分析化学22 (2)课件

分析化学第22章

毛细管电泳法

CapillaryElectrophoresis,CE毛细管电泳是带电粒子在电场力的驱动下，在毛细管中按其淌度或和分配系数不同进行高效、快速分离的电泳新技术，也称为高效毛细管电泳。

20世纪30－40年代蒂塞利乌斯(A.W.K.Tiselius）建立了移动界面电泳，将电泳发展成分离技术获得1948年诺贝尔化学奖

1981年J.W.Jorgenson,K.D.Lukacs实验上和理论上为毛细管电泳的发展奠定了基础。上一世纪后二十多年分析化学领域中发展最迅速的分离分析方法。

第22章

毛细管电泳

22－1毛细管电泳的原理

1装置

毛细管数据处理电极检测器电极试样缓冲液缓冲液

高压电源

（可高至30KV）

第22章毛细管电泳22－1毛细管电泳的原理

2电泳和电渗

电泳是指在电场作用下，溶液中的带电粒子作定向移动的现象。电渗是指在电场作用下，毛细管或固相多孔物质内液体沿固体表面移动的现象。第22章

毛细管电泳22－1毛细管电泳的原理

2电泳和电渗

电泳行为与特性使用淌度描述

即单位场强(E)下离子的平均电泳速度υ

μep=υ/E实验中，只发生电泳时有效淌度μef=υef﹒

(L/V)=(

l/tm)﹒(L/V)

毛细管有效长度迁移时间毛细管总长度电压固液两相间的总电势-热力学电势-φ0Zeta电势-ζ

第22章毛细管电泳22－1毛细管电泳的原理

2电泳和电渗

电渗流的流型特点电渗流HPLC塞流层流

第22章毛细管电泳22－1毛细管电泳的原理

2电泳和电渗

电渗流的表示电渗流的大小可用淌度(μeo)或电渗流系数表示

μeo=υeo/E=l/(teo﹒E)电渗流速度毛细管有效长度

电渗流流出时间

电场强度第22章毛细管电泳22－1毛细管电泳的原理

2电泳和电渗

改变电渗流的方法改变外加径向电场改变缓冲液成分和浓度Zeta电势改变缓冲液pH加入添加剂改变温度

粘度

盐-离子强度表面活性剂µeo正比于Zeta电势和介质的介电常数反比于介质的黏度Zeta电势正比于双电层厚度和界面有效电荷密度反比于介质的介电常数表观电泳淌度

µap

μap=υap/E

υap为离子的表观迁移速度

υap=υef+υeo

µap=µef+µeo第22章毛细管电泳22－1毛细管电泳的原理

2电泳和电渗

第22章毛细管电泳22－1毛细管电泳的原理

3分离效率和分离度

分离效率柱效可以用理论塔板数n表示

n=(µep+µeo)Vl/(2DL)

毛细管电泳分离的柱效方程

理论塔板高

H=L/n

n=5.54(χ/W½)2实验上可按上式求出理论塔板数χ为电泳图上从起点至电泳峰最大值之间的距离W½为电泳峰的半高峰宽

分离度计算式Rs=2(tm2-tm1)/(W1+W2)tm1、tm2分别为两个组份的迁移时间W

为峰底的宽度

第22章毛细管电泳22－1毛细管电泳的原理

3分离效率和分离度

第22章毛细管电泳22－1毛细管电泳的原理

4区带宽度及其展宽因素

区带宽度

Ws=（Wt﹒l/tm）-Wd

时间宽度检测器的窗口宽度空间宽度第22章毛细管电泳22－1毛细管电泳的原理

4区带宽度及其展宽因素

区带宽度展宽因素

焦耳热进样电泳扩散毛细管壁对组分的吸附

进样

试样导入毛细管柱时，总有一定的试样区带长度。细内径的毛细管柱时，进样操作的要求更为严格。一般进样区带控制在柱长的1%电泳扩散

试样区带中的缓冲溶液浓度或电阻率与毛细管其它地方的浓度或电阻率不相等时，因两个区域电场强度的差异，而引起区带电分散。µs---µb

峰前展或拖尾？第22章毛细管电泳22－1毛细管电泳的原理

4区带宽度及其展宽因素

毛细管壁对组分的吸附

电泳峰拖尾或变形，甚至消失。抑制吸附作用常用的方法有：●使用极端pH条件●加入中性盐或两性离子化合物●对毛细管内壁进行涂层处理

需要注意：方法也会抑制或改变电渗流

第22章毛细管电泳22－1毛细管电泳的原理

4区带宽度及其展宽因素

第22章毛细管电泳

22－2分离模式

1毛细管区带电泳2胶束电动色谱3毛细管凝胶电泳4毛细管等速电泳5毛细管等电聚焦6毛细管电色谱第22章毛细管电泳22－2分离模式

2胶束电动色谱电动色谱:是以电渗流驱动的一种色谱技术胶束电动色谱MEKC:是以胶束为假固定相的一种电动色谱，是电泳技术和色谱技术的结合加入高于胶束临界浓度的表面活性剂胶束电动色谱的应用特点:使毛细管电泳不仅能分离离子化合物，而且还能分离中性化合物.比高效液相色谱更为高效.

HPLC分离柱效为5000－25000理论板数/mMEKC可达到50000－500000理论板数/m比高效液相色谱更为高速.MEKC分离时间通常小于30min，但达到相仿效率的毛细管LC，需要更长的时间。

第22章毛细管电泳22－2分离模式

2胶束电动色谱第22章毛细管电泳22－2分离模式

4毛细管等速电泳分离是建立在试样中各组分的电泳淌度不同，等速电泳中被分析试样进样前后分别使用前导电解质溶液和终结电解质溶液，分离后的各组分区带以相同的电泳迁移速度通过检测窗口。

第22章毛细管电泳22－2分离模式

4毛细管等速电泳注意:前导电解质的电泳淌度应高于试样中各组分的电泳淌度，而终结电解质的电泳淌度则反之。电泳过程中被分离各组分的浓度都将接近前导电解质浓度，对痕量组分在柱上浓缩可达几个数量级，成为重要的柱上浓缩技术之一。第22章毛细管电泳22－2分离模式

4毛细管等速电泳第22章毛细管电泳22－2分离模式

5毛细管等电聚焦CIEF:建立在不同蛋白质或多肽之间等电点（pI值）差异基础上的分离方法。蛋白质的等电点(pI):指蛋白质分子的表观电荷数为零时的pH值。

方法:

进样－等电聚焦－检测先将脱盐的试样（蛋白质）以≥1％的浓度与两性电解质溶液混合，用压力进样充入毛细管柱(阳极端)，置于阳极电解质溶液如H3PO4中，检测端为阴极端，置于阴极电解质如NaOH中。施加电压，进行电泳实验。两性电解质离子形成pH的位置梯度，而蛋白质在迁移时会在其等电点的pH区域内停止移动。这样pI不同的蛋白质各组分会在毛细管内很窄的不同pH区域内聚焦.在阳、阴极电解液中加入盐如NaCI或NaOH,破坏pH梯度，使各组分蛋白质重新带电，在电场力作用下发生迁移、检测，使不同组分的蛋白质得到分离。第22章毛细管电泳22－2分离模式

5毛细管等电聚焦特点:等电聚焦实际上也是一个试样浓缩过程，这一过程可用于浓缩试样组分。具有极高的分辩率，可以分离等电点相差0.01pH的两种蛋白质.注意:电渗流的存在会破坏聚焦区带的稳定

第22章毛细管电泳22－2分离模式

5毛细管等电聚焦第22章毛细管电泳22－2分离模式

6毛细管电色谱CEC:以电渗流驱动流动相，开管和填充两种比高效液相色谱具有更高的柱效

第22章

毛细管电泳

22－3进样与检测1进样方法电动进样

也称电迁移进样.

方法:将毛细管的进样端插入装有试样溶液的试样管中，试样管中插入电极，与检测端的缓冲液间施加进样电压，并维持一定时间，试样溶液在电泳和电渗流作用下进入毛细管，然后再将试样溶液换成载体缓冲液，电泳即可进行。

第22章毛细管电泳22－3进样与检测

1进样方法

流体动力学进样也称为虹吸进样、重力进样、压差进样方法:毛细管进样端插入试样溶液容器，通过进样端加压，或检测端出口减压，或调节进样端试样溶液液面大于出口端缓冲液液面高度，利用虹吸现象，使进样口端与出口端形成正压差，并维持一定时间，试样在压差作用下进入毛细管进样端，再把进样端放回缓冲液液槽中，进行电泳

第22章毛细管电泳22－3进样与检测

2检测方法

紫外吸收检测器第二十二章毛细管电泳22－3进样与检测

2检测方法

检测器检出限（mol/L）特

点UV－可见吸收10-5－10-6近似通用，常规应用荧光非相干光诱导