为G3，添加一个N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)残基形成G2，再延伸一个半乳糖残基产生G1。在常用缩略语中，在G和数目字之间插人第二个字母，表示核心的唾液酸化状态：M表示单唾液酸化，D和T分别为二唾液酸化和三唾液酸化等。如果下标添加有字母是区别异构体中唾液酸不同的结合位置。第14页，共52页，2023年，2月20日，星期三第15页，共52页，2023年，2月20日，星期三至少还有7种其他的核心序列。拟乳糖系列（lactoneoseries）中，重复单位为Gal-β-1,4-GlcNAc二糖，与糖蛋白结合的N-连接和O-连接聚糖的聚乳糖胺结构相类似。这类结构与其他糖脂和糖蛋白聚糖的核心和延伸结构的相似性，意味着在这两种形式的糖缀合物上可以建构相同的精细末端结构。把末端结构和核心结构的两种多样性结合起来，意味着不同结构的糖脂有上千种。第16页，共52页，2023年，2月20日，星期三四、糖鞘脂生物合成发生在高尔基体内糖鞘脂的生物合成与多萜醇连接的聚糖转移到蛋白中天冬酰胺残基的生物合成相似。启动葡萄糖鞘脂合成添加第一个葡萄糖残基是从内质网膜胞质表面核苷酸糖供体开始(图)。第17页，共52页，2023年，2月20日，星期三糖鞘脂生物合成途径半乳糖鞘脂和葡萄糖鞘脂两者的合成是在膜的胞质侧开始的，并在腔内完成，但是跨膜翻转发生点在两种途径中有所不同；硫酸基供体为3’-磷酸腺苷-5’-磷酰硫酸（PAPS）第18页，共52页，2023年，2月20日，星期三经过还不太了解的跨膜翻转过程之后，紧接着，脂质移动通过分泌途径，利用接近核苷酸糖供体的机会，进一步添加糖。相比之下，半乳糖鞘脂生物合成的第一步发生在腔膜内侧，因此，为了接近转移酶，不需要进行翻转。参与糖脂生物合成第一阶段的糖基转移酶，决定特定细胞核心结构的大小和形状。添加末端结构的一些酶，与糖蛋白N-连接和O-连接结构上产生相同精细末端结构的酶相类似。但是，修饰糖脂和糖蛋白的酶多数情况还是有区别的。第19页，共52页，2023年，2月20日，星期三一般情况下，糖脂是沿膜蛋白途径通过细胞腔内区室向质膜迁移。多数糖脂在这一穿行（trafficking）过程中组装成称作脂筏的分散的微型结构域。一旦坚持到糖脂接触到细胞膜，这些脂筏叮能引发脂双层内胆固醇与鞘脂的相互作用。除糖脂外，鞘脂还包括鞘磷脂，其中磷酸胆碱头部基团取代了聚糖。虽然对作为脂筏形成理论基础的分子相互作用尚未了解清楚，但是脂筏形成了一种与周围呈流体状的磷脂不同的凝胶相却是公认的事实。去污剂可以分散开大块膜磷脂，但这些脂筏对去污剂有抗溶解的作用。

第20页，共52页，2023年，2月20日，星期三人们相信脂筏的形成对糖脂优先靶向极性细胞顶部表面起一定的作用。还不清楚这一现象是细胞膜胞质侧脂筏与寻靶蛋白质相互作用的结果，还是由于这些脂筏的大小而沿特异途径运送所造成的。脂筏组分中富含一种被称为小窝的细胞表面烧瓶形状的内陷(invagination)表明这些脂筏可能有助于将膜组分分解成这些结构。曾有人提出，这些小窝参与特殊形式的胞吞作用。第21页，共52页，2023年，2月20日，星期三五、细胞表面糖脂对神经系统的发育非常重要糖脂在大部分组织的脂肪成分中的含量一般少于5％，但在神经系统绝缘轴突的髓鞘(myelinsheath)的脂肪成分中的含量在25%以上。髓鞘是由施旺细胞(Schwanncell)的质膜和围绕轴突重复包起来的少突胶质细胞(oligodendrocyte)形成的。膜层要经受挤压，胞质表面应彼此相互压紧(图)。压实作用由膜细胞外表面的相互作用完成。第22页，共52页，2023年，2月20日，星期三第23页，共52页，2023年，2月20日，星期三在髓鞘中含有丰富的以半乳糖为基础的半乳糖脑酰胺和硫苷脂，但是髓鞘中也含有大量的各种葡萄糖鞘脂类。糖脂的聚糖头部基团能够从几个方面介导髓鞘的形成，包括髓鞘各层之间的相互作用、髓鞘最内层和轴突之间的相互作用，以及在被称作郎飞结（nodesofRanvier）间隙处的髓磷脂边缘间的相互作用。第24页，共52页，2023年，2月20日，星期三例：利用基因敲除小鼠，探查糖脂在神经系

统中的作用已经建立起几种不同类型的（基因）敲除小鼠，用以探查糖脂在神经系统中的作用。1、缺乏介导葡萄糖脑酰胺合成酶的个体细胞可以正常增殖，表明糖脂对细胞的基本生理功能并不重要。但是，缺乏这种转移酶的小鼠的胚胎，其发育期超不过8天，说明某些葡萄糖鞘脂对发育的重要性。第25页，共52页，2023年，2月20日，星期三2、能合成葡萄糖脑酰胺，但缺乏延伸糖脂神经节系列的GalNAc转移酶的小鼠可以存活。然而，这些小鼠虽然在形态学上存在正常的髓鞘，但它们要遭受进行性的脱髓鞘(progressivedemyelination)，这表明，糖脂在稳定髓鞘上有着更为复杂的功能。3、尽管髓磷脂中含有丰富的半乳糖鞘脂，在缺乏启动合成半乳糖鞘脂的半乳糖基转移酶的（基因）敲除小鼠中也能形成髓鞘。在这类小鼠的脑中额外合成的葡萄糖脑酰胺，可以补偿半乳糖脑酰胺和硫苷脂的缺失，形成形态学上同样正常的髓鞘。但是，这些小鼠仍然表现神经缺陷，说明这些小鼠仍然表现为髓鞘功能不全。第26页，共52页，2023年，2月20日，星期三对缺乏半乳糖脑酰胺糖脂或缺乏大分子葡萄糖脑酰胺脂类小鼠中髓鞘形成的研究结果表明，糖脂头部基团的物理性质是髓鞘形成过程的关键，糖的特异序列并不是关键。头部基团可能有助于在脂双层间保持合适的间距。髓磷脂的这一功能可能代表糖脂头部基团一般性作用的特殊形式，在动物细胞表面周围形成隔离物，建立起糖的网络结构。对细胞膜物理性质产生的调控作用类似于糖基化对蛋白质结构和稳定性的直接影响。第27页，共52页，2023年，2月20日，星期三但是，髓磷脂中出现能够结合糖脂头部基团的受体提出了另一种可能性，可能还有另外的特异性聚糖-受体相互作用。髓磷脂相关糖蛋白（myelin-associatedglycoprotein）就是这样一种受体，它在稳定髓磷脂中有着重要作用。第28页，共52页，2023年，2月20日，星期三将糖鞘脂的多样性与其在神经系统中的丰富含最结合起来，表明糖鞘脂具有作为特异识别标志的潜在能力，这些标志可以在神经系统细胞间很多识别过程中扮演关键角色。某些选择性染色神经元特定种群的抗糖脂表位的抗体，应与这些细胞和它们近邻细胞的相互作用（例如在轴突导向过程中的作用）相符。邻近细胞或胞外基质中的凝集素能够与这些末端结构中的某些结构结合。第29页，共52页，2023年，2月20日，星期三但是，已知受体的数目与糖脂上发现的聚糖数目并不相同，所以糖脂标志和受体不大可能一对一地互相对应。与不同糖脂头部基团可能介导不同功能的观点相比，另一极端观点认为，在不具备不同功能的个体聚糖情况下，糖缀合物的类别，例如神经节苷脂，对神经系统正确地发挥作用极为重要。第30页，共52页，2023年，2月20日，星期三小结缺乏特异糖脂亚组小鼠的出现，并对其表型详细研究后，答案可能是两个极端观点的折中：某些特异的糖脂介导特定的识别事件，但很多情况下，所有各类糖脂具有重叠和重复的功能。第31页，共52页，2023年，2月20日，星期三除决定膜的全部物理性质和介导识别事件外，糖脂还可以调节特定膜蛋白的性能。例如，神经节苷脂GM3可以调节表皮生长因子受体（epidermalgrowthfactorreceptor）的活性。凭借受体多肽跨膜部分横向结合，这种糖脂可以抑制受体的激活，并且进一步抑制受体的二聚化反应。调控膜受体的二聚化，也可能导致受体分割成脂筏，与其余的膜相比脂筏有较高的黏度。

第32页，共52页，2023年，2月20日，星期三6、糖脂的分解缺陷引发疾病与对糖脂在生理作用上的有限了解相比，我们对糖脂分子参与几种病理过程了解得比较清楚。糖脂作为细菌毒素受体的功能可作为这些分子在识别过程如何起作用的模型。一个家族重要的遗传性疾病与糖脂的分解途径缺陷有关。高水平的糖脂生物合成正常情况常伴有糖脂在溶酶体内的高速度周转，糖脂被输送到溶酶体并在溶酶体内被特异的水解酶分解。基因损伤引发的这种水解酶的缺失或活性降低能够阻塞分解途径和导致溶酶体中未消化脂的积聚。第33页，共52页，2023年，2月20日，星期三与泰-萨二氏病（Tay-Sachsdisease）相关的致命的神经病并发症就是因为编码β-己糖胺酶A基因的突变使神经节苷脂GM2充满溶酶体引发的。一种降解葡糖脑酰胺的β-葡萄糖脑苷脂酶的基因突变是引发高歇病（Gaucher‘sdisease）的病因。由于糖基脑酰胺在巨噬细胞中的积聚，这种病的症状表现为肝、脾肿大和骨骼畸形。应用酶置换疗法很多患者可以被成功治愈。制造一个β-葡萄糖脑苷脂酶的重组形式，其聚糖末端为甘露糖残基，通过巨噬细胞甘露糖受体的摄入，可以使该酶靶向巨噬细胞溶酶体。第34页，共52页，2023年，2月20日，星期三七、有些蛋白质通过糖脂锚与膜结合

将蛋白质以共价结合脂肪酸和脂质的方式锚定在膜上，是以疏水性氨基酸序列锚定方法之外的另一重要方式。大量脂连接膜蛋白都是通过糖脂与质膜细胞的外表面结合。与糖鞘脂不同，这些糖脂都是以二酰甘油（diacylglycerol）为基础的疏水性结构。结合蛋白质的糖脂常称作糖基磷脂酞肌醇锚[glycosylphosphophatidylinositol（GPI）anchor]。第35页，共52页，2023年，2月20日，星期三不同生物中GPI锚（GYIanchor）的结构也不同，但它们具有一些共同的特征（图）。蛋白质和脂质桥连的聚糖连接在葡糖胺(GlcN)糖苷键结合的脂质肌醇（inositol）头部基团的6位上。这是少数实例之一。所有已知的脂质锚都拥有含三个甘露糖残基的核心。在第三个甘露糖残基上以磷酸二醋键连接一个乙醇胺（ethanolamine）分子，暴露的游离氨基与蛋白质的C-末端氨基酸的羧基形成酰胺键。第36页，共52页，2023年，2月20日，星期三GPI锚结构共有部分用黑色表示，种间变化用加框粗黑体表示第37页，共52页，2023年，2月20日，星期三对基本的GPI锚可进行各种修饰。各种GPI锚之间存在的差异包括：与甘油部分结合的脂肪酸尾部的长短不同、与第一个甘露糖残基结合的第二个磷酸乙醇胺残基存在与否，以及与肌醇环直接酯化的棕桐酸酯是否存在等。最初对GPI锚的认定是通过用磷脂酶C（phospholipaseC）处理，以这种方式与膜连接的许多蛋白质都能被释放出来。但是，因为与肌醇环酯化的棕榈酸酯抑制这一断裂反应，磷脂酶C的灵敏度还不能用来作为诊断试验测定蛋白质是否通过CPI锚与膜结合。第38页，共52页，2023年，2月20日，星期三GPI锚结构的另一可变性根源是聚糖上添加的精细末端结构。这类延伸的末端结构可以是连接第一个甘露糖残基的单个GalNAc残基，或者是半乳糖残基的簇聚分支。这样，聚糖的整体组织与复合型N-连接寡糖一样，其内部核心结构是由GlcN（Ac）、甘露糖和含有暴露在外部的半乳糖和GalNAc分支结构组成。第39页，共52页，2023年，2月20日，星期三八、糖脂锚在内质网内添加到蛋白质上糖脂锚与蛋白质的结合与N-连接糖的结合相类似，因为糖脂锚在转移到蛋白质之前就预先组装成一个单元。与N-连接糖基化中多帖醇脂核心结构一样，核心肌醇脂的组建产生于拓扑学上两个不同的步骤(图)。第40页，共52页，2023年，2月20日，星期三GPI锚生物合成和结合蛋白质的途径锚的合成起始于内质网膜的胞质内侧，完成于腔内；蛋白质由N-末端信号序列异向腔内，此序列以共翻译方式切除，暴露新的N末端残基(N’)；翻译结束，通过疏水性C-末端氨基酸序列蛋白质仍然连结在膜上；以蛋白酶解方法断开连接的序列，同时将新的C-末端氨基酸（C'）直接转移到糖脂锚的乙醇胺部分。

第41页，共52页，2023年，2月20日，星期三GlcNAc残基的添加、N-乙酰基的去除，以及在有些情况下肌醇环与棕榈酸的进一步结合都发生在内质网膜的胞质表面。而后，这一结构转移到膜腔的内侧，并在该处添加甘露糖和磷酸乙醇胺。作为甘露糖残基供体的是多萜醇磷酸甘露糖。磷酸乙醇胺的供体是常见的与脂双层胞质小叶相关的磷脂酰乙醇胺磷脂。第42页，共52页，2023年，2月20日，星期三

结合糖脂锚的蛋白质最初的合成与I型跨膜蛋白相同。这种蛋白质是由断开的N-末端信号序列导向内质网，并且是通过C-末端、疏水的中断转移序列启动时就锚定在膜上。在多肌链断开，糖脂锚乙醇胺的氨基形成酰胺键协同一致的情况下，形成糖脂锚的连接。这一转酰胺基反应（transamidation）不需要输人额外的能量。预定要用转酰胺酶加上的蛋白质C-末端序列，主要由非极性氨基酸组成，便于实现它们对膜的锚定功能。虽然没有相关连接糖脂锚的特异序列模体，但是，断裂后的C-末端氨基酸和越过断裂位点的残基，一般都有小分子侧链。紧随这些蛋白质前体形式上C-末端膜锚其后的不是亲水性胞质结构域。第43页，共52页，2023年，2月20日，星期三在哺乳动物和非哺乳动物结合蛋白质中发现的最终固定锚，虽然在组织结构上类似，但组装锚的生物合成途径有很大区别。例如，在锥虫寄生物肌醇环的1位上，酰基取代基的添加是在第一个甘露糖添加到GlcN残基之后，但在哺乳动物中，甘露糖的添加则是在这之前。同样，在转移到蛋白质之前发生在组装锚上的脂链重塑只在寄生物细胞中发生，没有在哺乳动物细胞中出现。这一反应过程包括从锚上磷脂酰肌醇部分阶段性地去除脂肪酸长链和用肉豆蔻酸置换。这些差别，以及生物合成途径中酶底物特异性的一些微妙差异，通过将这些反应步骤导向寄生物唯一的途径，为锥虫生命周期中治疗性介入创造了条件。第44页，共52页，2023年，2月20日，星期三GPI锚结构第45页，共52页，2023年，2月20日，星期三九、连接糖脂锚的蛋白质定位于质膜对所有通过GPI锚与质膜结合的蛋白质还没有共同的论述主题。动物细胞中有各种蛋白质与糖脂锚结