动物细胞大规模培养和专用课件

第二章动物细胞大规模培养和专用生物反应器为什么?动物细胞培养对生产生物工程产品,特别是功能蛋白质方面的优势:1)同源性,直接进行翻译后加工,蛋白质可直接折叠成正确的构象2)有利于产品的分离纯化市场需求:目前全世界蛋白治疗药物的迅速增长和市场需求已远远超过了现有生产能力。生产产品:动物细胞规模化生产重组蛋白和抗体的工艺选择可考虑使用当前较成熟的工业化支持技术平台，以缩短产品工艺研发的时间，加快工业化进程。当前被FDA批准的生物技术产品以及公开发表的生产工艺占有主流优势的是搅拌式生物反应器悬浮培养，工艺设计是流加或灌流培养。其大规模细胞培养生产所面临的挑战，是获得最大生产力的同时注重维持产品的质量；去除所有培养环境中外源因子的污染，更为精确有效的工艺控制手段，规模化培养中氧气的限定与溶解CO2浓度累积的控制等。一个特殊而前景无量的生物反应器:动物乳泉生物反应器一.贴壁培养概念:贴壁依赖性细胞在培养中要贴附于壁上才能迅速铺展,开始有丝分裂并迅速进入对数生长期,这种培养方式就叫贴壁培养.多数动物细胞的培养都采取这种方式.一.贴壁培养微载体培养的优点:表面积/体积比大;微载体悬浮于培养基中,细胞生长环境均一,便于监测和控制;培养基利用率高;采样重演性好;收获过程不复杂;放大较容易;劳动强度小,占用空间小.二.悬浮培养概念:是指细胞在培养器中自由悬浮生长的过程.主要用于非贴壁依赖性细胞培养,如杂交瘤细胞等.是在微生物发酵的基础上发展起来的;可以借鉴微生物发酵的经验;由于动物细胞比较脆弱,所以在搅拌通气等方式上必须比微生物培养更加温和.第二节动物细胞培养的操作方式分为5种:分批式、流加式、半连续式、连续式、灌注式一、分批式操作：概念：是将细胞和培养液一次性装入反应器内，进行培养，细胞不断生长，产物也不断形成，经过一段时间后，将整个反应系取出。培养过程：滞后期、对数生长期、减速期、稳定期、衰退期优点：操作简便，容易掌握，是最常用的方式；缺点：不能使细胞自始至终处于最优条件下。二、流加式操作：概念：先将一定量的培养液装入反应器，，在培养过程中随着细胞对营养物质的不断消耗，新的营养成分不断补充至反应器内，使细胞进一步代谢，到反应终止时取出整个反应系。特点：1）能够调节培养环境中的营养物质浓度；2）整个过程中反应体积是变化的。三、半连续式操作（反复分批式、换液培养）：概念：在分批培养操作的基础上，不全部取出反应系，剩余部分重新补充新的营养成分，再按分批式操作方式进行培养，反应器内培养液的总体积保持不变。优点：可反复收获培养液，对培养基因工程动物细胞分泌有用产物或病毒培养过程比较实用。四、连续操作：概念：在培养过程中一方面新鲜培养液不断加入反应器内，另一方面又将反应液连续不断地取出，使反应条件处于一种恒定状态。优点：维持细胞一直处于优化状态下，促进细胞生长和产物的形成；对细胞生理和代谢规律的研究是一种重要的手段。五、灌注式操作培养：概念：细胞培养过程中一方面不断加入新鲜培养基，另一方面又将反应液连续不断地取出，但细胞留在反应器内，使细胞处于一种不断的营养状态。优点：可以把培养过程保持在稳定的、废代谢物低于抑制水平下的状态。六大限制细胞生长的：1、培养基组成：血清是目前细胞培养基中不可缺少的成分，向细胞提供生长所需要的激素、转移蛋白和其他营养成分，已成为细胞培养达到最优化和降低成本的主要障碍。降低血清用量和采用无血清细胞培养基是目前研究的热点。血清培养基的主要缺点及其原因：血清是培养基成本的主要部分；血清中含有细胞生长必须的微量组分，但这些组分的成分及其作用至今未清楚，因此无法取代；血清的存在是产物纯化的主要障碍；血清是病毒污染及其他未知因素影响的主要来源，增加了细胞培养产品潜在的使用危险；血清同时也有生长抑制的作用；血清使用使实验和生产过程标准化变得困难。2、培养条件优化和控制的困难：动物细胞培养系统能达到的细胞密度较低的主要原因是培养条件和最优化控制的困难，包括：细胞代谢产物的毒害：乳酸、氨等；营养物的耗竭接种的细胞最小密度；解决问题的方法是通过过程调控来实现：灌注系统、换液、流加等，其中灌注是最好的方法。同时采用合理的培养系统以增加表面积并提供最佳的物理化学环境。4、产物表达的控制问题：问题：细胞生长的最优化条件并不一定是表达的产物的最优化条件？问题的解决在于上游分子生物学的研究5、硬件和过程设计中的问题：细胞培养条件的控制（温度、溶解氧、二氧化碳、pH、渗透压），其中充分的氧传递是所有生物反应器中的共同问题；而其他条件对动物细胞来说可以接受的范围都比较窄。污染的排除；遏制潜在生物毒害物的扩散；足够表面积的提供；培养过程中剪切力的控制（搅拌、通气、收获）6、产物收获目前细胞培养产物的收率很低，不及总蛋白的1%，主要原因在于：血清蛋白质的污染；细胞表达产物浓度低；产物在培养条件下不稳定；解决方法：使用无血清培养基；开发在无血清培养基中稳定蛋白质产物的方法；开发筛选技术以得到产量高的细胞克隆；开发产物分离技术：亲和柱、中空纤维、微囊等一、生物反应器的种类：悬浮培养用反应器空气提升式；搅拌槽；中空纤维管；陶质矩形通道蜂窝状生物反应器贴壁培养用搅拌槽（微载体系统）中空纤维管陶质矩形通道蜂窝状生物反应器包埋培养用流化床固定床气升式细胞培养生物反应器：优点：产物的湍流温和而均匀，剪切力相当小，对细胞损伤小，氧传递速率高；液体循环量大，细胞和营养分布均匀。一般产生泡沫不多。动物细胞反应器的控制溶氧控制：针对动物培养的合适搅拌，加入少量溶氧量大的不相溶溶济，改变通入气体的氮氧比；pH控制：采用通入CO2/NaOH缓冲液系统来控制，可避免局部的极端pH出现；温度和搅拌转速的控制比较简单复习试述动物细胞培养的重要性.试述动物细胞的特点及培养的对策.