纳米SiO2颗粒协同IgE介导的肥大细胞活化加重过敏性炎症及二球悬铃木花粉过敏原profilin的研究

纳米SiO2颗粒协同IgE介导的肥大细胞活化加重过敏性炎症及二球悬铃木花粉过敏原profilin的研究纳米SiO2颗粒协同IgE介导的肥大细胞活化加重过敏性炎症及二球悬铃木花粉过敏原profilin的研究

摘要：

纳米材料是一种应用广泛的材料，其中纳米SiO2是最常见的一种。然而，纳米SiO2可能会对人体健康产生潜在的危害。在本研究中，我们探究了纳米SiO2颗粒对过敏性炎症的影响。实验结果显示，纳米SiO2颗粒能够协同IgE介导的肥大细胞活化，并进一步加重过敏性炎症病理过程。此外，我们还研究了某些植物花粉过敏原中的一种蛋白质profilin。我们发现，profilin能够与IgE结合，从而引发过敏反应。这一发现为花粉过敏的治疗提供了新的思路和方向。

关键词：纳米SiO2颗粒，肥大细胞，过敏性炎症，IgE，profilin，植物花粉过敏原

正文：

引言

近年来，随着纳米技术的飞速发展，越来越多的纳米材料被广泛应用于工业、医疗、农业等领域。纳米SiO2作为最常见的纳米材料之一，具有诸多优良的物理化学性质，如高比表面积、化学稳定性、催化剂活性等，因此被广泛应用于催化剂、涂料、化妆品、食品等领域。然而，伴随着纳米技术的飞速发展，越来越多的研究表明，纳米SiO2可能会对人体健康产生潜在的危害[1]。特别是，纳米SiO2能够诱导免疫细胞的活化和炎症反应，从而引发炎症相关疾病[2]。过敏性炎症是一种炎症性疾病，其病理特征包括组织肿胀、红肿、局部渗出、白细胞浸润等，并伴随着过敏反应[3]。其中，肥大细胞在过敏性炎症中扮演着重要的角色，它们能够通过分泌多种介质（如组织胺、蛋白酶、白介素等）来调节过敏反应的发生和发展[4]。然而，目前对纳米SiO2对肥大细胞的影响以及其如何影响过敏性炎症的机制还不清楚。

另外，植物花粉过敏症是一种普遍存在的免疫性疾病，其发病机制至今尚未完全阐明。花粉过敏原中含有多种蛋白质，其中profilin是一种重要的蛋白质，它在植物细胞中广泛存在，并具有高度保守性[5]。过敏原特异性IgE是一种针对特定抗原的免疫球蛋白，它能够触发过敏反应，导致花粉过敏症状的发生。虽然过敏原特异性IgE是花粉过敏的主要机制，但对于profilin如何作为过敏原进行免疫应答和引发过敏反应的机制尚不清楚。

因此，在本研究中，我们希望通过实验手段来探究一些关键问题，包括纳米SiO2颗粒是否能够协同IgE介导的肥大细胞活化并进一步加重过敏性炎症病理过程，以及profilin如何与IgE结合并引发过敏反应。

材料与方法

实验材料

纳米SiO2颗粒（100纳米）（Sigma-Aldrich，美国），兔IgE抗体（Abcam，英国），小鼠腹腔肥大细胞（RBL-2H3）（ATCC，美国），2,4-二硝基氯苯（DNCB）（Sigma-Aldrich，美国），正常大鼠血清（NRS）（Sigma-Aldrich，美国），二球悬铃木花粉粉末（Aladdin，中国），兔profilin抗体（Abcam，英国），HRP标记的免疫球蛋白（JacksonImmunoResearch，美国）等。

动物模型

使用6周龄雄性BALB/c小鼠（20-25g）作为实验动物，按照国家卫生部动物实验指南进行动物实验，并得到了德阳市中医院动物实验室的细心帮助。

实验方法

实验分为两部分：第一部分研究纳米SiO2颗粒协同IgE介导的肥大细胞活化并进一步加重过敏性炎症病理过程；第二部分研究profilin如何与IgE结合并引发过敏反应。

第一部分实验方法：

1.1肥大细胞培养

将RBL-2H3细胞接种至T25培养瓶中，培养至细胞密度达到80%时，用DPBS洗涤细胞，离心收集细胞，加入培养基中含有20%FBS、0.05mg/mL的DNFB及100U/mL的Pen/Stre的DMEM中细胞悬液，接种至96阱板，每阱2*10^4细胞，使其形成对数生长期。每个组设7个平行实验。

1.2.IgE介导的肥大细胞活化

将各组肥大细胞接种至96阱板中，培养至对数生长期，用DPBS洗涤细胞，加入含IgE的DMEM(5μg/mL)中孵育2h，洗涤细胞，并加入500μg/mL的OVA孵育60min，采用酶调用法测定每组肥大细胞中β-葡聚糖水平的变化。

1.3.纳米SiO2颗粒的处理

纳米SiO2颗粒分散于PBS中，按照不同浓度（0，2.5,5,10μg/mL）加入到IgE介导的肥大细胞中，孵育60min，洗涤细胞，并加入500μg/mL的OVA孵育60min。通过ELISA法测定每组肥大细胞中β-葡聚糖水平的变化。

1.4.小鼠模型处理

将BALB/c小鼠随机分为6组。组别如下：对照组（PBS），IgE组（IgE），纳米SiO2组（SiO2），IgE+OVA组（IgE+OVA），SiO2+OVA组（SiO2+OVA），IgE+SiO2+OVA组（IgE+SiO2+OVA）。各组小鼠依次经过以下处理：对照组注射PBS（100μL，q3d，i.p）；IgE组注射IgE（100μL，10μg/mL，q3d，i.p）；SiO2组注射SiO2（100μL，10μg/mL，q3d，i.p）；IgE+OVA组注射IgE（100μL，10μg/mL，q3d，i.p），14天后注射OVA（10mg/kg，q3d，i.p）；SiO2+OVA组注射SiO2（100μL，10μg/mL，q3d，i.p），14天后注射OVA（10mg/kg，q3d，i.p）；IgE+SiO2+OVA组注射IgE（100μL，10μg/mL，q3d，i.p）、SiO2（100μL，10μg/mL，q3d，i.p），14天后注射OVA（10mg/kg，q3d，i.p）。13d后，每组小鼠进行了β-葡聚糖的检测，再于14d后采集小鼠血样进行检测各组组织样品均固定、染色并脱水制片，通过荧光显微镜观察组织中的肥大细胞。

第二部分实验方法：

2.1profilin的表达与纯化

以植物为基础，表达序列中的profilin。提取大肠杆菌中的表达产品，然后通过双峰柱层析法来纯化profilin蛋白。最后通过SDS和Westernblot来检测纯化蛋白。

2.2.profilin与IgE的结合

通过ELISA法来检测IgE与profilin结合的情况。将不同浓度的profilin蛋白加入到沉淀后的IgE(10μg/mL)中，孵育60min，然后加入HRP标记的兔抗鼠IgG抗体，孵育60min，最后用TMB底物将结果可视化。

结果

第一部分实验结果：

实验结果表明，纳米SiO2颗粒能够协同IgE介导的肥大细胞活化，并进一步加重过敏性炎症病理过程。随着纳米SiO2颗粒浓度的升高，肥大细胞内β-葡聚糖的含量也相应升高。同时，IgE+SiO2+OVA组小鼠在组织中具有更多的肥大细胞聚集，其组织病理学表现更加明显，与对照组、IgE组、SiO2组、OVA组相比更为显著。这些结果表明纳米SiO2颗粒的存在可以增强IgE介导的过敏反应，并且通过促进β-葡聚糖内含物的释放来参与这一过程。

第二部分实验结果：

通过植物表达，我们成功地获得了profilin蛋白。利用双峰柱层析法可以将profilin从杂质中纯化出来，最终的SDS和Westernblot结果表明我们得到了高纯度的profilin。

在IgE与不同浓度的profilin蛋白反应后，ELISA结果显示IgE与profilin之间的联系呈现出一种剂量依赖性。随着profilin浓度的逐渐增加，IgE结合率呈现出明显的上升趋势。这些结果表明profilin蛋白与IgE之间可能存在特异性的相互作用第三部分实验结果：

在ROS测量实验中，我们发现添加纳米SiO2颗粒可以显著增加细胞内ROS水平，这一结果与过敏反应的发生有关。而添加profilin蛋白对ROS水平的影响较小。

对于细胞凋亡实验，结果显示纳米SiO2颗粒的存在可以显著促进细胞凋亡。而添加profilin蛋白并没有明显的影响。

通过背景去除法，我们进一步分析了纳米SiO2颗粒对细胞凋亡的影响。结果显示，纳米SiO2颗粒可以显著提高细胞凋亡的比率，说明纳米SiO2颗粒的存在可能会导致细胞凋亡的发生。

综合以上实验结果，我们认为纳米SiO2颗粒的存在可以加剧IgE介导的过敏反应，并且通过促进β-葡聚糖内含物的释放来参与这一过程。而profilin蛋白对过敏反应的促进作用相对较弱，可能与IgE的特异性相互作用密切相关。此外，纳米SiO2颗粒的存在可以显著促进细胞凋亡的发生，这一结果可能与过敏反应相关的细胞死亡过程有关。

总之，我们的实验结果为进一步研究纳米SiO2和过敏反应之间的关系提供了一定的理论基础。未来的研究可以进一步探索纳米SiO2颗粒与过敏反应之间的分子机制，并寻找可能的治疗策略，以减轻过敏反应引起的临床症状另一方面，纳米SiO2颗粒可能会导致细胞增殖的减缓。通过MTT法，我们测定了细胞增殖的速率。结果显示，添加纳米SiO2颗粒后，细胞增殖的速率明显降低。这可能与纳米SiO2颗粒引起的细胞损伤有关。

此外，我们也对纳米SiO2颗粒的生物毒性进行了评估。通过细胞膜完整性测定和细胞膜通透性测定，我们发现添加纳米SiO2颗粒后，细胞膜完整性受到影响并且细胞膜通透性增加，表明纳米SiO2颗粒可能会破坏细胞膜结构并导致细胞死亡。

综上所述，纳米SiO2颗粒可能会导致IgE介导的过敏反