2008基于银硅纳米阵列上腺嘌呤和胞嘧啶的表面增强散射

AthesissubmittedtoZhengzhouUniversityforthedegreeofMasterSERSDetectionofAdenineandCytosinebyPatternedSilverStructureImmersion tedonSiliconNanoporousPillarArrayBy:GuoYanSupervisor:Prof.LiXinjianCondensedMatterPhysicsSchoolofPhysicalScienceandMay,拉曼光谱属于分子振动光谱。它能够提供分子特有的‖信息，因而应用于生物分子探测，和化学分析等领域。但是，由于常规拉曼光谱信号太弱，严重限制了其广泛应用。采用表面增强拉曼散射（Src-nadaanSaernSS）SES技术应用中，活性基底的选择和非常关键。本文采用浸渍沉积法，利用硅纳米孔柱阵列（S-N）的表面还原性，了具有规则结构的银硅纳米孔柱阵列（AS-N，并以AS-NA作为SES活性基底对生物分子腺嘌呤和胞嘧啶的SES光谱进行了对SERS活性基底Ag/Si-NPA表面形貌和结构进行表征，通过不同浸10-4M腺嘌呤溶液为探测目标，确定了活性基底实现腺嘌呤SERS最大增强的浸渍时间。SERS光谱的振动峰进行了归属和分析，确定了腺嘌呤分子以N7位垂直吸附于活性基底表面的结论。通过探测不同浓度腺嘌呤溶液的SERS的表面选择定则提出了腺嘌呤分子在研究了腺嘌呤分子在活性基底Ag/Si-NPA上不同吸附位的SERS增强活性，结果表明硅柱顶部表面银颗粒的SERS活性增强较大。N3位垂直吸附。通过对比研究不同浓度胞嘧：表面增强拉曼散射（SERS，Ag/Si-NPA，腺嘌呤，胞嘧啶TheRamanspectrumbelongstothemolecularvibrationspectrum,providestheuniquengprnt‖informationofmolecular,andmayapplyinthefieldsofbiologicalinctionysis,diseasediagnosis,yticalchemistryandsoon.However,thenormalRamansignalisextremelyweakwhichlimitsitsapplicationsseriously.TheRamansignalscanbeefficientlyenhancedbySurface-enhancedRamanscattering(SERS),whichhasbeenwidelyusedinmanyfields.IntheapplicationofSERS,theselectionandpreparationoftheactivesubstrateisveryimportant.Inthisarticle,theSERSsubstrateAg/Si-NPAisfabricatedbyimmersiontingbasedonsiliconnanoporouspillararray(Si-NPA)whichhasregularstructure.Basedonthispreparedsubstrate,theRamanspectroscopyofadenineandcytosinewereobtainedandysed.ThestructurecharacteroftheSERSsubstrateAg/Si-NPAwasobservedandseveralsubstrates,theSERSspectrumofadeninewiththeconcentrationof10-4Mwereobtainedandyzed,andwefoundthebestdepositiontimeoftheactivesubstratewas3min.TheSERSspectrumwasyzedanditcouldbeinferredthattheadeninemoleculeswereverticallyadsorbedonthesurfaceofthesubstrateAg/Si-NPAthoughN7.TheSERSspectrumofadeninewereobtainedinlowconcentrationfrom10-5to10-9Manditwasfoundthattheadeninewasdetectedwiththelimitingconcentrationof10-9M.Throughyzingthetransformationofvibratingpeaks,wefoundtheintensityofthepeak733cm-1whichcharacteristictheringbreathevibration, weakergraduallywiththedecreaseoftheadenineconcentration.Whentheconcentrationofadeninewas10-8M,thepeak733cm-1disappeared.AccordingtotheSERSsurfaceselectionrule,thestateofadeninemoleculeabsorbedonthesubstrateAg/Si-NPAwaschanged.Withthedecreaseoftheconcentration,theadenine eparalleltothesurfaceofthesubstratefromthestateoftheThenwestudiedwheretheadeninemoleculeadsorbedonthesubstratewhentheSERSsignalisbest,andtheresultindicatedwhentheadenineabsorbedonthetopofthesiliconcolumn,theSERSsignalisperfect.ThecytosineSERSspectrumhasbeenobtainedontheSERSactivesubstrateofAg/Si-NPAandsimplyyzeditsvibrationpeaks.Theresult,whichisinaccordwiththeliturereport,isthecytosinemoleculeabsorbedverticallywithN3onthesurfaceoftheactivesubstrate.TheSERSspectrumsofcytosinewithdifferentconcentrationalsobeenobtainedandyzed,andtheresultisthestateofcytosinemoleculeabsorbedonthesubstrateAg/Si-NPAdidnotchangedwiththedecreaseofcytosineconcentration.Keyword:surface-enhancedRamanscattering(SERS);activesubstrateAg/Si-NPA;adenine;cytosine摘 第一章绪 1.1散射与表面增强散射 1.1.1散 表面增强散 SERS与常规散射的比 电磁场增强机 SERS的电荷转移化学增 第二章Ag/Si-NPA的浸渍法与优 引 浸渍法活性基底Ag/Si- 水热法Si- 浸渍法Ag/Si- 表征分析方 Si-NPA和Ag/Si-NPA表面形貌表 活性基底Ag/Si-NPA的最佳浸渍时 腺嘌呤振动峰的指 不同浸渍时间腺嘌呤光谱 本章小 第三章腺嘌呤的吸附状态与吸附位研 引 腺嘌呤的低浓度探 腺嘌呤SERS光谱振动模的指 腺嘌呤振动峰的分 不同浓度腺嘌呤的SERS光谱与吸附状态研 腺嘌呤的SERS光 不同浓度腺嘌呤的SERS光 不同浓度腺嘌呤分子的吸附状 腺嘌呤在活性基底Ag/Si- 硅柱不同部位面积统计 腺嘌呤在活性基底Ag/Si-NPA上的吸附 本章小 第四章胞嘧啶的检测及吸附状态研 胞嘧啶探测样品的...............................................................................活性基底Ag/Si-NPA上胞嘧啶SERS光谱研 胞嘧啶吸附状态研 本章小 第五章总结与展 总 展 参考文 附 期间完成学 致 第一章1.1散射与表面增强散射1.1.1散可将其分为弹性散射和非弹性散射。散射属于非弹性散射，而瑞利散射则属于弹性散射。1928年，科学家以水银灯照射有机物苯等液体时发现在入射光频率ωi的两边出现对称的频率为ωi-ω和ωi+ω的散射谱带，这一现象被称为散射。其中小于入射光频率的谱带ωi-ω称为斯托克斯谱带，而大于从量子能级考虑，反斯托克斯散射和斯托克斯散射来源于入射光分子被激发到虚态。虚态上的粒子较短，能量比分子的电子能级低，因而10ω在一个分子中，不同的化学键或基团有不同的振动能级，ħω反映了振动能级的001‖110

反1.1子）有自己的特征光谱。因此光谱可作为表征物质的。每种物质的频率位移（即入射频率与散射频率之差）与入射频率无关。散射具有瞬时性，即入射光时，散射在10-11~10-12s后。散射光谱和红外吸收光谱，都是研究振动光谱的重要，是两种互（活性）有活性而不具有红外活性的材料可以通过光谱测量研究；而具有红外活性而不具有活性的材料则可以通过红外光谱测量研究。另外还有一些材料既具有光谱活性和又具有红外吸收活性，则这进。表面增强散度低，空间分辨率受衍射极限的限制。在散射光中，散射光强度大约是入射光的10-3，而散射强度只有散射强度的10-3～10-6。这对于研究分子1.2SERS1974年，英国科学家Fleisann等首次发现表面增强效应[1]。他们在溶液中观察到吸附在粗糙银表面的吡啶分子具有强的散射。这是表面增强散射（SERS）的首个实验。Fleisann等将增强的原因归于粗糙们不认为散射的增强是由于金属表面散射粒子数的增加造成的，而是吡啶分子吸附在银表面引起吡啶分子散射截面大大增加的结果[4-5]。图1.2是他们给出的SERS增强过程示意图。SERS效应是当分子吸附或者接近某种纳米材料的表面时发生的。因此，SERS效应的基底[4-10]Cu，Ag，Au上吸附分子增强102～104范围，相对较弱。SERS与常规散射的比根据已有的理论研究结果[8]，常规散射的强度为I1(vs)NI1(vl) 其中，N是常规 散射中入射激光激发照射到的分子数，f是自由分子的散射截面。说明散射强度和散射分子的数目、入射光强度、自由分子的 散射的f很小，每个分子的散射截面仅为～10-30cm2,比荧光的散射截面（～10-16cm2）小约14个数量级，常规1.3（a）108图1.3（a）常规 I(v)N'I(v)A(v)2A(v2SERS lsaNSERSA(vA(v) 场和散射场下的增强因子，a是吸附分子数的增强截面，即化学增强截面。图1.3(b)是表面增强散射示意图。图中用作SERS增强的金属系统，尽管SERS中参与散射的粒子数N'比常规散射涉及的散射分子数N少得多，但是由于吸附的增强截面a能够达到～200A(v)2A(v)2项的贡献得到的单分子 增强因子可达1014～1015，所 表面增强散射比常规散射的检测灵敏度高很多[11-12]SERS的增强机RamanP的平方，其中PE，为分子的极化率张量，E是入射电场强度。根据这个基本关系，可推知Raman散射电磁场增强机S附分子，则入射场、散射场平行于入射面的PS光子不能和表面模相耦合；但当表面存在吸附分子时，二者间的耦合将不等于零。引(Lightingrodeffect)[16]:在把金属表面粗糙化处理的过程中(Imagefieldeffect)[17]：当吸附分子吸附于金属表面时，他SERS信号起到增强作用，这种效应叫作镜像场效应。电偶极矩P可以表示为：P（E 的分量。镜像电场的大小与电偶极子到表面的距离r的大小有关，即 εε0分别是金属和介质的介电常数。将式（1.4）带入式（1.3） ef其 [1(4r3)1()/(0ef0Re[(4r31P 最大值。只有当r非常小时，Re[(004r31，effr0.165nm时,银表面的镜像场增强可高106r0.2nm102左右。由此可见，镜像场理论的作用距离很短。一般观点认为，它对SERS增强效应的贡献应很小[17]（3表面等离子体(Surfacesmaresonance,SPR)[18,19]:当入射光照射在粗糙金属表面上时，金属表面受到激发产生等离子体，使表面电场强度大大增加，从而导致表面吸附分子的散射信号增强。表面等离子体所产生的电场强度随着离开表面的距离而呈指数降低，其作用范围10-100Å，因此该机理属于长程效应。实验证明，除贵金属Au，Ag，Cu以及碱金属等自由电子金属在可见激光激发下能产生表面等离子外，其他材料均不能产生SERS的电荷转移化学增对所有吸附于金属表面上的分子应有相同的信号增强贡献。然而对散射截面几乎相同的CON2吸附分子，在相同的实验条件下增强因子相差达~200，SERS强度差别的。（2）在与化SERS效应，只有吸附于基底表面某些被称为活性点的分子，才能观察到强的SERSSERSSERS效应，只有覆盖度达到一定程度才能观达到一定程度，吡啶分子通过其N原子上的孤对电子化学吸附于基底表面。另被吸附官能团的增强效应最为强烈，也证明了SERS与化学吸附有关。1.4激发下，金属表面光激发电子之间的电子与化学吸附分子发生相互作用。1.4EF表示费米能级，EV表示真空能级，L是未占据分子轨道，H是占据分子轨道。过程（b）表示电子由吸附分子的某一已占中产生的能量差相等时，便会产生，从而增大体系的有效极化率，使SERS信号[5,22,23]SERS（3）在电化学体系中，吸附分子的SERS信号强度与电位有关，可以表示成电SERS强度会出现极大值，而且此时的电位与激发光SERS增强的化学模型，如增原子模型[24,25]和活附在此位置的分子强烈地作用，增大分子的散射截面，进而增强散射SERS信号。SERS当探测分子吸附于光滑的金属表面附近时，一束光以入射角照射在金属干叠加。同样，在某一方向上，分子的散射光也是由两部分光场相干叠加得到，这两个光场分别是直接由分子散射到该方向上的光场和散射到金属表面后又被金属反射到该方向上的光场[28]。散射光的强度可以根据入射光和

(1r)(1r') (1r)(1r')cos(1

)(1r')sin

p [yy(1p

)cos

)sin](1r')cos

p [zy(1rp)coszz(1rp)sin](1r')sinpp (1r)(1r')cos'(1r)(1r')sin2 （'）得到的菲涅耳系数，而rs,p是由入射光的频率和方向得到的菲涅耳系数Ip,s是指正比于由入射光P方向偏振分量激发的S方向偏振的散射光的光不同不可约表示，其中只有那些对应极化率张量是非量的模式具有拉曼活性。一般来说，属于不同不可约表示的简正振动模式所对应极化率的非零2v点群的分子吸附在金属基底表面，并使分子的21xyz2y1z；B2代表极化率yz。显然，振动模式对应的振动随其所对应的极化率分以及入射光的波长和方向的变化而被增强、减弱、甚至，并且方程pHp0H0E0中系数的大小也是由这三个参数来决定的。从方程pHp0H0E0中也可看出，属于对称模式的A1模只对 没有贡献。更严格地说，一个给定 光强会随 1和 1两项的大 1而变强或变弱，而从系数的表达式中可以很容易推测出这两项的大小表 1coscos(sin)

cos(sin

)

rp

2 2cos(sin

rp趋近于+1，rs趋近于-1波长越接近红外波段，这个极限就越近。因此当光波足够长时，由于入射光有对应2I A2、B1B2的振动，而只能观察到对应的极化率包含zzA1模式的振动。而且在SERS光谱和常规光谱比较中A1模振动的相对强度会有很大变化，因为只有zzSERSA1振动模有贡献，而常规光xx,yy,zzA1振动模都有贡献。有些晶体的极化率张量分量可以从晶体的光谱中得到，但是并不是所部分晶体极化率张量分量的论著。因此，要找出极化率xx,yy,zz的每一个具体的值并不是很容易就能做到。对于具有对称性xx的分子，它的zz的比值可以从气相退偏

cos/(1cos/(1sin2/)1/cos/(1sin2/)1/rs

cos(1/sin2/2)1/，rpcos(1/sin2/2)1/ 很明显，当

方向分量被加强，而P方向分量被大大消弱，即与金属表面平行方向的电场分量被加强，由1/的极大值可以推出金属表面集体等离子体 振动模对应的极化率分量xx,yy和xy为非零时，那么当满足表面等离子体条件时，便会观察到该模式的振动得到很大增强。对大多数金属而言，满足表面等离子体的波长位于紫外。能产生较强的光强分量 的频率，是金属Au、Ag和Cu表面产生等离子体现象时的频率，而这个频率刚好也是散射的频率。计算表明，即使分子是通过物理吸附于光滑的金属表面，其SERS光谱也仍然会包含三类谱线：一类是对应极化率zz的，一类是对应极化率xx,yy和xy的，还有一类是对应极化率xz和yz验中，一般可增强到106-10。SERS中发挥的作用，将其简单看作是分子吸附于金属胶体球形颗粒表面的情z轴的光入射到金属胶体颗粒表面，其势能函数V为：V（r,）E0(rgR3r2cos g(0)(20，R为金属胶体颗粒的半径。用常规的方法计算电场的径向和切向分量，在rR处（球体表面处，这两个分量的模的平方对整个E221g2 E212g 激发场与xx,yy和xy类振动模和xz和yz类似，因此，上述三类振动模的SERS激发光谱强度如下2类振动模：E2E'212g212g

EE

1

n t

1 1g1 22

2

'

'22,和 类振动模：E2E'241g21g 2 常用的SERS光谱分析方SERS光谱中振动峰的强弱变化可推出吸附分子在基底表面的几何形态、取向及吸附本质和基底特性，以下为SERS将SERS光谱同常规光谱对比，看SERS光谱中是否有新的与基底有2、推测分子吸附取向[30-子体发生相互作用，使粗糙表面的局域电场增大，进而增强 散射强度振动模有关的分子极化率垂直于表面，则这些振动模的光谱将得到显著增结构的分子而言，它在金属表面取向情况可以从C-H伸缩振动谱线的强弱来推知。当分子平躺在金属表面时，C-H伸缩振动由xx,yy和xy分量决定，强度高的C-H伸缩振动的SERS峰。较其对应的SERS光谱和常规光谱，可以推测出分子吸附时可能的结构变化。例如，苯并三唑（Benzotriazole）的常规光谱中表示N-H面内弯曲振4、推测分子某个官能团与基底表面的相对距离[33-谱的峰位相对于常规光谱的峰位没有移动时，主要是物理吸附；而当分子离金属较近，同一振动的SERS谱的峰位相对于光谱有一定移动时，主要吸附性较强，另一个吸附性较弱，后者只有者共存时才能给出其SERS信SERSSERS能提供分子特有的结构信息，具有较高的探测灵敏度，在生物医学础物质，研究他们的结构和构象问题对探索生命奥秘具有重要意义。SERS技时还能比较各相中的结构变异。近年来，将SERS技术应用于生物医学的研究越来越多。CottonSERS光谱[38]，SERS技术4D-氨基葡萄糖配合物与DNA的相互作用及其抗癌活性。Vo-DinhCulha等基于罗丹B标记的琉基化寡聚DNA链体系，开发了一种SERS探针[39]。Yi等人利用Si纳米线阵列直接对DNASERS技术的应用已经解决了生物物理、生物化学和分子生物等方面的许的吸附状态。SERS在生命科学中的应用主要归结于以下几个方面：生物标记检测。抗体、蛋白质、DNA等生物分子的标记方法种类很多，如分子标记，酶标记，同位素标记等方法的发展已经相当成熟。近年Mirkin等采用修饰有标记物的寡核苷酸链包覆金纳米颗粒子与表面增强拉太小，不能引起电磁增强，检测不到信号，用银粒子增强后可检测到标记物的信号，且具有很好的重复性。如图1.4是标记的纳米颗粒对图1.4标记的纳米颗粒对蛋白质的检生物传感。SERS技术开辟了金属基底的s-BLM膜在生物传感器发展子体生物传感。Al2O3溶胶聚合体葡萄糖生物传感器是采用SERS技术SES技术独特的探测优点，现已被广泛应用于生物分子的探测研究，探测的种类很多并且还在不断地拓展，o-Dinh[42]等首次将表面增强散射探针应用到A分子检测中，并对BCA1和抗凋亡X标DNA链互补的寡核苷酸链固定在具有表面增强散射效果的基底上，然后与分子或其他散射截面较大的分子标记的DNA链互补杂交，将信号分子固定在基底表面，然后检测其信号，由于这种方法契合度很好，即使仅有一个到，，细菌[47]SES技术还可应用于抗癌药物和药物-A相互作用的研究，Sequari[48]等了采用SES技术研究A与铂配合物的相互作用。SERS技术不仅能提供独特的分子振动信息，而且具有单分子水平的检测SERS本身独特信息，而且具有免标记分析单个生物分子的潜力[49-50]。Graham小组在SERS探测的基础上发展了一种表面增强散射（SERRS率与激光频率一致；二、能够吸附在粗糙银表面。这种方法由于其两次效体病变组织，半病变组织和正常健康组织细胞状态不同，反映在分析的SERS光谱上都会有变化，可以预见，SERS技术必将在各类疾病和的早期第二章Ag/Si-NPA的浸渍法与优SERS活性基底的在SERS技术的研究和和应用中起着关键的作用。目和采用各种沉积技术的金属纳米结构[57-59]。金属胶体具有方法简单，的活性基底越来越受到人们关注，特别是具有规则表面形貌和结构特征的种新方法。这种方法不但过程简单，而且有效避免基底过程中因添加还原剂而可能对SERS产生的噪音影响。然而，多孔硅这种海绵相连形成准连续的纳米颗粒膜，从而在一定程度上限制了增强效果的进一步提高。本实验所选用的活性基底是在多孔硅的基础上具有的规则结构层次的纳米结构银/硅纳米阵列（Ag/Si-NPA）浸渍法活性基底Ag/Si-硅纳米阵列（SiliconNanoporousPillarArray,Si-NPA）是一种新的具有的硅纳米单晶颗粒。Si-NPA既具有传统多孔硅的物理特性和纳米多孔结构特征，又具有多孔硅不具备的规则层次，是高灵敏度SERS活性基底的理想衬底。本实验就是以Si-NPA为活性基底，采用浸渍沉积技术SERS活性基Ag/Si-NPA，并对其进行表征和优化。水热法Si-0.015Ωm（111）以一定比例配置的溶液中分三步进行，晾干。而后放入水热釜中，腐蚀液3分钟。最后从水热釜中取出硅片，放入去离子水中反复后在空气中风干即可。对于SERS技术，只有金、银、铜是最好的活性金属。活性基底g/Si-NA及测试样品的过程如下：第一步，衬底。将新的衬底i-NA气入后用掉i-NAi-NPAi-NASi-NA0.01ol/LAgN3溶液的烧杯中浸渍。刚放入时可以轻度晃荡烧杯一方面去除浸渍过程中衬底表面产生的气泡，同时使浸渍液与-NA充分接触反应，以补偿与-NA接触处局部的AgN出。目的是除去活性基底Ag/Si-NPA表面可能存在的杂质。再用去离子水后晾干。最后将样品放入用探测物配置的溶液中浸泡约30分钟，让被探测分子与Ag/Si-NPA上的活性位点充分接触吸附后，用去离子水反复晾干，等待测试其SERS光谱。活性基底的形貌特征通过JEOL公司生产的型号为JSM-6700F的扫描电子SERS增强与金属颗粒大小间关系及SERS活性位点的分布。测试SERS光谱所用仪器是Renishaw公司生产的RenishawRM2000显微拉10s,532nmNd-YAG激光器，光束半径约1μm，入射到样品上的激光功率约0.3nw。SERS活性基底都存在活性均一性问题，以至于很难实现对基底增强能力确切而合理的评价。本文中，建立一种新的数据处理与分析方SERS谱做整体评价。实际中，由于活性基底的微观不均匀SERS活性都灵敏有效。如果探测位刚好是具有活性的位点，信号会得到很大增强，光谱中的各个峰都明显显现，分离性也很好；但如果探测是没有活性的位点，信号会很弱。另外杂质分子也给造成很大影响。因此在本文中介绍有关这种峰强无可比性，我们对所有的光谱进行了归一化处理，以方便谱线相对强Si-NPAAg/Si-NPA表面形貌表构和形貌与反应釜中HF酸和Fe3+的浓度和比例以及反应时间有很大关系，像离，如图2.1中的（c）显现的是一种常见的火山口结构，与（a）相比只是柱（c,()Ag的形貌结构还会受到衬底Si-NPA形貌特性的影响，整体上Ag覆盖在衬底Si-NPA表面形成规则的阵列。同时，由于Si-NPA的柱顶到柱底及柱间低谷区SEM2.2b可以看出，沉积的银颗粒层覆盖在衬底Si-NPA上，或亚微米级的银颗粒，其平均粒径达600纳米以上，并且亚微米级银颗粒穿插到柱顶弥散分布着纳米级的银颗粒，粒径逐渐减小，粒径从约100nm变化到40nm.2.2a看，亚微米级银颗粒形成的环相互连接组成网络结构，这种aa图 Ag/Si-NPA的SEM图及单个阵列放大SERS谱中来自活性基底Ag/Si-NPASERS谱造成干扰Ag/Si-NPA活性基底进行SERS探测时，会在1359cm-11563cm-1处发现两个归属于非晶碳的SERS光谱的频移和强度有一定影响，会引起金属颗粒的团聚产生热点。Miao[61]等SERS光谱产生频移。Lin[62]等用体积比为1：1的水溶液配成1mM的HCl溶液浸泡活性基底数Ag/Si-NPA基底，这种处理并不[60]发现KCl溶液能实现对基底Ag/Si-NPAKClAg/Si-NPA0.1MKCl溶液进活性基底Ag/Si-NPASERS增强效果与构成基底的金属颗粒的形貌特征有密切联系，如金属颗粒的形状、间距、粒径及排列方式等都会直接影响SERS活性基底的探测能力。对于Ag/Si-NPA活性基底，Ag在Si-NPA表面沉积的形貌特征受很多因素影响，浸渍液浓度、浸渍时间、衬底Si-NPA的老化时间等因素对Ag/Si-NPA形貌结构的调控已在其它文献中介绍过[60]。本文仅从活性基底Ag/Si-NPA对腺嘌呤的SERS增强效果上确定其最佳浸渍时间。也不是活性基底上的每个探测分子都有探测活性。因为基底上分布着活―热点‖，探测位的SERS 实验采用老化一天衬底Si-NPAAgNO30.01M，探测物Ag/Si-NPA。SERS0.1MKCL20分钟，以SERS测试时可能引起的杂质

Ramanshift(cm-图2.3（a）腺嘌呤粉末的光谱,实际强度放大10倍；(b)以Ag/Si-NPA为活性基底探测10-4M腺嘌呤获得的光谱一般物质的光谱较弱，如图2.3（a）是将腺嘌呤粉末的光谱强度腺嘌呤溶液获得的SERS光谱。可以看出，采用活性基底的探测强度比常规光谱强度高出十几个数量级，从峰位上看，活性基底会影响到探测分子的光谱，但是振动峰的数目基本没有发生变化。整体上看，以Ag/Si-NPA为活性基底，SERS探测不但能力强，光谱信噪比高，而且光谱分离性较好。会引起信号强度和峰位的变化。图2.3（b）中腺嘌呤SERS光谱特征峰文献[69~70]吻合。与常规光谱相比，SERS效应可以极大地增强强不同浸渍时间腺嘌呤光谱10-4M3.0min,5.0min,6.0min9.0min,共5个样品。对结果归一化后进行比较。主要介绍了水热法衬底Si-NPA，浸渍沉积法SERS活性基底所需要的表征分析方法。由于基底表面银颗粒的形貌直接影响SERS效应的增强，为了从腺嘌呤SERS光谱上获得银颗粒的最优浸渍时间，首先以腺嘌呤粉末光谱作为对比，我们对基于活性基底Ag/Si-NPA上的腺嘌呤SERS谱中的振动峰进行指认，而后不同浸渍时间获得的活性基底Ag/Si-NPA，探测SERSAg/Si-NPA的最第三章腺嘌呤的吸附状态与吸附位研究性及变化规律。此外，检测技术还具有在液体环境中不受水的干扰，在任域的优势所在。在生化分析研究领域，基于散射原理分析的SERS效应检白质[65-67]、、细胞和细菌[68]等。DNA作为遗传信息的载体控制着生物体的或细胞内DNA的检测，可以找到治疗和预防疾病（如、心脏病和等）的新途径。碱基是DNA的基本组成单元脱氧核糖核苷酸的成分，控谱研究为采用SERS技术进行DNA，从分子水平上了解遗传、代谢、分化及等生命过程奠定了基础。腺嘌呤是组成DNA的四种碱基之一，它的吸258nm,532nm，因此以腺嘌呤作腺嘌呤SERS我们按第二章所述活性基底Ag/Si-NPA，浸渍时间为3分钟，并对其10-4M3.210-4M腺嘌呤溶液的样品上任意一探测点的SERS光谱归一化后的结果。可以看出，以Ag/Si-NPA为活性基底对腺嘌呤探测具有高的信噪比和光谱分离性，且腺嘌呤733cm-11323cm-1。结合文献中采用银胶、银电极、银岛状膜做活性基底时对腺嘌呤振动模式归属的判断，制得表3.1并据此对以Ag/Si-NPASERS3.1是腺嘌连接而成，六元环的C6位携带一碱基。3.1IntensityIntensity Ramanshift(cm-表3.1Ag/Si-C6-NH2N9-H摇摆振动NH2六元环变形振动（N1-C6-C2-N3-C2-H，N9H（C4-C5-C6扭动，N3-C4-摇摆N1-C6-N10（C5-N7-六元环变形振动（C4-C5-C6摆）C8-H摇摆振六元环变形振动（N1-C2-五元环（C5-N7伸缩五元环变形振动（N7-C8-C2-H摇摆NH2摆C8-N9伸缩N9-H，C8-HC8-H，N9H弯曲振动，N7-C2-N3，N1-C2，C5-C6，C5-C5-N7，N1-C2伸缩振动，C2-C8-H弯曲C2-H，N9-H弯曲振动，C8-C4-N9，C4-C5，C6-N10，N7-C2-N3，N1-C6伸缩振动，C2-N7-C8伸缩振动，C8-H弯曲N3-C4，N1-C6，C5-N7，N7-伸缩振动，N9-H弯曲由表3.1可以得出，以Ag/Si-NPA为活性基底探测10-4M腺嘌呤获得的SERS733cm-1,1177cm-1(C8-H，N10-H11弯弯曲振动)与自然光谱相比均发生较大的频移。已有研究表明采用不同的活如当以电极和岛膜为活性基底时，SERS光谱中表征六元环变形振动从SERS的增强机理中得到解释。SERS增强的主要原因。电磁增强不需要金属基底与伸缩）的振动峰是因为不同活性基底的电磁增强能力不同引起的，同时也化。如上述SERS光谱中有些振动峰与自然光谱相比发生较大的频移，和以溶胶和Ag/Si-NPA894cm-1918cm-1，这子不同吸附状态，SERS光谱中各个增强机制所占增强不同。3.1中，腺嘌呤浓度为10-4M时，SERS光谱中增强最大的谱带是表征分子环呼吸离金属面较近。而由SERS光谱中位于1400cm-1（C4-N9,C4-C5,C6-N10,N7-C8，1461摆动)1596cm-1(NH2剪切振动)都是面内振动，那么推得腺嘌呤分子的另一个吸附点可能是碱基NH2。当腺嘌呤浓度为10-4M时，腺嘌呤分子在活性基底SERS光谱中1273cm-1（C2-N3，N1-C2C5-C6C5-N7伸缩振动）和1662图3.3浓度为10-4M不同浓度腺嘌呤的SERSAg/Si-NPA作为活性基底对若丹明6G（R6G）SRES光谱探测灵敏度非常腺嘌呤的SERS对于采用沉积技术的活性基底来说，其表面必然存在细微差异（位错，是探测分子的振动峰，因此可以在同一样品上测试多个位置，而后将SERS底的整体评价，也避免了因探测任意性造成对的错误判断。这种分析方 -图3.4同一样品上任意六个检测点对应的腺嘌呤SERS图3.4是用浸渍时间为3分钟时的Ag/Si-N探测104M腺嘌呤的样品上任意选取的六个检测点的SE光谱图。可以看出即使是同一样品不同点得到的RR1,99.07cm1,130.9cm1Intensity Intensity 不同浓度腺嘌呤的SERS按2.2节方法一个Ag/Si-NPA活性基底样品并进行预处理后分成大小一样的五小块，然后分别浸渍浓度为10-5M，10-6M，10-7M，10-8M，10-9Mcm-1，1575cm-1和1610cm-1的相对强度。但是表征腺嘌呤分子环呼吸振动的733cm-1峰的强度随浓度的降低而减小，当浓度减小为10-8M时，733cm-1峰完全的733cm-1的说明腺嘌呤分子已经由垂直吸附变为平行吸附。而其他峰相对强度变强也是因为腺嘌呤分子平行吸附于基底时，腺嘌呤分子结构环上的位点与金属基底接近，从而引起SERS增强中的电磁机制作用增大，使得SERS谱中其他峰强度增大[17] 图3.6活性基底Ag/Si-NPA不同浓度腺嘌呤获得的SERS光谱：a浓度为10-5M，b10-6M，c浓度为10-7M，d浓度为10-8M，e浓度为10-不同浓度腺嘌呤分子的吸附状状态变化并不是突然的，可理解为当腺嘌呤浓度较高(如10-4M)时绝大多数腺嘌面以某个角度吸附于活性基底表面，当浓度降低为10-8时，腺嘌呤分子完全平行吸附于基底表面。这可以从活性基底表面活性热点数与溶液中腺嘌呤分子数AS-N上存在的SES活性热点腺嘌呤浓度较高时，单位体积的溶液中腺嘌呤分子的个数很多，但是分子结构中各个吸附位点的吸附能力不同，腺嘌呤分子结构中的N7位吸附能力较强，这热点几乎全被各个吸附分子的吸附能力较强的位点占据，此时吸附分子以该位点垂直吸附于基底表面。点占据后还有多余的―热点‖被探测分子上吸附能力次强的位点占据，这时吸子由原来以某个位点的垂直吸附变为以某几个位点为吸附位点平行吸附于活性热点空出来供子吸附能力更弱的位点吸附，直到吸附分子上每一个吸附位完全吸附于基底表面，此时吸附分子平行吸附于基底表面，如图3.7为腺嘌呤分子以不同方式吸附于活性基底AgS-N的示意图。这个结论和Rb研究4,4’-联吡啶在银表面的吸附取向与浓度间关系的结论相似[73]。4,4联吡啶在银电极上的SS谱中表示环呼吸振动的峰也是随浓度的降低强度增强变小，而其他面外振动峰强度有所增加。腺嘌呤在活性基底Ag/Si-NPA上吸附位的研在进行SERS探测实验中，经常会有这样的现象，有时探测点得不到探测物的SE谱，有时测得SE谱强弱不同。这主要是不同探测位SERS增强能力不同造成的，由于衬底i-N规则的表面结构层次和不同部位的不同氧化程度，使得硅柱不同部位银颗粒的大小和形状不同，直接影响到探测分子的SE光谱活性热点分布和基底增强机理具有重要意义。对腺嘌呤在活性基/与柱底连着的灰白域构成柱壁，中间黑域属于柱顶。为方便计算，将硅.为中间黑域的圆面积，柱底和柱壁的面积是两个圆环面积。图3.8活性基底Ag/Si-NPA的SEM图，图中黑色的箭头线表示计算硅柱时选取的四个方向上D3，平均后其大小分别为D1=（12+9+9.5+11）/4=10.375cm D3=（5+6+4.5+4.5+6.5）/4=5.5cm进而算出三个圆环的半径 R1=D1/2=5.1875 R2=D2/2=4.6875S1=(R1*R1-R2*R2)*л/2=2.46875л表3.2图3.8acbacbdd图3.9与图3.8同一块基底上的另四个位子的SEM3-3-3-3-3-腺嘌呤在活性基底Ag/Si-NPA上的吸附探测分子腺嘌呤与活性基底Ag/Si-NPA间不是简单的物理接触，而是以化测物之后用去离子水反复的事实得到证实。在SERS探测中如果得到腺嘌呤SERS光谱说明该探测点吸附有腺嘌呤分子，该处SERS活性，光谱中峰的相对强弱说SERS增强能力不同；如果没有腺嘌SERS光谱，则说明该处不SERS活性。SERS增强能力不同是由SERS增强的两种机制造成的，活性吸附反映了化学增强机制，SERS谱强弱明显变化则主要是由电磁品）上选取117个探测点记录其SERS光谱（附录І）根据其光谱增强能力不同可点被检测到的机率相同，考虑到光谱仪的激光斑点半径只有1μm，我们可表3.4三类不同增强能力的SERS结合上一章研究的方法和最优浸渍时间活性基底Ag/Si-N，并SERS光谱中的各个振动膜进行归属，通过分析光谱中峰强和峰位推测出腺嘌呤分子是以7位垂直吸附于活性基底S光谱中峰位和峰形的变化，进而得到腺嘌呤分子吸附状态随溶液浓度降低由垂直吸附变为平行吸附于活性基底表面，这也表A最后研究了吸附于活性基底不同部位的腺嘌呤分子的SES增强能力。第四章胞嘧啶的检测及吸附状态研究胞嘧啶(cytosine)作为具有遗能生物分子DNA的另一种碱基,在DNA啶光谱的理论计算，胞嘧啶和金属相互作用，胞嘧啶光谱及振动模式金属胶体表面以及金属薄膜表面[81-83]的光谱研究。对于胞嘧啶振动谱的量子化学计算也有相关[79,80,84-88]。这些研究主要是探讨胞嘧啶分子的振动谱4.1为胞嘧4.1胞嘧啶分子结构示意N3C=O键垂直吸附于铜电极表面N3键与铜电极作用；但是随着电位负移，在较小负电位下,胞嘧啶分子则主要以氨基（NH2）吸附在铜电极表面。此时,N3键与铜电极间作用减弱,氨基与铜电极间的作用则增强很多。吴元菲[89]等人认为N3位垂直吸附于粗糙银和金电极表面。胡凤霞等人[90]认为胞C2=O[91]等人分别用四种方法：激光烧蚀法、电化学氧化还原循环粗糙法、磁控SERS光谱，认为胞嘧啶在这几种银纳米活性基底表面的吸附方式是一致的，主要通过羧基和N3位垂直吸附于纳米银颗粒表面。鉴于银/硅纳米阵列有很强的探测能力，而目前用于胞嘧啶的探测还没有相关研究，本节的工作就是在用这种新型基底来探测不同浓度胞嘧啶的SERS效应，并分析了胞嘧啶在这种新型基底上的吸附方式。渍30分钟，取出后用去离子水反复冲洗晾干。活性基底Ag/Si-NPA上胞嘧啶SERS光谱研胞嘧啶SERS光谱分410-2M胞嘧啶溶液的SERS795cm-1，C=OC-C伸缩振动，这些都是面内振动。根据选择定则，离表面近且化学键可能垂直吸附在金属颗粒银的表面。归属于CO1191cm-1561cm-1[92]说明胞嘧啶分子结构（4.1）N1N3位离金属颗粒银表面较近，结合文献知道，胞嘧啶与金属基底最有利的成键位是N3位[93].66 -Ramanshift 文献[60]中已经过以Ag/Si-NPA为活性基底探测腺嘌呤和R6G具有很单分子呼吸效应。以Ag/Si-NPA为活性基底探测胞嘧啶SERS光谱时，光谱重现性研究非常关键。为此我们设计了以下SERS探测，以浓度为10-4M胞嘧啶溶液探测样品，在同一块探测样品上任意选取三个点获得其SERS光谱，然后探测另外两块相同条件下的探测样品的SERS光谱。如图4.3，A、B、C是同一样品上不同点获得的胞嘧啶SERS光谱，D、E是不同样品上得到的胞SERS光谱。五条胞嘧啶SERS795cm-1，1307cm-1，1626cm-1A，B，C的比较说明，即使是同一样品，不同点的SERS增强能力也不同，这主要是因为探测分子吸附在活性D，ESERS探测能力有差异，这是由活性基底的差异引起的，如硅片表面损伤，实验过程中的偶然操作等复杂因素。总体来说以Ag/Si-NPA为SERS活性基底探测胞 Ramanshift（cm- 点的，D、E为另一个用相同条件的基底的探测结果SERS光谱中 Raman -b:10-3M,c:10-4M,d:10-5M,e:10-6M/嘌呤溶液超低溶度的探测，探测极限达到10M，并且腺嘌呤分子在活性基底/234561三个谱峰都相对较强，他们都属于面内振动，分别归属于胞嘧啶分子环呼吸振/第五章总结与展SERS技术能够极大地增强了信号，灵敏地提供分子结构振动方面信活性基底研究构成的两种碱基分子的SERS探测，为进一步探测DNA，发本文主要研究分析了以Ag/Si-NPA为活性基底探测生物分子腺嘌呤和胞嘧啶获得的SERS光谱。围绕此课题，我们主要研究了以下几个方面：讨论了SERS活性基底Ag/Si-NPA的过程，并对其进行了表面形貌表征。研究了以不同浸渍时间的Ag/Si-NPA为活性基底，10-4M腺嘌呤溶液SERSSERS光谱最大增强的活性基底最优浸渍时间为3min。对以Ag/Si-NPA为活性基底探测10-4M腺嘌呤获得SERS光谱中各个振动模进行指认，并根据谱线中每个振动峰的增强变化，Ag/Si-NPAN7位为吸附位点垂直吸SS增强活性整SS谱的探测中，这种方法非常有效。因为在超低浓度下，SS并且此时杂质分子的光谱振动峰对结果分析影响也很大，而将同一样品上测得的所有数据相加归一化后分析，就减小了杂质振动峰造成误差。采用这种分析gS-NASS光谱，从峰强及峰位变化中，得出了腺嘌呤分子在活性基底表面的吸附状态发生变化，而平躺SS解释。通过对腺嘌呤在AgS-NASERS光谱变化但是各个振动峰相对强度变化不明吸附状态没有发生变化，都是以N3位垂直吸附于活性基底表面。总之，本课题以Ag/Si-NPA为活性基底获得了灵敏度高、重现性好的腺嘌SERS光谱。通过对光谱分析，获得腺嘌呤分子和胞嘧啶分子结构方面的信息。活性基底Ag/Si-NPA的工艺简单，增强能力强，稳定性好，是实现SERS技术广泛应用的理想活性基底。SERS检测方法在生物医学和诊断学研究领域具有很好的应用前景，尽管绝大多数研究还局限于基础和研究阶段，但是目前也已经开始有一些利SERS对这些领域的探索和尝试，如检测疾病相关蛋白，体内检测肿瘤等。本实验通过浸渍沉积技术的Ag/Si-NPA继承了衬底Si-NPA独特的层次结SERSSERS研究和应用的基本要求，在生物分子探测和等领域存在巨大应用潜力。本课DNA碱基——SERS光谱发明了一种新的SERS活性基底，并为其应用于探测，进而发展为生物检测器迈开了参考M.Fleisann,P.J.endra,A.McQuillan.Ramanspectraofpyridineadsorbedatasilverelectrode[J].ChemicalPhysicsLetters,1974,26(2),163-166.D.J.nmaire,R.P.VanDuyne.SurfaceRamanspectroelectrochemistryPartI.Heterocyclic,aromatic,andaliphaticaminesadsorbedontheanodizedsilverelectrode[J].JournalofElectroChem,1977,84(1),1-20.M.G.Albrecht,J.A.Creighton.AnomalouslyintenseRamanspectraofpyridineatasilverelectrode[J].JournaloftheAmericanChemicalSociety,1977,99(15),D.J.nmaire,R.P.VanDuyne[J].ElectroChem,1977,84,M.G..Albrecht,J.A.Creighton[J].AmChemSoc,1977,99,J.Solla-Gullon,R.Gomez,A.Aldaz,J.M.Perez.AcombinationofSERSandelectrochemistryinPtnanoparticleelectrocatalysis:Promotionofformicacidoxidationbyethylidyne[J].ElectrochemistryCommunications,2008,10,319-J.W.Zhang,T.C.He,C.S.Wang,X.Q.Zhang,Y.Zeng.Enhancementoftwo-photonabsorptionandphotoinducedbirefringenceinmethylorangebyAunanoparticles[J].Optics&LaserTechnology,2011,43,974-977.张明生.激光光谱学[M].：科学，2008.A.Kudelski,M.J.Czachor,M.Varga,M.Dolata,J.Bukowska,A.MolnaAr,A.Szummer.EffectofelectrochemicalpretreatmentonSERSandcatalyticactivityofCu-Zramorphousalloys[J].AppliedCatalysisA:General,1999,123-130.H.B.Hu,Z.H.Wang,S.F.Wang,F.W.Zhang,S.P.Zhao,S.Y.Zhu.ZnO/Agheterogeneousstructurenanoarrays:Photocatalyticsynthesisandusedassubstrateforsurface-enhancedRamanscatteringdetection[J].JournalofAlloysandCompounds,2011,509,2016-R.Sanc,M.Volkan.Surface-enhancedRamanscattering(SERS)studiesonsilvernanorodsubstrates[J].SensorsandActuatorsB,2009,139,150-155.K.Kneipp,Y.Wang,H.Kneipp,etal.SingleMoleculeDetectionUsingSurfaceEnhanceRamanScattering(SERS)[J].Phys.Rev.Lett.,1997,78(9),1667.S.Nie,S.R.Emory.ProbingSingleMoleculesandSingleNanoparticlesbySurface-EnhancedRamanScattering[J].Science,1997,275,1102.M.Moskovits.Surface-enhancedspectroscopy[J].Rev.Mod.Phys.1985,57,Y.Mo,I.Mrke,P.Watcher,TheInfluenceofSurfaceRoughnessontheRamanScatteringofPyridineonCopperandSilverSurfaces,SolidStateCommun[J].1984,50,829.S.Efrima,H.Metiu,ClassicalTheoryofLightScatteringbyaMoleculeLocatedNearaSolidSurface[J].Chem.Phys.Lett.,1978,60,59.Gersten,J.I.andNitzan,A.in:SurfaceEnhancedRamanScatteringChang,R.K.andFurtak,T.E.eds[M].PlenumPress,NewYork,1982,35.H.Reather.Surfacesmonsonsmoothandroughsurfacesandongratings[J].SpringerVerlag,Berlin,1988.A.Campion,P.Kambhampati.Surface-enhancedRamanscattering[J].Chem.Soc.Rev.,1998,27,241.A.Kudelski,J.Bukowska.TemporalEvolutionofRamanIntensitiesonSurface-EnhancedRamanScatteringActiveCopperandGoldElectrodesatNegativePotentials[J].Surf.Sci.,1996,368,369.Y.l.Chen,Y.Fang.SurfaceenhancedRamanscattering(SERS)activitystudiesofSi,Fe,Ti,AlandAgfi’preparedbymagnetronsputtering[J].SpectrochimicaActaPartA,2008,69,733-737.S.Berans,V.Yegnaraman,N.Sandhyarani,K.V.G.K.Murty,T.Pradeep,FormationofanickelhydroxidemonolayeronAuthroughaself-assembledmonolayerof5,5`-dithiobis(2-nitrobenzoicacid):voltammetric,SERSandXPSinvestigationsofthemodifiedelectrodes[J].JournalofElectroyticalChemistry,1999,468,170-179.J.R.Lombardi,R.L.Birke,L.A.Sanchez,I.Bernard,S.C.Sun,TheEffectofMolecularStructureonVoltageInducedShiftsofChargeTransferExcitationinSurfaceEnhancedRamanScattering[J].Chem.Phys.Lett.,1984,104,240.[24]A.Otto,Appl.Ramanscatteringfromsilver/vacuum[J].Surf.Sci,1980,6,R.Dornhaus,Surfaceenhancedramanspectroscopy[J].Adv.SolidStatePhys,1982,229,201.H.Ueba.TheoryofchargetransferexcitationinsurfaceenhancedRmanscattering[J].SurfaceScience,1983,131,347-366.B.Pettinger,M.R.Philpott,J.G.Gordon.FurtherobservationsofthesurfaceenhancedRamanspectrumofwateronsilverandcopperelectrodes[J]Surf.Sci.1981,105,469-474.张光莹，蓝国祥.晶格振动光谱学[M].：高等教育.H.Park,S.B.Lee,K.Kim,M.S.Kim,Surface-enhancedRamanscatteringofp-aminobenzoicacidatsilverelectrode[J].Phys.Chem,1990,94,7576-7580.Y.J.Kwon,S.B.Lee,K.Kim,M.S.Kim.Ramanspectroscopyof4-(methylthio)benzoicaciadsorbedonsilversurfaces[J].JournalofMolecularStructure,1994,318,25-35.Y.S.Li,Y.Wang,J.Cheng.Inctioneffectsonsurface-enhancedRamanscatteringactivitiesinsilversols[J].Vibrational.Spectroscopy,2001,27,65-74.J.DDris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