细胞免疫检测技术

（优选）细胞免疫检测技术现在是1页\一共有34页\编辑于星期日细胞免疫Cell-mediatedimmunityisanimmuneresponsethatdoesnotinvolveantibodiesbutratherinvolvestheactivationofphagocytes,naturalkillercells(NK),antigen-specificcytotoxicT-lymphocytes,andthereleaseofvariouscytokinesinresponsetoanantigen.细胞免疫（cellularimmunity）T细胞受到抗原刺激后，增殖、分化、转化为致敏T细胞(也叫效应T细胞)，当相同抗原再次进入机体的细胞中时，致敏T细胞（效应T细胞）对抗原的直接杀伤作用及致敏T细胞所释放的细胞因子的协同杀伤作用，统称为细胞免疫。现在是2页\一共有34页\编辑于星期日现在是3页\一共有34页\编辑于星期日检测对象免疫细胞数量（E玫瑰花环形成实验，流式细胞术）T细胞亚群（间接免疫荧光法，流式细胞术,免疫磁珠）细胞因子检测技术（ELISA，定量PCR,Elispot）免疫细胞活性(淋巴细胞转化实验)现在是4页\一共有34页\编辑于星期日应用范围1、测定患病个体的细胞免疫状态与水平，以分析其发病机制；2、测定动物疫苗免疫或抗原注射后机体的细胞免疫反应3、筛选免疫增强剂或免疫抑制剂药物，或研究化学药物、营养成分以及物理疗法对机体免疫功能的影响4、在研制细胞因子制剂过程中，测定其活性及效价现在是5页\一共有34页\编辑于星期日T细胞表面受体一、T细胞抗原受体二、细胞因子受体三、绵羊红细胞受体四、有丝分裂原受体现在是6页\一共有34页\编辑于星期日T细胞亚群辅助/诱导T淋巴细胞（CD3+CD4+）、抑制/细胞毒T淋巴细胞（CD3+CD8+）、CD4+T细胞纯真亚群（CD4+CD45RA+/CD4+CD45RA+62L+）和记忆亚群（CD4+CD45RA-/CD4+CD45RO+）、功能亚群（CD28+）、激活亚群（CD38+、HLA-DR+）、凋亡亚群（CD95+）现在是7页\一共有34页\编辑于星期日1.E玫瑰花环形成试验erythocyterosettetest实验原理：人和动物外周血中T细胞表面有红细胞受体（即CD2分子），在体外能直接和异种或同种动物红细胞（SRBC）结合形成玫瑰花样细胞团，以此来区分T、B。TTBSRBCCD2检测技术现在是8页\一共有34页\编辑于星期日左:（甲紫染色，800×）：可见2个被绵羊红细胞包围而形成玫瑰环的T淋巴细胞；右:（吖啶橙染色）：图中可见3个染成橙黄色荧光的T淋巴细胞被绵羊红细胞所包围。现在是9页\一共有34页\编辑于星期日B细胞没有红细胞受体，但有免疫球蛋白Fc受体和补体C3受体，故可用抗红细胞抗体（A）或者补体（C）搭桥，形成EA玫瑰花环实验和EAC玫瑰花环实验。现在是10页\一共有34页\编辑于星期日2.流式细胞术定义：流式细胞术(Flow

Cytometry,

FCM)是七十年代发展起来的高科学技术,它集计算机技术、激光技术、流体力学、细胞化学、细胞免疫学于一体,

同时具有分析和分选细胞功能。它不仅可测量细胞大小、内部颗粒的性状,还可检测细胞表面和细胞浆抗原、细胞内DNA、RNA含量等,可对群体细胞在单细胞水平上进行分析,

在短时间内检测分析大量细胞,并收集、储存和处理数据,进行多参数定量分析;

能够分类收集(分选)某一亚群细胞,分选纯度＞95%。在血液学、免疫学、肿瘤学、药物学、分子生物学等学科广泛应用。一种细胞分选或分析技术。即以荧光素标记抗体结合相应细胞，用激光束激发单行流动的细胞，根据细胞所携带荧光(强度或类别)进行分选或分析。检测技术现在是11页\一共有34页\编辑于星期日现在是12页\一共有34页\编辑于星期日将待测细胞染色后制成单细胞悬液。用一定压力将待测样品压入流动室，不含细胞的磷酸缓冲液在高压下从鞘液管喷出，鞘液管入口方向与待测样品流成一定角度，这样，鞘液就能够包绕着样品高速流动，组成一个圆形的流束，待测细胞在鞘液的包被下单行排列，依次通过检测区域。现在是13页\一共有34页\编辑于星期日流式细胞术---T细胞亚群具有CD3抗原的T细胞：外周血成熟的T细胞具有CD4抗原的T细胞：TH（机体免疫应答的启动细胞，促进T细胞、B细胞免疫应答，活化的TH细胞可释放IL-2及IFN-r）具有CD8抗原的T细胞：Tc（在TH辅助下特异性杀伤或溶解靶细胞）现在是14页\一共有34页\编辑于星期日现在是15页\一共有34页\编辑于星期日3.间接免疫荧光法检测淋巴细胞CD抗原免疫荧光技术就是将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体（或抗原）上，与其相应的抗原（或抗体）结合后，在荧光显微镜下呈现一种特异性荧光反应。检测技术现在是16页\一共有34页\编辑于星期日4.免疫磁珠分离法

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免疫磁珠分离法：将针对细胞某种表面标记的特异性抗体包被在磁性微珠上，与磁珠交联的抗体能够特异性结合具有这种表面标记的细胞，然后用强磁场可将具有这种表面标记的细胞分离出来。磁珠(microbead)标记细胞上的磁珠在扫描电镜下也几乎看不到检测技术现在是17页\一共有34页\编辑于星期日磁珠分离策略：一.阳性分选磁珠标记目的细胞未标记细胞先行流出移出磁场后收集目的细胞CD4+T细胞分离柱CD4-T细胞现在是18页\一共有34页\编辑于星期日磁珠标记非目的细胞目的细胞先行流出二.阴性分选现在是19页\一共有34页\编辑于星期日5.固相酶联免疫斑点技术ELISPOT细胞受到刺激后局部产生细胞因子，此细胞因子被特异单克隆抗体捕获。细胞分解后，被捕获的细胞因子与生物素标记的二抗结合，其后再与碱性磷酸酶标记的亲和素结合。BCIP/NBT底物孵育后，PVDF孔板出现“紫色”的斑点表明细胞产生了细胞因子，通过ELISPOT酶联斑点分析系统对斑点的分析后得出结果.检测技术现在是20页\一共有34页\编辑于星期日与ELISA的区别

1、ELISA通过显色反应，在酶标仪上测定吸光度，与标准曲线比较得出定量的可溶性蛋白总量。2、ELISPOT通过显色反应，在细胞分泌这种可溶性蛋白的相应位置上显现清晰可辨的斑点，可直接在显微镜下人工计数斑点或通过ELISPOT分析系统对斑点进行计数，1个斑点代表1个活性细胞，从而计算出分泌该蛋白或者细胞因子的细胞的频率3、由于是单细胞水平检测，ELISPOT比ELISA和有限稀释法等更灵敏，能从20万-30万细胞中检出1个分泌该蛋白的细胞。4、捕获抗体不会影响活化细胞分泌细胞因子。现在是21页\一共有34页\编辑于星期日图注：ELISPOT法在检测低频率产生细胞因子的细胞时具有独一无二的敏感性。将指定数目的能产生IFN-的T细胞与一百万个抗原呈现细胞（AntigenPresentingCells，APC）混合后，使用ELISPOT法（上图）、胞质内染法（中图）和ELISA法（下图）分别测量产生IFN-的细胞的数目。现在是22页\一共有34页\编辑于星期日现在是23页\一共有34页\编辑于星期日

6.T淋巴细胞转化实验T细胞、B细胞表面具有识别抗原的受体和有丝分裂原受体，在特异性抗原刺激下可使相应淋巴细胞克隆发生增殖。检测技术现在是24页\一共有34页\编辑于星期日植物血凝素（PHA）、刀豆蛋白A（ConA），抗CD2、抗CD3McAb作为多克隆刺激剂可选择性地刺激T细胞增殖；抗IgM、含葡萄球菌A蛋白的菌体（SAC）、脂多糖（LPS，对小鼠有作用）则刺激B细胞发生增殖；美洲商陆（PWM）、肿瘤刺激剂PMA对T、B细胞的增殖均有刺激作用。现在是25页\一共有34页\编辑于星期日淋巴细胞转化试验方法形态计数法MTT法同位素掺入法现在是26页\一共有34页\编辑于星期日形态计数法加分裂原共同培养后，观察形态学变化，计算转化为母细胞的百分数细胞体积增大，代谢旺盛，蛋白和核酸合成增加,即向淋巴母细胞转化。现在是27页\一共有34页\编辑于星期日MTT法MTT法即四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法。MTT是一种噻唑盐，化学名3-（4，5-二甲基-2-噻唑）-2，5-二苯基溴化四唑，水溶液为黄橙色。细胞受到ConA作用后发生增殖活化，其胞内线粒体琥珀酸脱氢酶活性相应升高，MTT作为其底物参与反应，形成蓝色的甲臜（Formazan）颗粒沉积于细胞内或细胞周围，经溶剂溶解后为蓝色溶液，可用酶标测定仪测定细胞培养物的OD值，测定波长570nm。根据OD值的大小计算反应体系中细胞增殖程度。

现在是28页\一共有34页\编辑于星期日同位素法3H-TdR掺入法：细胞增殖的基本条件或前提为细胞质和细胞核的复制，这是正常细胞增殖过程缺一不可的前提。3H-TdR即（甲基-3H）胸腺嘧啶核苷，是DNA合成的前体。加入细胞培养液中后被细胞摄取作为DNA合成的原料。细胞合成的DNA越多，则所掺入的3H-TdR就越多，因此，检测所掺入的3H-TdR就可反映细胞增殖的程度。因该方法有同位素污染问题，故我们实习中仍用MTT法。

现在是29页\一共有34页\编辑于星期日同位素法优势3H-TdR=增殖细胞数；MTT=总细胞数。所以前者更能反映细胞增殖指数。例，培养10个细胞，3天后A组为17个，B组为13个，此为MTT的结果；3H-TdR的结果则为7：3，A组细胞的增殖是B组的2.3倍。现在是30页\一共有34页\编辑于星期日实验步骤1、鸡脾淋巴细胞悬液制备淋巴细胞的分离用1640培养液配成106细胞/ml现在是31页\一共有34页\编辑于星期日2、淋巴细胞增殖反应将脾细胞悬液加入到96孔培养板中，200μL/孔，每一份脾细胞悬液分装6个孔，3孔加ConA（5ug/mL），另3个孔不加ConA作为对照。置5%CO2，37℃培养72h，培养结束前6h，每孔加入3H-TdR20μL，使其终浓度为（3.7-18.5）×104Bq/mL。用多头细胞收集器将细胞取集于玻璃纤维滤纸上。滤纸片充分干燥后置测量瓶中，加入7mL闪烁液，用液闪仪测定每分钟脉冲数（cpm）。3、数据处理及结果判定以每分钟脉冲数（cpm）表示增殖程度，用刺激指数（SI）来表示

实验孔cpm

SI=

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对照孔cpm受试样品组的SI值显著高于对照组的SI值，即可判定该项实验结果阳