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实验酪氨酸酶动力学第1页/共12页实验九酪氨酸酶的动力学第2页/共12页1.学会测定酶反应速度的基本方法。2.掌握测定米氏常数Km值的原理和方法。

【目的和要求】第3页/共12页【实验原理】酪氨酸酶催化的反应为：475nm第4页/共12页常用单位时间内、产物的浓度增加量表示。一、酶活力测定—

酶反应初速度的测定:TimeProductConcentrationv=dC/dtA=εCd:3600M-1cm-1d:1cm确定酶反应时间！第5页/共12页二、底物浓度[S]对酶反应速度：一级反应混合级反应零级反应Effectofsubstrateconcentrationontheinitialvelocityofanenzyme-catalyzedreaction.½VmaxKm第6页/共12页Km值测定:双倒数作图法第7页/共12页（一）酶反应初速度的测定：---酶反应时间的确定

在比色杯中，按下表依次加入试剂：【实验方法】

加入酶液后立即混匀，并每隔15秒读取475nm处的吸光值。L-多巴（mL）1磷酸缓冲液（mL）1.97酪氨酸酶（mL）0.03注：酪氨酸酶5U/l第8页/共12页

绘制产物浓度C-Time反应曲线，观察酶反应初速度，确定酶反应时间。一般在30~120秒左右。

时刻（秒）A时刻（秒）A0135151503016545180601957521090225105240120255各时刻的吸光值记录在下表：第9页/共12页（二）米式常数的测定：在比色杯中，采用已确定的酶反应时间X，分别记录各管反应开始时A0和X秒钟后的A1。管号15mML－多巴

(ml)磷酸缓冲液（ml）

酪氨酸酶（ml）

10.22.770.0320.32.670.0330.42.570.0340.52.470.0350.62.370.03每管反应体系仍为3ml。第10页/共12页记录数据于下表：

利用双倒数作图法，横坐标为1/S，纵坐标为1/v，分别求出Vmax和Km。

管号L－多巴浓度（mM）A0A1ΔA（A1-A0）V

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