寨卡等蚊虫传播传染病实验室检测策略

寨卡等蚊虫传播传染病实验室检测策略第1页/共77页黄病毒的系统发生第2页/共77页黄病毒生物学特性概述

黄病毒科成员共同特征：1、病毒球状，直径约40～70nm，核衣壳20面体对称，脂质包膜

2、病毒通过受体介导的内吞作用进入细胞3、病毒在细胞质内复制，形成中间体

4、基因组RNA具有mRNA、复制模板RNA和遗传物质RNA5、病毒蛋白均有一个经宿主蛋白酶和病毒蛋白酶切而成单一的多蛋白前体

6、子代病毒在内质网出芽，通过宿主细胞分泌通路，转运至包膜，成熟释放7、病毒对热、脂溶剂和去氧胆酸钠敏感第3页/共77页黄病毒基因组结构与病毒蛋白第4页/共77页黄病毒属病毒发病机制隐性感染：蚊虫叮咬病毒进入体内，将病毒限制在局部并清除显性感染：当侵入的病毒量较大且人体免疫功能不足以清除病毒时，病毒入血引起病毒血症，病毒突破血脑屏障进入人中枢神经系统引起脑膜和脑实质炎症。第5页/共77页黄病毒属病毒发病机制病毒进入机体后，在树突状细胞中复制，然后播散到局部淋巴结和血流中，产生病毒血症。继而引起外周器官的感染。TOLL样受体3通过TNF-a改变内皮细胞的通透性，从而使病毒透过血脑屏障到达中枢神经系统。黄病毒属的成员可诱导神经细胞凋亡，病毒直接侵犯神经细胞引起损害。感染的神经细胞被CTL特异性杀伤。第6页/共77页一、寨卡病毒病

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1947年：首先从乌干达Zika森林的猴血清中分离到

1948年：在同一地区的伊蚊中分离到寨卡病毒1952年：在乌干达和坦桑尼亚发现人感染寨卡病毒1954年：从西非“黄疸”暴发中的病人分离到2013-2014年：在大洋洲的法属波利尼西亚，感染约32000人。2015年5月-2016年1月：巴西共报道4000例感染孕妇分娩小头畸形儿，较往年上升20倍。2016年8月27-9月6号：新加坡275例。

2007年以来，全球共有52个国家或地区有寨卡病毒流行的证据，其中2015年以来，报告寨卡病毒病本地传播病例的国家或地区40个（中国CDC寨卡疫情防控简报）；第8页/共77页寨卡病毒病疫情第9页/共77页临床表现潜伏期尚不明确（3-12d?）。约1/5的感染者出现临床症状典型病例的临床表现为急性发热、头疼、舌红、皮疹、肌肉痛、关节痛、结膜炎、眶后痛、手掌足底红肿等临床表现一般较轻，症状持续数天到1周，症状严重需要住院者少见，病死率低

第10页/共77页寨卡病毒病并发症一、神经系统

格林巴利综合征、脑膜脑炎二、免疫系统血小板减少性紫癜、白细胞减少症三、出生缺陷

新生儿小头畸形第11页/共77页Zika病毒分为亚洲型和非洲型第12页/共77页寨卡病毒的宿主和媒介

寨卡病毒宿主：尚不完全明确非人灵长类可感染寨卡病毒

寨卡病毒媒介：伊蚊1、在不同的伊蚊中分离到寨卡病毒2、埃及伊蚊：重要传播媒介（海南、广东、云南、广西）3、白纹伊蚊：可作为传播媒介（北至沈阳、大连，经天水、陇南至西藏墨脱一线及其东南侧的大部分地区）

第13页/共77页传播途径伊蚊丛林循环灵长类人城市循环一、蚊媒是主要传播途径，埃及伊蚊为最重要的媒介，在白纹伊蚊、非洲伊蚊和黄头伊蚊等蚊中发现寨卡病毒二、性传播三、通过宫内感染、产程感染第14页/共77页标本采集、保存、运输

一、病例标本采集

对怀疑感染寨卡病毒的患者，推荐采集血液、尿液（精液、羊水、脑脊液）等开展检测。非抗凝血5mL，及时分离血清，分装2管，标记清楚后低温保存。对病例应尽可能采集双份血液标本，两份标本之间相隔14天为宜，住院病例可于入院当天和出院前1天各采集1份。二、蚊媒标本采集

疫点内采集的伊蚊成蚊及幼虫，分类鉴定，填写媒介标本采集信息表，按照采集地点分装，每管10-20只。三、标本保存、运送

能够在24小时内开展检测，2-8℃保存；能在7天内开展检测，-20℃保存；如保存7天以上，-70℃以下。运送时低温冷藏运输，避免冻融，遵守国家关于三类病原体的相关生物安全规定。第15页/共77页寨卡病毒感染和细胞因子第16页/共77页寨卡病毒感染和细胞因子第17页/共77页寨卡病毒和其他黄病毒交叉反应第18页/共77页寨卡病毒的检测一、核酸检测

荧光定量RT-PCR、传统PCR+测序，是目前早期诊断寨卡病毒病的主要检测手段二、抗体检测IgM抗体检测（发病3天后可检出病毒特异性IgM抗体，但发病7天后检出率高）、中和抗体检测（PRNT空斑减少中和试验，恢复期血清中和抗体阳转或滴度较急性期呈4倍及以上升高，且排除登革、乙脑等其他常见黄病毒感染，可以确诊）三、病毒分离

C6/36、BHK21、乳鼠四、抗原检测

免疫组化第19页/共77页第20页/共77页第21页/共77页二、西尼罗病毒病第22页/共77页1950年埃及描述了该病的生态学特征。1957年以色列发生了暴发流行，被认为是引起老年人严重的脑膜脑炎的原因。1994年以来，相继在罗马尼亚、摩洛哥、突尼斯、意大利、俄罗斯、美国、以色列、法国、加拿大等地爆发。1996年，罗马尼亚，大约400人发生脑炎,近40人死亡。1999年，俄罗斯南部发生了范围广泛的流行，近1000人发病，至少40人死亡。美国：自1999年8月发现首例病人，截至到2005年累计共有19655人感染，死亡782人。2012年，美国大暴发，已造成236人死亡，另有五千余人感染。第23页/共77页病原学黄病毒科，单股正链ＲＮＡ,呈球形，直径20～50nm，二十面体对称，有囊膜和蛋白衣壳。分为Ⅰ型和Ⅱ型两个基因型，引起人类感染的为Ⅰ型病毒。一个编码区，编码3个结构蛋白，C-prM-E，和7个非结构蛋白NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5。与乙型脑炎、圣路易脑炎等病毒有明显抗原性交叉反应。实验表明：小白鼠用乙脑病毒、蜘蛛猴用黄热病毒弱毒株、地鼠用乙脑病毒、圣路易脑炎病毒免疫后，均可抵抗WNV神经外途径的攻击。第24页/共77页病原学根据wNVE蛋白基因的差别，将现在已经分离的不同病毒株分为2个谱系。谱系I：引起人类WNV感染的主要基因型，又分3个分枝Ia：括欧洲／地中海／肯尼亚分离株以及美国、以色列分离株；Ib：澳大利亚分离株；Ic：印度分离株。谱系Ⅱ：只在非洲撒哈拉地区和马达加斯加小范围传播。第25页/共77页流行病学传染源主要是鸟类,包括乌鸦、家雀、知更鸟、杜鹃、海鸥等。该病毒还可以感染马、猫、鼠类、家兔等,目前还没有人-人、动物-动物、动物-人、鸟-人等直接传播的记录。家燕是其重要脊椎动物储存宿主。传播途径蚊子是本病的主要传播媒介,以库蚊为主。还可通过输血、器官移植、哺乳、垂直传播以及皮肤黏膜接触感染等多种途径传播。易感性人群对西尼罗脑炎病毒普遍易感,感染后可产生较持久的免疫力。热带地区全年均有发病，温带地区发病主要在夏秋季节。第26页/共77页临床标本采集采集对象：流行季节不明原因发热，病毒性脑炎、脑膜炎等患者急性期标本血清，脑脊液，尸检脑组织，脏器，其他体液核酸检测，病毒培养，抗体筛查恢复期标本血清抗体筛查2023/4/1第27页/共77页标本种类鸟：血液，组织，咽试纸，血清（活鸟）马：组织蚊：研磨液人：脑组织，器官，血液，血清，脑脊液2023/4/1病原检测抗体检测第28页/共77页2023/4/1第29页/共77页病原检测核酸检测BSL-2常规RT-PCR/琼脂糖凝胶电泳实时荧光定量PCR(TaqMan)分离病毒BSL-3细胞培养:Vero,BHK,C6-36,其他小鼠抗体检测

IgM（ELISA、IFA)IgG（ELISA、IFA)中和抗体（PRNT,定量分析）2023/4/1

第30页/共77页病原检测比较核酸IgM抗体IgG抗体中和抗体1.与其他黄病毒无交叉，一经明确即可确诊

2.低敏感性3.需要重复，不同基因组位置

1.最常用急性期感染检测2.第一周仅50%出现

3.与其他黄病毒存在一定交叉

4.持续时间长，单独的IgM阳性并不能作为急性诊断标准，尤其是流行区

1.交叉严重，如JE,SLE疫苗接种.

2.IgG阴性，IgM阳性提示近期感染(疑似病例).

3.无症状的不推荐，不能作为疫苗效果评价

4.恢复期较急性期水平升高意味近期感染了黄病毒或者接种了疫苗

1.重要鉴别诊断及确诊指标

2.与其他黄病毒有一定交叉，但可以定量比较差异以鉴别

3.恢复期较急性期血清存在4倍及以上增高，具有重要诊断意义

2023/4/1第31页/共77页疑似病例检测结果意义第32页/共77页核酸检测-引物序列第33页/共77页市售血清学检测试剂种类FocusDiagnostics(WNBIgGDxSelect,WNVIgMCaptureDxSelect,Cypress,CA)PANBIODiagnostics(WNVIgMCapture,WNVIgGIndirect,Wind-sor,Australia)InBiosInternational(WestNileDetectIgGCaptureELISA,WestNileDetectIgMCaptureELISA,Seattle,WA).2023/4/134第34页/共77页三、基孔肯雅热第35页/共77页基孔肯雅热（chikungunyafever）:1952年首次在坦桑尼亚证实了基孔肯雅热流行，1956年分离到病毒。是由基孔肯雅病毒(chikungunyavirus,CHIKV)引起，经伊蚊传播，以发热、皮疹及关节疼痛为主要特征的急性传染病。2010年，广东东莞报告91例疑似病例。第36页/共77页基因结构通过对E1基因的系统发生分析可将CHIKV分为3个组：第1组包含了全部西非的分离株，第2组是亚洲分离株，第3组为东、中、南部非洲的分离株。第37页/共77页基因结构CHIKV属于披膜病毒科甲病毒属，为不分节段的正链RNA，直径约70nm，有包膜，含有3个结构蛋白（衣壳蛋白C、包膜蛋白E1和E2）和4个非结构蛋白（nsP1、nsP2、nsP3和nsP4）。长度约为11～12kb。病毒基因组编码顺序为5’－NS1－NS2－NS3－NS4－C－E3－E2－E1－3’。第38页/共77页实验室检查第39页/共77页实验室检查第40页/共77页第41页/共77页第42页/共77页第43页/共77页四、登革病第44页/共77页重要免疫原诊断标记RT-PCRNS1：膜相关NS1，mNS1分泌型NS1，sNS1病毒发病第1-9天出现血症期必然出现的分子标识物可高达50µg/mLYYYYYYYYYYYY第45页/共77页1、核酸检测（NESTEDPCR，RealtimePCR）2、ELISA（NS1抗原，IgM，IgG，IgA）3、胶体金（NS1、IgM，IgG）4、C6/36白纹伊蚊卵细胞分离登革热病毒5、间接免疫荧光试验（IFA）鉴定登革热病毒6、新生小白鼠分离登革热病毒实验室检测方法第46页/共77页登革病毒首次感染7071421天IgM~90天IgA~45天IgG潜伏期病毒血症发热期急性期恢复期病毒分离核酸检测NS1抗原检测IgM抗体检测病毒中和实验IgG抗体检测病毒中和实验PLoSNeglTropDis5(9):e1309.第47页/共77页登革病毒再次感染7071421天IgMIgAIgG潜伏期病毒血症发热期急性期恢复期病毒分离核酸检测NS1抗原检测IgM、IgG、IgA检测病毒中和实验PLoSNeglTropDis5(9):e1309.第48页/共77页合适的时机采用合适的检测方法检测方法登革NS1抗原RT-PCR病毒分离登革IgM抗体登革IgG抗体发病天数1-6天1-5天1-5天5天以后10天以后确诊标准检出NS1抗原检出病毒核酸检出病毒检出IgM抗体，双份（间隔期不少于7天）IgM阳转继发感染出现高水平IgG抗体（捕获法）或滴度4倍升高世界卫生组织登革防控指南2009第49页/共77页登革实验室检测方法特点世界卫生组织登革防控指南2009第50页/共77页早期检测宜用PCR、NS1，发病5天后宜采用抗体检测第51页/共77页寨卡病毒、登革病毒和基孔肯雅病毒共流行新喀里多尼亚第52页/共77页寨卡、登革、基孔肯雅临床比较

临床症状寨卡病毒病登革热基孔肯雅热发热++++++++++斑丘疹+++++++肌痛/关节痛+++++++++结膜炎+++-+四肢水肿++--眼眶后痛+++++淋巴结肿大+++++肝肿大--+++白细胞/血小板减少-++++++出血-+-.第53页/共77页第54页/共77页五、流行性乙型脑炎第55页/共77页乙型脑炎流行背景TomSolomon,ThenewEnglandjournalofmedicine,2004

重要的黄病毒性脑炎

引起人类严重的中枢神经系统疾病覆盖人群:

约30亿每年发病人数：>35,000病死率：10-30%后遗症：20-30%第56页/共77页乙脑病毒的鉴定—分子生物学鉴定引物目的基因

序列信息

片段大小1JEVPrM5‘-251CGTTCTTCAAGTTTACAGCATTAGC275-3’5'925-CCYRTGTTYCTGCCAAGCATCCAMCC901-3'

674bp2JEVE5'955-TGYTGGTCGCTCCGGCTTA

973-3'5'2536-AAGATGCCACTTCCACAYCTC

2516-3'1561bp3FlavivirusesNS55‘-TACAACATGATGGGAAAGAGAGAG-3'5'-GTGTCCCAGCCGGCGGTGTCATCAGC-3'310bpPrM基因:鉴定病毒分离物是否为乙脑病毒E基因:除了鉴定乙脑病毒外，还可以进行乙脑病毒的基因分型研究ssRNA(+)10.9kbCPrMENS1NS3NS2bNS2aNS4aNS4bNS55’UTR3’UTR第57页/共77页乙型脑炎病毒分子特征基因组

单股正链RNA病毒仅有一个开放阅读框（openingreadingframe,ORF）编码一个大蛋白基因长度大约在11kb(40-60nm)3个结构蛋白，C，prM,E7个非结构蛋白，NS1,NS2a/b，NS3，NS4a/b，NS5黄病毒属EMRNA第58页/共77页检测方法ELISAIFA中和实验PCR测序病毒分离第59页/共77页蚊虫标本病毒分离第60页/共77页蚊虫标本病毒分离—研磨操作场所：二级或三级生物安全实验室个人防护：防护服、口罩、帽子、乳胶手套研磨器要插入冰浴中进行预冷整个操作过程中蚊虫标本都要保存在冰浴中第61页/共77页蚊虫标本病毒分离—研磨12341、从冰浴中取出研磨器和蚊虫标本2、从研磨器中拔出研磨杵3、将蚊虫标本倒入研磨器中4、向研磨器中加入1ml研磨液第62页/共77页蚊虫标本病毒分离—研磨565、旋转研磨器快速反复研磨6、直至蚊子大的组织块消失7、使用毛细管将研磨液吸出8、将研磨液加入无菌1.5mlEP管中78第63页/共77页蚊虫标本病毒分离—研磨液离心要使用冷冻离心机4℃12,000rpm离心20min3装有研磨液上清的EP管要迅速插入冰浴中第64页/共77页蚊虫标本病毒分离—仪器研磨时间短，效率高，可节省人力物力有利于病毒存活，提高病毒的分离率第65页/共77页动物分离病毒法：乳小白鼠（3日龄）优点，很敏感，易掌握；病毒可随传代次数的增加而增强，有利于病毒分离但是，小白鼠本身存在多种病毒性疾病，往往会影响结果

组织培养分离法：没有隐性感染没有免疫能力的抵抗力接种量大培养条件易于控制加速病毒的分离过程C6/36：对蚊传虫媒病毒较为敏感，蚊传虫媒病毒分离的首选细胞BHK-21：对绝大多数虫媒病毒敏感BHK-21C6/36蚊虫标本病毒分离—常用分离方法第66页/共77页蚊虫标本病毒分离—感染细胞1、吸出离心后研磨液上清2、将研磨上清液加入到细胞管中3、感染后的细胞培养管4、放入孵箱中孵育1h（C6/36在28℃孵育，BHK在37℃孵育）1234第67页/共77页蚊虫标本病毒分离—感染细胞5、倒掉研磨液6、使用无血清培养基洗1-2次7、加入1ml含1%血清的维持液8、培养1周，并逐日观察CPE5678第68页/共77页蚊虫标本病毒分离—观察细胞病变重复上述过程，连续接种三代，观察是否出现连续稳定的细胞病变C6/36细胞

：融合，聚集BHK细胞：圆缩，脱落第69页/共77页蚊虫标本病毒分离—乳鼠分离对三日龄乳鼠颅内接种蚊悬液上清观察有无拒乳、震颤、强直等症状如果出现上述症状，要将鼠脑