蛋白质类药物的分离纯课件

四.生物药物的制备3.蛋白质类药物的分离纯化方法生产过程上游构建（基因工程）发酵生产(发酵工程)纯化制备●来源：微生物细胞、动物细胞和植物细胞；●分离和纯化过程都必须在温和条件下进行。蛋白质的分离纯化蛋白质分子中存在游离氨基和羧基，具有两性解离性质。当蛋白质溶液处于某pH时，蛋白质分子解离成正、负离子的趋势相等，净电荷为零，此时溶液pH称为蛋白质的等电点pI。①两性解离与等电点利用蛋白质两性电离的性质，可通过电泳、离子交换层析、等电聚焦等技术分离蛋白质。蛋白质分子量很大，分子粒径为1～100nm，属亲水胶体在水中能形成稳定胶体溶液。蛋白质分子表面的水化膜和表面电荷是稳定亲水溶胶的两个重要因素。②蛋白质的胶体性质++蛋白质胶体颗粒的沉淀++++-------+-（沉淀）（疏水胶体）（疏水胶体）●沉淀过程中，蛋白质结构和性质都不发生变化，在适当条件下，可以重新溶解形成溶液。●是分离、纯化蛋白质的基本方法。如：等电点沉淀法、盐析法、有机溶剂沉淀法等。●去除变性因素后，恢复原有空间构象和生物活性。蛋白质的非变性沉淀核糖核酸酶可逆变性盐析电泳透析层析分子筛超速离心2）蛋白质的分离纯化方法定义：加入大量中性盐以破坏Pr的稳定因素并使从溶液中沉淀析出的现象。原理：破坏Pr两个稳定因素：水化膜和电荷层。中性盐：(NH4)2SO4；Na2SO4；NaCl等。优点：Pr不变性，常用。①盐析（Saltingout)定义：带电粒子在电场力作用下向着所带电荷相反方向泳动的现象叫电泳。原理：●Pr分子在溶液中可带净负电荷或净正电荷，可在电场中移动。●不同Pr分子携带电荷量不同，分子大小也不同，故在电场中泳动速度不同，可彼此分离。②

电泳（electrophoresis)●粒子泳动速度V与场强E、粒子电量Q成正比；●V与粒子半径r、溶液粘度η成反比；●V与粒子形状有关。非球形分子（如线状DNA）在电泳过程中受到更大的阻力。电泳过程示意图CH2=CHC=ONH2丙烯酰胺N,N’-甲叉双丙烯酰胺CH2=CHC=ONHCH2NHC=O

CH2=CH聚丙烯酰胺CH2-CHC=ONH2CH2-CHC=ONHCH2NHC=O

CH2-CHCH2¯

CHC=ONH2CH2-CHC=ONH2CH2-CHCH2-CHCH2-CHC=ONH2CH2-CHCH2-CH()n()n()m()m常规聚丙烯酰胺凝胶电泳主要特点凝胶由上、下两层凝胶组成上层——大孔径浓缩胶，浓度2～3％；下层——小孔径分离胶，浓度5～15％；缓冲液中主要阴离子——Gly-,Cl-；凝胶pH不同电极缓冲液——pH8.3的Tris-甘氨酸缓冲液；浓缩胶——pH6.8的Tris-HCl缓冲液；分离胶——pH8.9的Tris-HCl缓冲液；三种物理效应——样品浓缩效应，凝胶分子筛效应，电荷效应。

——分离效果好，分辨率高。板状电泳B.SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳电泳当电泳体系含有十二烷基硫酸钠（SDS）时,电泳迁移率的大小只取决于蛋白质的分子量，可直接由电泳迁移率计算蛋白质分子量。

测定蛋白质分子量当蛋白质分子量为17,000～165,000时，复合物电泳迁移率与蛋白质分子量的对数呈线性关系：lgMW=lgK－bm

MW——蛋白质分子量；m——相对迁移率；K——常数；b——斜率。将已知分子量的标准蛋白质在SDS-聚丙烯酰胺凝胶中的电泳迁移率对分子量的对数作图，即可得到一条标准曲线。测定未知分子量的蛋白质在相同条件下的电泳迁移率，根据标准曲线求得其分子量。测定蛋白质分子量SDSseparatesproteinsbyMW十二烷基硫酸钠③凝胶色谱

利用生物大分子的相对分子质量差异，进行层析/色谱分离的方法。凝胶层析介质主要是以葡聚糖、琼脂糖、聚丙烯酰胺等为原料，通过特殊工艺合成的层析介质。目前已成为生物化学、分子生物学和生物制药在研究和生产中必不可少的分离介质。

凝胶层析介质是惰性球状凝胶颗粒，内部为多孔网状结构，形成很多孔穴。凝胶层析原理

凝胶颗粒内部具有多孔网状结构，被分离的混合物流过层析柱时，比凝胶孔径大的分子不能进入凝胶孔内，在凝胶颗粒之间的空隙向下移动，并最先被洗脱出来；比网孔小的分子能不同程度的自由出入凝胶孔内外，在柱内经过的路程较长移动速度较慢，最后被洗脱出来。凝胶色谱分离洗脱体积凝胶色谱分离的应用生物大分子物质的分离纯化分子量的测定分级分离溶液浓缩平衡常数的测定细胞及颗粒的分离分子量的测定蛋白质通过凝胶柱的速度，即洗脱体积与其分子量有关:LogM=k1-k2Ve（Ve为洗脱体积）先测得几种标准蛋白质的Ve，并以其分子量对数对Ve作图得一直线，再测出待测样品的Ve，查标准曲线即可确定分子量。LogMABCLogM测V测定义:利用离子交换树脂作为支持物，将带有不同电荷的Pr进行分离的方法。分类:阳离子交换树脂,如羧甲基纤维素等，

阴离子交换树脂,如二乙基氨基乙基纤维素④离子交换色谱原理:带正电荷多的Pr与树脂结合较强，而带正电荷少的Pr与树脂结合则较弱。用不同浓度的阳离子洗脱液，如NaCl溶液进行梯度洗脱，通过Na+的离子交换作用，可以将带有不同正电荷的Pr进行分离。带正电荷多蛋白紧密结合带负电荷多蛋白流过层析柱阳离子交换树脂工作示意图离子交换色谱柱层析⑤亲和层析法琼脂糖凝胶连接臂蛋白质分子配体蛋白质蛋白质和配体复合物交联试剂载体配体载体与配体交联体杂质杂质游离配体亲和色谱亲和层析的特点纯化效率极高：亲和层析由于配体与待分离物质进行特异性结合，所以分离提纯的效率极高，提纯度可达几千倍。⑥透析法（Dialysis）定义：利用半透膜把大小分子分开的方法。Pr溶液置半透膜袋中，置流动溶剂（如蒸馏水）中，使小分子杂质（如无机盐、单