第三章荧光法

第三章荧光法第一页，共四十二页，2022年，8月28日荧光分析法教学要求掌握分子荧光、磷光的产生机理；掌握激发光谱和发射光谱特征。掌握荧光与分子结构的关系以及溶液对荧光强度影响的因素。了解荧光分析法的特点及定量测定方法。了解荧光分析仪器的结构。第二页，共四十二页，2022年，8月28日概述

自然界存在这样一类物质，当这些物质的分子吸收能量后，能发射出荧光，人们根据所发生荧光的特性和强度，对物质进行定性或定量分析的方法，称为荧光分析法（fluorescenceanalysis）。第三页，共四十二页，2022年，8月28日荧光分析的特点：灵敏度高：视不同物质，检测下限在0.1~0.001g/mL之间。可见比UV-Vis的灵敏度高得多！选择性好：可同时用激发光谱和荧光发射光谱定性。结构信息量多：包括物质激发光谱、发射光谱、光强、荧光量子效率、荧光寿命等。应用不广泛：主要是因为能发荧光的物质不具普遍性、增强荧光的方法有限、外界环境对荧光量子效率影响大、干扰测量的因素较多第四页，共四十二页，2022年，8月28日基态单重态激发单重态激发三重态激发态与基态中的电子自旋方向相反，称为激发单重态（S）抗磁性激发态与基态中的电子自旋方向相同，称为激发三重态（T）顺磁性区别：电子自旋方向不同，激发三重态的能级稍低一些。电子跃迁类型允许跃迁禁阻跃迁第五页，共四十二页，2022年，8月28日分子的去激发无辐射跃迁辐射跃迁荧光（F）磷光（P）振动弛豫内转移外转移体系间跨越分子的去激发第六页，共四十二页，2022年，8月28日分子荧光和磷光分析一、基本原理荧光和磷光的产生处于分子基态单重态中的电子对，其自旋方向相反，当其中一个电子被激发时，通常跃迁至第一激发态单重态轨道上，也可能跃迁至能级更高的单重态上。如果跃迁至第一激发三重态轨道上，则属于禁阻跃迁。单重态与三重态的区别在于电子自旋方向不同，激发三重态具有较低能级。第七页，共四十二页，2022年，8月28日第一节分子荧光和磷光分析在单重激发态中，两个电子平行自旋，单重态分子具有抗磁性，其激发态的平均寿命大约为10-8s，而三重态分子具有顺磁性，其激发态的平均寿命为10-4~1s以上（通常用S和T分别表示单重态和三重态）。

第八页，共四十二页，2022年，8月28日分子荧光和磷光分析处于激发态的电子，通常以辐射跃迁方式或无辐射跃迁方式再回到基态。辐射跃迁主要涉及到荧光、延迟荧光或磷光的发射；无辐射跃迁则是指以热的形式辐射其多余的能量，包括振动弛豫（VR）、内部转移（IR）、体系间跨跃（IX）及外部转移（EC）等，各种跃迁方式发生的可能性及程度，与荧光物质本身的结构及激发时的物理和化学环境等因素有关。第九页，共四十二页，2022年，8月28日分子荧光和磷光分析下面结合荧光和磷光的产生过程，进一步说明各种能量传递方式在其中所起的作用。设处于基态单重态中的电子吸收波长为λ1和λ2的辐射光之后，分别激发至第二单重态S2及第一单重态S1。振动弛豫它是指在同一电子能级中，电子由高振动能级转至低振动能级，而将多余的能量以热的形式发出。发生振动弛豫的时间为10-12s数量级。第十页，共四十二页，2022年，8月28日分子荧光和磷光分析内转移当两个电子能级非常靠近以至其振动能级有重叠时，常发生电子由高能级以无辐射跃迁方式转移至低能级。第十一页，共四十二页，2022年，8月28日分子荧光和磷光分析荧光发射（F）

处于第一激发单重态中的电子跃回至基态各振动能级时，将得到最大波长为λ3的荧光。注意：基态中也有振动驰豫跃迁。很明显，λ3的波长较激发波长λ1或λ2都长，而且不论电子开始被激发至什么高能级，最终将只发射出波长λ3为的荧光。荧光的产生在10-7-10-9s内完成。第十二页，共四十二页，2022年，8月28日分子荧光和磷光分析体系间跨跃

指不同多重态间的无辐射跃迁，例如S1→T1就是一种体系间跨跃。通常，发生体系间跨跃时，电子由S1的较低振动能级转移至T1的较高振动能级处。有时，通过热激发，有可能发生T1→S1，然后由S1发生荧光。这是产生延迟荧光的机理。第十三页，共四十二页，2022年，8月28日分子荧光和磷光分析磷光发射

电子由基态单重态激发至第一激发三重态的几率很小，因为这是禁阻跃迁。但是，由第一激发单重态的最低振动能级，有可能以体系间跨跃方式转至第一激发三重态，再经过振动驰豫，转至其最低振动能级，由此激发态跃回至基态时，便发射磷光，这个跃迁过程（T1→S0）也是自旋禁阻的，其发光速率较慢，约为10-4-10s。因此，这种跃迁所发射的光，在光照停止后，仍可持续一段时间。第十四页，共四十二页，2022年，8月28日分子荧光和磷光分析外转移指激发分子与溶剂分子或其它溶质分子的相互作用及能量转移，使荧光或磷光强度减弱甚至消失。这一现象称为“熄灭”或“猝灭”。荧光与磷光的根本区别：

荧光是由激发单重态最低振动能层至基态各振动能层间跃迁产生的；而磷光是由激发三重态的最低振动能层至基态各振动能层间跃迁产生的。第十五页，共四十二页，2022年，8月28日T1

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磷光荧光吸收振动弛豫体系间跨越荧光与磷光产生示意图第十六页，共四十二页，2022年，8月28日荧光的检测单色器光源检测器狭缝单色器吸收池狭缝I0It荧光的检测第十七页，共四十二页，2022年，8月28日激发光谱与荧光光谱

任何荧（磷）光都具有两种特征光谱：激发光谱与发射光谱。它们是荧（磷）光定性分析的基础。1）激发光谱改变激发波长，测量在最强荧（磷）光发射波长处的强度变化，以激发波长对荧光强度作图可得到激发光谱。第十八页，共四十二页，2022年，8月28日激发光谱与荧光光谱

激发光谱形状与吸收光谱形状完全相似，经校正后二者完全相同！这是因为分子吸收光能的过程就是分子的激发过程。激发光谱可用于鉴别荧光物质；在定量时，用于选择最适宜的激发波长。第十九页，共四十二页，2022年，8月28日激发光谱与荧光光谱2）发射光谱发射光谱即荧光光谱。一定波长和强度的激发波长辐照荧光物质，产生不同波长的强度的荧光，以荧光强度对其波长作图可得荧光发射光谱。由于不同物质具不同的特征发射峰，因而使用荧光发射光谱可用于鉴别荧光物质。第二十页，共四十二页，2022年，8月28日激发光谱与发射光谱的关系i）波长比较与激发（或吸收）波长相比，荧光发射波长更长。ii）形状比较荧光光谱形状与激发波长无关。换句话说，不管激发波长如何，电子都是从第一电子激发态的最低振动能层跃迁到基态的各个振动能层。第二十一页，共四十二页，2022年，8月28日激发光谱与发射光谱的关系iii）镜像对称通常荧光光谱与吸收光谱呈镜像对称关系第二十二页，共四十二页，2022年，8月28日分子结构与荧光的关系

产生并可观察到荧光的条件：i）分子具有与辐射频率相应的荧光结构（内因）；ii）吸收特征频率的光后，应可产生具一定量子效率的荧光。即量子效率F足够大：第二十三页，共四十二页，2022年，8月28日分子结构与荧光1）跃迁类型：通常，具有—*及n—*跃迁结构的分子才会产生荧光。而且具—*跃迁的荧光效率比n—*跃迁的要大得多。2）共轭效应：共轭度越大，荧光越强。第二十四页，共四十二页，2022年，8月28日共轭结构与荧光的关系共轭结构与荧光的关系第二十五页，共四十二页，2022年，8月28日分子结构与荧光3）刚性结构和共平面性：分子刚性（Rigidity）越强，分子振动少，与其它分子碰撞失活的机率下降，荧光量子效率提高。如荧光素（大）与酚酞（=0）；芴(=1）与联苯（=0.18）第二十六页，共四十二页，2022年，8月28日刚性结构和共平面性与荧光的关系8—羟基喹啉8—羟基喹啉镁刚性结构和共平面性与荧光的关系第二十七页，共四十二页，2022年，8月28日刚性结构和共平面性与荧光的关系7-二甲胺萘–1-磺酸盐F

=0.758-二甲胺萘–1-磺酸盐F

=0.03空间位阻与荧光的关系第二十八页，共四十二页，2022年，8月28日刚性结构和共平面性与荧光的关系顺反异构与荧光的关系反式结构顺式结构1，2—二苯乙烯第二十九页，共四十二页，2022年，8月28日分子结构与荧光4）取代基：

给电子取代基增强荧光（p-共轭），如-OH、-OR、-NH2、-CN、-NR2等；吸电子基降低荧光，如-COOH、-C=O、-NO2、-NO、-X等；重原子降低荧光但增强磷光，如苯环被卤素取代，从氟苯到碘苯，荧光逐渐减弱到消失，该现象也称重原子效应。第三十页，共四十二页，2022年，8月28日影响荧光的外界因素（一）溶剂效应：

溶剂极性可增加或降低荧光强度（改变—*及n—*跃迁的能量）；与溶剂作用从而改变荧光物质结构来增加或降低荧光强度。第三十一页，共四十二页，2022年，8月28日影响荧光的外界因素（二）温度：温度增加，荧光强度下降（因为内、外转换增加、粘度或“刚性”降低）。因此体系降低温度可增加荧光分析灵敏度。第三十二页，共四十二页，2022年，8月28日影响荧光的外界因素（三）pH值：具酸或碱性基团的有机物质，在不同pH值时，其结构可能发生变化，因而荧光强度将发生改变；对无机荧光物质，因pH值会影响其稳定性，因而也可使其荧光强度发生改变。第三十三页，共四十二页，2022年，8月28日pH<2pH>13pH7~12苯胺第三十四页，共四十二页，2022年，8月28日影响荧光的外界因素（四）内滤光和自吸：体系内存在可以吸收荧光的物质，或荧光物质的荧光短波长与激发光长波长有重叠，均可使荧光强度下降，称为内滤光；当荧光物质浓度较大时，可吸收自身的荧光发射称为荧光自吸。第三十五页，共四十二页，2022年，8月28日影响荧光的外界因素（五）荧光猝灭：碰撞猝灭；静态猝灭；转入三重态的猝灭；电子转移猝灭；自猝灭。第三十六页，共四十二页，2022年，8月28日溶液的荧光荧光定量分析荧光强度与溶液浓度的关系F=FI0CLF—荧光效率—荧光物质的摩尔吸光系数I0—激发光强度L—液层厚度F=KC（该式只有当CL≤0.05时才成立）第三十七页，共四十二页，2022年，8月28日荧光定量分析方法工作曲线法用F~C作图比例法Fs－F0＝KCsFx－F0＝KCx第三十八页，共四十二页，2022年，8月28日仪器与技术荧光计的主要部件1）光源：氙灯、高压汞灯、激光；2）样品池：石英（低荧光材料）；3）两个单色器：选择激发光单色器；分离荧光单色器；4）检测器：光