第七章序列测定

第七章序列测定第一页，共二十四页，2022年，8月28日DNA序列测定：DNAsequencing酶法或末端终止法：由Sanger等人1977年建立；化学法：由MaxamandGilbert等人1977年建立；自动测序系统：在末端终止法基础上发展而来。第二页，共二十四页，2022年，8月28日末端终止法特性：利用DNA聚合酶进行引物延伸反应；其引物是带有放射性标记的，可通过放射自显影检出；双脱氧核糖核苷三磷酸（ddNTP）作为链终止剂；采用聚丙烯酰胺区分长度仅差一个碱基的单链DNA。原理：双脱氧核糖核苷三磷酸（ddNTP）不会与正常的脱氧核糖核苷三磷酸（dNTP）形成磷酸二酯键，从而链的随机终止；建立4个系统，就可得到4个套组（nestedsets）；在一个胶板上同时电泳，就可读出模板链的互补链的顺序。第三页，共二十四页，2022年，8月28日双脱氧核糖核苷三磷酸（ddNTP）第四页，共二十四页，2022年，8月28日DNA的序列测定（1）－－ddNTP法Sanger法第五页，共二十四页，2022年，8月28日第六页，共二十四页，2022年，8月28日第七页，共二十四页，2022年，8月28日化学法测序的基本原理将双链或单链DNA经过不同的化学方法降解，得到随机的短的DNA片段，再通过电泳分离读取顺序。每次只能在一个特定的核苷酸处降解：

G反应：硫酸二甲脂（DMS）使鸟嘌呤N7甲基化；

A+G反应：甲酸使嘌呤环上的氮质子化导致糖苷键被削弱，进而嘌呤环被嘧啶取代；

C+T反应：肼能够裂解嘧啶环，进而导致其脱落；

C反应：在一定浓度的条件下，肼只对胞嘧啶起作用第八页，共二十四页，2022年，8月28日DNA的序列测定（2）－－化学法Maxam/Gilbert法第九页，共二十四页，2022年，8月28日第十页，共二十四页，2022年，8月28日到2030年，预计只要1000美金就能得到个人的基因组序列。

注：人与人之间平均1000个碱基对就有一个碱基呈多态性。因此共有300万碱基上可能存在差异。第十一页，共二十四页，2022年，8月28日DNA序列的自动测定基本原理：末端终止法引物用荧光素标记测序系统由反应系统，电泳系统及驱控系统组成ALFexpressTM全自动激光荧光核酸测序仪400-500bppersampleABI最新型全自动DNA测序仪700bppersample第十二页，共二十四页，2022年，8月28日DNA自动测序原理第十三页，共二十四页，2022年，8月28日第十四页，共二十四页，2022年，8月28日第十五页，共二十四页，2022年，8月28日DNA自动测序工作站第十六页，共二十四页，2022年，8月28日第十七页，共二十四页，2022年，8月28日DNA测序结果第十八页，共二十四页，2022年，8月28日Pyrosequencing:焦磷酸测序法仍然根据碱基互补配对的原则单个核苷酸或碱基按给定顺序发放通过检测焦磷酸发光反应来判断正确的核苷酸顺序

AGGATCTGAGGCAAG

TCCTAGAC…第十九页，共二十四页，2022年，8月28日ANewLightonDNAJoJoGeneCompanyLimited第二十页，共二十四页，2022年，8月28日PPiATPPrincipleofPyrosequencing第二十一页，共二十四页，2022年，8月28日Peakheightisproportionalto

thenumberofincorporatednucleotidesAllele1:ACTGAllele2:GCTGHeterozygotesample:第二十二页，共二十四页，2022年，8月28日AdvantageandBenefitofPyeosequencingFastAccuracyFlexibilityMultiplexingSimpleSequenceEfficientShortOptimizationTimeDedicatedSoftwareDedicatedReagentKitScalable第二十三页，共二十四页，2022年，