工业发酵灭菌1

工业发酵灭菌1第1页/共36页知识目标

理解工业发酵常用灭菌方法的原理和适用范围

掌握工业发酵培养基和发酵设备灭菌工艺的选择掌握无菌空气制备的基本知识和典型工艺要求第2页/共36页一、热灭菌法1、火焰灭菌法直接在火焰上灼烧灭菌，如接种针和一些金属小工具、试管口、三角瓶口等灭菌采用这种方法，该方法简单有效，但局限性很大。第3页/共36页2、干热灭菌法进行干热灭菌时，微生物细胞发生氧化，微生物体内蛋白质变性和电解质浓缩引起中毒等作用，其中氧化作用导致微生物死亡是主要依据。由于微生物对干热的耐受力比对湿热强得多，故干热灭菌所需的温度要高，时间要长，一般160～170℃，1～1.5h。实际应用时，对一些要求保持干燥的实验器具和材料可以采用干热灭菌法。第4页/共36页湿热灭菌法利用饱和蒸汽进行灭菌的方法称为湿热灭菌法。其原理是借助于蒸汽释放的热能使微生物细胞中的蛋白质、酶和核酸分子内部的化学键，特别是氢键受到破坏，引起不可逆的变性，使微生物死亡。由于蒸汽有很强的穿透能力，湿热蒸汽存在潜热。蒸汽来源方便，价格低廉，灭菌效果可靠，是目前最为常用的灭菌方法。一般的湿热灭菌条件为121℃，30min。第5页/共36页湿热灭菌法煮沸灭菌法将要消毒的物品放入水中煮沸（100℃）15～20min，一般微生物的营养细胞都可以杀死，但不能杀死芽孢。巴氏消毒法法国微生物学家、化学家巴斯德首创的低温消毒法。加热到62℃，经过30分钟，以杀死不耐高温的物质中的微生物和病原体的消毒法。牛奶、啤酒、黄酒、酱油和醋等用此法消毒。第6页/共36页湿热灭菌法间歇灭菌法

反复几次的常压蒸汽灭菌，以达到杀死微生物营养体和芽孢的目的。操作步骤：100℃，30-60min；37℃，1d；同上重复三次…

适用于不宜高压灭菌的物质，如糖类明胶牛奶培养基。方法简单，但却麻烦；工作周期长。

第7页/共36页湿热灭菌法高压蒸汽灭菌法使用密闭的高压蒸汽灭菌锅，使灭菌锅内蒸汽不外溢，增加压力，由于压力的增高，温度也随之增高，从而提高杀菌力，缩短灭菌时间。最有效而广泛应用的灭菌方法实验室常用的是0.1MPa，121℃，15～30min第8页/共36页应用范围

培养基，水，发酵罐等其他不适合干热灭菌的物品。高压蒸汽灭菌法的注意事项：完全排除锅内冷空气灭菌完毕后要缓慢减压压力降为零后打开盖子第9页/共36页二、辐射灭菌法利用高能量的电磁辐射和微粒辐射来杀死微生物以紫外线最常用。紫外线对芽孢和营养细胞都能起作用，但细菌芽孢和霉菌孢子对紫外线的抵抗力强。紫外线的穿透力低，仅适用于表面灭菌和无菌室、培养间等空间的灭菌，且距照射物不超过1.2m；对固体物料灭菌不彻底，也不能用于液体物料的灭菌。第10页/共36页三、化学药品灭菌法某些化学药品与微生物发生反应（蛋白变性、酶失活、细胞通透性）而具有杀菌的作用。化学药剂适于生产车间环境的灭菌，接种操作前小型器具的灭菌等，不适用于培养基。化学药品的灭菌使用方法，根据灭菌对象的不同有浸泡、添加、擦拭、喷洒、气态熏蒸等。第11页/共36页⑴高锰酸钾

高锰酸钾溶液的灭菌作用是使蛋白质、氨基酸氧化，使微生物死亡，一般用0.1％～0.25％的溶液。⑵漂白粉

漂白粉的化学名称是次氯酸盐(次氯酸钠，NaOCl)，它是强氧化剂，也是廉价易得的灭菌剂。它的杀菌作用是次氯酸钠分解为次亚氯酸，后者不稳定，在水溶液中分解为新生态氧和氯，使细菌受强烈氧化作用而导致死亡，对杀死细菌和噬菌体均有效。第12页/共36页⑶75％酒精溶液

75％酒精溶液的杀菌作用在于使细胞脱水，引起蛋白质凝固变性。对营养细胞、病毒、霉菌孢子均有杀死作用，但对细菌的芽孢杀死作用较差。常用于皮肤和器具表面杀菌。⑷新洁尔灭新洁尔灭是表面活性剂类洁净消毒剂。它在水溶液中以阳离子形式与菌体表面结合，引起菌体外膜损伤和蛋白变性。10min能杀死营养细胞，但对细菌芽孢几乎没有杀灭作用。一般用于器具和生产环境的消毒，不能与合成洗涤剂合用，不能接触铝制品。第13页/共36页⑸甲醛

甲醛(HCHO)是强还原剂，它能与蛋白质的氨基结合，使蛋白质变性，对氨基和蛋白质的变性有较强活性，这是用甲醛作为灭菌剂的根据。使用时可以以2份37％甲醛溶液与1份KMnO4混合，或者将37％甲醛溶液直接加热，产生气态甲醛用于灭菌。甲醛灭菌的缺点是穿透力差。⑹过氧乙酸

过氧乙酸是强氧化剂，它是广谱、高效、速效的化学杀菌剂，对营养细胞、细菌芽孢、真菌孢子和病毒都有杀灭作用。第14页/共36页⑺戊二醛在酸性条件下，不具有杀死芽孢的能力，只有在碱性条件下，才具有杀死芽孢的能力，常用2％的溶液，常用于器具、仪器和工具等灭菌。⑻酚类苯酚毒性较大，易污染环境，且水溶性差，使应用受到限制，而酚类衍生物的使用，扩大了作为消毒剂的使用范围。第15页/共36页四、臭氧灭菌利用臭氧的氧化作用杀死微生物细胞。氧化分解葡萄糖所必需的酶，从而直接破坏其细胞膜，从而将细菌杀死。无污染消毒剂对细菌、霉菌等杀菌效果好安全，杀菌效果明显，安装灵活等特点用于洁净室、净化设备的消毒。第16页/共36页五、过滤除菌法利用过滤方法阻留微生物，也可达到除菌的目的，这就是过滤除菌法。此法仅适用于澄清液体和气体的除菌。工业上常用过滤法大量制备无菌空气，供好氧微生物培养过程使用。第17页/共36页第18页/共36页第二节培养基和发酵设备的湿热灭菌一、灭菌条件的选择选择的原则：达到灭菌的目的，同时使培养基成分破坏减至最小。1、灭菌温度和灭菌时间的选择

为什么选择高温快速灭菌？温度升高，反应速率升高，微生物死亡速率远大于营养成分的的破坏速率灭菌程度与灭菌时间的影响微生物的热死规律——对数残留定律第19页/共36页灭菌程度与灭菌时间的影响

微生物的热死规律——对数残留定律微生物受热死亡的主要原因是高热能使蛋白质变性，这种反应可认为是单分子反应，死亡速率可视为一级反应，即与残存的微生物数量成正比。第20页/共36页式中N－经时间t后残存的活菌浓度（个/L)，N0—开始灭菌时原有活菌浓度（个/L)；t－灭菌时间（s,min）K－灭菌速率常数或比死亡速率常数（s-1,min-1）它的大小与微生物的种类和加热温度有关。在同等温度下，其值小，微生物的耐热性强。从上式得出：t,N之间的关系为对数式中N/N0菌体存活率，而N0/N为灭菌度。t=（2.303/K）㏒(N0/N)第21页/共36页⒉影响培养基灭菌的因素⑴培养基成分

油脂、糖类；低质量分数(1％～2％)的NaCl溶液⑵pH值

pH值6.0～8.0，微生物最耐热；pH<6.0，氢离子易渗入微生物细胞内，从而改变细胞的生理反应促使其死亡⑶培养基中的颗粒⑷泡沫泡沫中的空气形成隔热层，使传热困难，热难穿透过去杀灭微生物第22页/共36页二、培养基的灭菌方法（1）分批灭菌分批灭菌是在每批培养基全部流入发酵罐后，就在罐内通入蒸汽加热至灭菌温度，维持一定时间，再冷却到接种温度。实罐灭菌时，发酵罐与培养基一起灭菌。不需要附属设备，操作简便，常用的灭菌方法加热和冷却时间较长，营养随时间降低，罐利用率低；不能采用高温快速灭菌工艺。第23页/共36页发酵罐溶积越大，加热冷却时间越长

T总=t1+t2+t3

式中t1、t2、t3分别为加热、维持、冷却所需要的时间其他灭菌设备一般采用蒸汽灭菌，如设备十分耐压，则可采用较高的温度，但必须注意设备内部的凹处及露出的小配管等蒸汽不能到达的部位。第24页/共36页（2）连续灭菌连续灭菌也叫连消，是指培养基在发酵罐外经过一套灭菌设备连续的加热灭菌，冷却后送入已灭菌的发酵罐内的灭菌工艺流程。其温度一般以126～132℃为宜，总蒸汽压力要求达到0.044～0.049MPa以上。优点营养成分破坏少；发酵罐非生产占用时间短，溶积利用率提高；蒸汽负荷均衡，锅炉利用率高，操作方便；适用于自动化控制，降低劳动强度。第25页/共36页缺点不适用于黏度大或固形物含量高的培养基的灭菌；增加了一套连续灭菌设备，增加了操作环节，增加了染菌的概率。按设备和工艺条件分（1）蒸汽直接加热（2）蒸汽间接加热第26页/共36页1、蒸汽直接加热连续灭菌系统定义：蒸汽通入培养基中，快速加热至杀菌温度，维持一段时间，后冷却至发酵温度的过程。分两种形式：（1）由连消塔、维持罐和冷却器组成●配料罐将培养基预热60-70℃，防止培养基在杀菌时料液与蒸汽温度相差过大而产生水汽撞击声。●连消塔使培养基迅速(20s)升温(126-132℃)。●维持罐：使培养基温度保持在灭菌温度下一段时间。2-7min.●冷却管：将培养基迅速冷却到40-50℃，输送到灭菌后的发酵罐内第27页/共36页连续灭菌流程培养基配料配料罐加热器维持罐冷却器无菌培养基第28页/共36页（2）喷射加热连续灭菌流程由喷射加热、维持罐和真空冷却器组成的连续灭菌系统。蒸汽直接喷入待灭菌的培养液，培养液急剧升温到预定的灭菌温度，培养基在该温度送入维持管维持一段时间后，通过一膨胀阀进入真空冷却器冷却。保证培养基先进先出，避免过热或者灭菌不彻底升温快、营养损失小随着蒸汽的冷凝使培养基稀释第29页/共36页第30页/共36页2、蒸汽间接加热连续灭菌系统蒸汽不直接与培养基接触，而是通过热交换器对培养基进行加热。热交换器有板式和螺旋板式两种螺旋板式交换器的特点：流道宽，流速快，可减少热交换器表面结垢现象。适用于含有固行悬浮物的培养基的灭菌。板式交换器的特点：适用于含有少量固行悬浮物的培养基的灭菌。第31页/共36页第32页/共36页温度随时间的变化第33页/共36页连续灭菌与分批灭菌的比较与选择分批灭菌优点：1.不需附加设备2.蒸汽利用率高3.节约劳动力

缺点1.培养基质量差2.罐的利用率低3.冷却水用量大连续灭菌优点：1.采用高温快速灭菌法2.可以把培养基按其性质分开灭菌3.有利于自动控