微生物学分类与控制

实验动物微生物学分类与控制

（办）第一节实验动物微生物学控制

实验动物如受到病原微生物、寄生虫的污染，其正常状态的平衡将遭致破坏，引起动物发病，从而给动物的生产及实验的正常进行带来严重影响。有的不立即发病，但处于可能发病的污染状态，即机会致病因子的潜在性感染时，如再施加做为附加因素的实验处理，动物可能发病。一.实验动物微生物质量控制的原因

1．引起实验动物的疾病和死亡

传染病是引起实验动物疾病和死亡、影响实验动物质量的主要原因，这些病原体包括病毒、细菌和寄生虫。某些烈性传染病如鼠痘、兔出血症、犬细小病毒性肠炎等的流行，可导致动物大批死亡或质量下降，从而给动物的生产和实验的正常进行带来严重影响。

2.干扰实验结果

实验动物的微生物和寄生虫感染可不同程度干扰实验结果，从而影响研究工作的准确性和可靠性，甚至得出错误的结论。隐性感染常导致动物生理生化指标的改变，使实验得不到应有的结果。或因实验处置，动物抵抗力下降，使隐性感染显性化，导致疾病的发生。掠夺宿主的营养;体外寄生虫对动物的骚扰;对宿主机体产生机械性损伤;对宿主产生毒性作用;对宿主生理、生化和免疫系统的影响。实验动物感染寄生虫后，不仅虫体对机体造成一定的损害，动物机体也对虫产生反应，使动物机体的生理、生化及免疫学指标发生改变，从而影响实验结果。

4．影响生物制品的质量

病原微生物污染了细胞培养物、肿瘤移植物或以动物组织和细胞为生产原料的生物制品，不仅干扰实验，而且还可将病原扩散，以至危害人类的健康。如果实验动物是用于生产生物制品的目的，其来源必须摆脱大量的能引发人类潜在人兽共患病的、带有特别病原体的动物群体。上世纪30年代美国的“磺胺”事件、50年代法国的“有机锡”事件、60年代德国的“反应停”事件等，均导致大量的人员死亡或残疾。上世纪80年代初，我国最著名的克山病研究科学家由于使用了不合格的实验动物，研究成果没有得到世界同行的认可。我国最有价值的新药——青蒿素，也同样由于使用了不合格的实验动物而不能进入国际市场，被国外同行抢先注册，失去了独立知识产权。

随着现代科学的发展和西方动物保护主义运动的影响，实验动物科学已从过去注重于动物的饲养管理和实验操作，愈来愈集中于动物的福利和实验结果的质量。

实验动物使用总量下降，高质量实验动物使用量增加

早在七十年代，发达国家的实验动物在使用量上已经趋于平衡。但是，高质量实验动物的使用数量呈上升趋势，普通级、清洁级动物逐渐被SPF级取代。目前发达国家使用的大、小鼠等小型实验动物大多为SPF级.2005年在全国基本普及使用清洁级实验大鼠、小鼠。某些重点科研项目用实验动物，达到SPF级水平。

1.感染源内源性外源性2.传播途径:实验动物;生物材料;工作人员;宠物；材料和设备3.易感动物

二、实验动物微生物和寄生虫感染的基本要素流行性出血热弓形虫病淋巴细胞脉络从脑膜炎沙门菌病狂犬病猴B病毒感染猴结核病1.重要的人兽共患病鼠痘兔出血症（兔瘟）2.主要的烈性传染病鼠肝炎病毒感染仙台病毒感染鼠肺支原体病嗜肺巴斯德杆菌病小鼠呼肠孤3型病毒感染球虫病犬细小病毒感染犬瘟热3.常见的微生物和寄生虫感染

不同等级啮齿类、兔、犬和猴等实验动物要求排除的细菌、病毒、寄生虫应根据国家技术监督检验检疫总局发布的有关实验动物微生物学等级及监测标准(GB14922.2—2001、GB14922.1—2001)。实验动物的微生物和寄生虫控制国家标准GB14922-1994《实验动物微生物学和寄生虫学监测等级（啮齿类和兔类）》将我国实验动物分为四级，即一级动物（普通级）、二级动物（清洁动物）、三级动物（无特殊病原体动物）和四级动物（无菌动物）。GB14922.2-2001《实验动物微生物学等级及监测》(2002年5月1日开始实施)新标准对实验动物等级进行了重新设定，将实验小鼠和大鼠的微生物学等级分为清洁级、无特定病原体级（SPF）和无菌级，取消了普通级。豚鼠、地鼠和兔仍保留四级。犬和猴分为普通级和SPF级。

一、普通级动物定义普通级动物（ConventionalAnimalCV）是在微生物学控制上要求最低的动物，它要求不携带人兽共患病和动物烈性传染病的病原。如鼠痘病毒、流行性出血热病毒、弓形体等，饲养于普通环境中。应用：举例说明二、清洁级动物定义

清洁级动物（Cleananimal，CL）是指除普通动物应排除的病原体外，不携带对动物健康危害大和对科学研究干扰较大的病原的动物，如鼠痘病毒、鼠肝炎病毒、仙台病毒、体外寄生虫等，饲养于屏障环境。应用：举例说明应用

国际上普遍认为CL动物仅适合于短期或部分科研试验。根据国外实验动物工作发展及国内的具体条件，CL动物近年来在我国得到了广泛的应用。它较普通动物健康，又较SPF易达到质量标准，在动物实验研究中可免受动物疾病的干扰，其敏感性及重复性亦较好。因此，我国针对自己的实际情况认为这类动物目前可适用于大多数科研实验，应是国内科研工作主要要求的标准级别的动物，可应用于生物医学研究的各个领域药物安全评价：实验能否持续取决于污染的可能性老年病学研究：SPF动物的寿命普遍超过普通动物免疫学研究：免疫缺陷动物只有SPF级或以上级别动物才能保种、繁殖

四、无菌动物

定义

无菌动物（Germ-FreeAnimal,GF）是指用现有的监测技术在动物体内外的任何部位，均检测不出任何活的微生物和寄生虫的动物。饲养于隔离环境，属四级动物。应用：举例说明无菌动物的发展过程1895—1910年解决了无菌生命能否生存的问题Pasteur认为动物没有肠道菌参与不能生存。生物学家NenK提出了相反的看法，由此开展了一场学术上的争论。十年后，1895年Nuttall和Thierfelder经剖腹产，用牛奶饲喂获得了无菌豚鼠，第八天后处死，肠道内未检出细菌。1898年Scottellies获得了无菌鸡，无菌环境中养活了17天，至此建立了无菌生命可以存活的论点。无菌动物的特点（一）形态学改变消化系统：无菌动物盲肠及其内容物重量可达体重25%，多数情况下，无菌动物盲肠是普通动物的5—10倍。无菌动物由于盲肠膨大，肠壁菲薄，常易发生肠扭转导致肠壁破裂而死亡。有关盲肠膨大原因尚无定论。血液循环系统：心脏相对变小，白细胞数少，且数量波动范围小，与无病原体入侵有关。免疫系统：由于无菌动物几乎没有受过抗原刺激，其免疫机能基本上处于原始状态。胸腺中网状上皮细胞较大，其胞浆内泡状结构和溶酶体较少，胸腺和淋巴结处于不活跃状态，脾脏变小。（二）生理学改变免疫功能：由于网状内皮系统、淋巴组织发育不良，淋巴小结内缺乏生发中心，产生γ-球蛋白的能力很弱。血清中IgM、IgG水平低，免疫功能处于原始状态，应答速度慢，过敏反应、对异体移植的排斥反应以及自身免疫现象消失或减弱。用低分子无抗原饲料饲喂无菌动物时，血清中几乎不存在γ-球蛋白和特异性抗体。生长率：无菌禽类>普通禽类；无菌大小鼠≈普通大小鼠无菌豚鼠、家兔<普通豚鼠、家兔繁殖率：规律同生长率代谢：血中含氮量少，肠管对水的吸收率低，代谢周期比普通动物长。营养：无菌动物体内不能合成VB和VK，易发生缺乏症。抗辐射能力：无菌动物能力强于普通动物，无菌小鼠抗实验性烫伤引起的休克死亡能力也强于普通小鼠。寿命：无菌动物>普通动物无菌动物的应用在微生物学研究中的应用在免疫学研究中的应用在放射医学研究中的应用在营养、代谢研究中的应用在老年病学研究中的应用在心血管疾病研究中的应用在毒理学研究中的应用在肿瘤学研究中的应用在宇航医学研究中的应用在寄生虫学研究中的应用在口腔医学研究中的应用抗体制备研究普通动物体内细菌种类多，很难制备较纯的抗体;无菌动物缺乏抗原刺激，免疫系统处于“休眠”状态,对外来刺激，有迅速、单一和持久作出反应的特性，如果接种单一的菌株，会产生较纯的、高效价的、且不会污染其他微生物的抗体。五、悉生动物(gnotobioticanimal,GN)

悉生动物也称已知菌动物或已知菌丛动物，是指在无菌动物体内植入已知微生物的动物。属四级动物，饲养于隔离系统。分为单菌、双菌和多菌动物。悉生动物的特性悉生动物肠道内存在能合成某种维生素和氨基酸的细菌，不象GF动物发生维生素缺乏症，生活力较强，抵抗力明显增加，易于饲养管理。中国药检所利用五联菌悉生动物（大肠埃希氏杆菌、表皮葡萄球菌、白色葡萄球菌、粪链球菌和乳酸杆菌）可替代无菌动物进行药物检定。悉生动物在生物医学研究中的应用微生物学研究在无菌动物断奶前后，接种一种或多种菌，可观察这些细菌对机体的作用。了解细菌之间及细菌与机体之间相互关系和菌群失调现象。观察机体、微生物、致病因子三方面相互作用的关系。第三节洁净动物与普通动物的

特性比较

洁净动物是指来源于剖腹产，实行严格的微生物控制，饲养于空气净化设施内的动物，主要包括：清洁动物、SPF动物、悉生动物和无菌动物。一、各等级动物的相关关系二、微生物控制比较

由于动物分类等级不同，因而其微生物控制程度也不一致，与之相对应的动物饲养环境及饲养管理方法也各不相同。

按微生物控制程度的实验动物分类原则三、对科研实验结果影响的比较四等级动物优缺点比较四、如何选择不同等级的实验动物？

GF、GN动物在绝对屏障内维持，管理复杂，无菌状态的保持难、产量低、价格高，实际应用有限。GN动物多用于研究微生物与微生物、微生物与宿主间相互关系的动物模型。SPF动物在相对屏障中维持，易管理、产量大、价格低。因其不携带病原体，不影响实验结果，在发达国家己广泛应用，是目前国际标准级别的实验动物。等级动物优缺点比较CL动物近年来在我国得到了广泛的应用。它较普通动物健康，又较SPF易达到质量标准，在动物实验研究中可免受动物疾病的干扰，其敏感性及重复性亦较好，是国内科研工作主要要求的标准级别的动物，可应用于生物医学研究的各个领域。选择标准

对于实验动物的微生物学级别选择，应根据其各级动物的特点、应用范围及课题的水平高低，选用相匹配的微生物学级别的实验动物。一般而言，教学示范选用普通动物，清洁动物是国内科研工作要求的标准动物，适合于大多数科研课题，而SPF动物则是国际标准的实验动物，对于一些具有国际交流意义的重大课题，最好选用SPF动物，但无菌及悉生动物为非常规动物，仅在特殊课题需要时才选用。

注：“+”可能或必须用；“-”不可能或适用；“*”不用或不能用不同等级动物在生命科学的应用

第四节洁净动物的培育及饲养管理(一)无菌动物的培育

主要采用剖腹产技术。对于小动物，多用子宫摘除术；大动物，多采用子宫切开术器械消毒剖腹产母鼠及带乳母鼠的准备子宫摘除术胎仔处理剖腹产仔鼠的哺育无菌检测在无菌隔离器中进行一、无菌动物的培育及饲养管理剖腹产母鼠与带乳鼠的准备选择合适的母鼠作为剖腹产母鼠，按实验要求，10～12周龄鼠，雌雄鼠以1：1合笼，每日早晚两次观察有无阴道栓，或用阴道拭子涂片染色，检查其中有无精子。以出现阴道栓或发现精子作为妊娠半天计算。剖腹产手术应在妊娠19.5天为好,另选择无菌母鼠作为代乳鼠。剖腹产母鼠与带乳鼠应同步交配.带乳鼠较剖腹产鼠提前2-3天交配。剖腹产仔鼠的哺育（1）人工哺乳（2）代乳方法由无菌子宫摘除术获得胎仔，由哺乳中的无菌小鼠给予代乳。乳母鼠的选择一般要考虑其综合性能，选择母性强的个体作为乳母鼠。①将代乳母鼠仔鼠留下2—3只，其他弃掉，优秀的可弃去全部亲生仔鼠。②将代乳母鼠笼内的垫料充分分散到被代乳仔鼠身上，悄悄地置于代乳鼠腋下。③一但确认被代乳鼠吸吮代乳鼠的乳汁，就将代乳鼠自产仔鼠弃掉。④代乳4周龄即可离乳。无菌检测

对代乳母鼠、剖腹产仔鼠的无菌检测，应在手术后的7、12、25天进行，对了解动物体内的微生物状况，保证动物的质量极为重要。（二）悉生动物的培育

传入授入已知微生物材料无菌隔离器无菌动物二、SPF动物、清洁动物培育1、种群来源来源于无菌动物。即将无菌动物或悉生动物饲养于屏障系统。培育SPF动物时是以卵或子宫无病原体为前提，防止某些病原体通过胎盘垂直传染给胎儿。2、饲养设施SPF动物屏障系统清洁动物屏障系统3、饲养管理严格的微生物学检测

（一）监测意义实施微生物学与寄生虫学监测，是保证实验动物质量及标准化的必要手段。通过监测可掌握动物群中病毒、细菌、寄生虫的流行情况，及时诊断感染性疾病，发现并控制其传播，以保证实验动物的健康。

第五节、实验动物微生物学和寄生虫学质量监测（二）监测内容

不同级别实验动物的微生物和寄生虫监测内容不同，见国家标准GBl4922.1—2001和GBl4922.2—2001。（三）检验方法目前使用国标推荐的方法和详细检验程序。病原菌以分离培养鉴定为主，病毒以血清学和病原学检测为主，寄生虫以镜检为主。病毒常用检测方法有血清学和病原学检测血清学常采用的方法：血球凝集试验（HA）血球凝集抑制试验（HI）免疫荧光试验（IFA）免疫酶染色试验（IEA）酶联免疫吸附试验（ELISA）病原学检查包括：病毒分离培养与鉴定；病毒颗粒、抗原或核酸的检出；抗体产生试验；潜在病毒的激活等试验。

细菌学常用的检测方法是进行病原菌的分离培养真菌监测主要采用分离培养法（沙式培养基）菌落特点，镜下染色检查，生化反应和免疫学方法寄生虫监测采用肉眼观和镜下观察分为体表和肠道寄生虫检测（四）检验程序

抽取动物↓编号↓体外检查↓麻醉↓取血——血清检查病毒抗体或其他病原的抗体↓体外寄生虫检查——皮肤取样——真菌检查↓脏器、肠内容物、——无菌解剖——气管分泌物、肠内容物、粪便，体内寄生虫检查↓脏器分离细菌检测↓检测报告

规定了实验动物质量判定原则，即：经检测，如有一项指标不符合该级别标准要求，则判为不符合该级别标准。根据检验结果，由检验人员及其负责人签发检测报告。（五）报告第六节实验动物的卫生防疫与隔离措施

实验动物（除大型或稀有实验动物），不应采取疫苗接种或药物治疗第一，应用疫苗或治疗制剂可能干扰实验结果，而使实验无效。如使用抗生素或磺胺类药物可使动物的肝、胆、肾等脏器组织产生毒性损伤，影响实验结果；第二，经过治疗或免疫的动物，外表健康，但仍带菌或带毒，成为潜在的传染源。如沙门氏菌即使采取药物治疗，也不能使其从动物群中彻底根除。又如小鼠肝炎病毒，虽用疫苗免疫可以产生免疫力，但有些小鼠仍可带毒，使其在小鼠群中长期存在；第三，对小型实验动物，采取治疗措施，尤其是需用特殊药物的个体治疗，经济上也不合算。

一、实验动物的防疫原则隔离饲养：各种动物要分开饲养，严禁混养在一起。防止交叉感染。引进动物要严格检疫：依据国家检测标准进行，要从具有动物质量合格证的单位引进动物。坚持卫生消毒制度：杜绝各种微生物的侵入和繁殖。其中定期对动物房舍和饲养用具的消毒是必不可少的。饲养管理人员要定期健康检查，有人畜共患病者，应调离与动物接触的工作岗位。保种单位要对保种的动物定期进行质量检查，发现问题及时更新种群。对国标要求必须实施预防接种的实验动物要定期进行免疫接种。严格防止野生动物侵入实验动物室，对死亡动物进行无害化处理。二、平时的预防措施①饲养人员应严格按照不同等级实验动物的饲养管理和卫生防疫制度和操作规程，认真做好各项记录，发现情况，及时报告。②实验动物设施周围应无传染源，不得饲养非实验用家畜家禽，防止昆虫及野生动物侵入。③坚持平时卫生消毒制度，降低环境设施中的病原体含量。④不从疫区引进实验动物。

⑤各类动物应分室饲养，以防交叉感染。饲养室严禁非饲养人员出入和各类人员互串，购买或领用动物者不得进入饲养室内