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MicroRNA-224promotestumorprogressioninnonsmallcelllungcancer汇报人：李婷MiR-224促进非小细胞肺癌肿瘤形成当前1页，总共58页。点击添加文本点击添加文本点击添加文本点击添加文本目录ContentsintroductionOthersMethodsResultsDiscussion当前2页，总共58页。点击添加文本点击添加文本点击添加文本点击添加文本ResultsConclusionMethods在全世界，肺癌是癌症相关性疾病中主要的致病因。尽管手术及药物治疗水平有所提高，肺癌患者的生存率依然极低。总体来说，分期较早的非小细胞肺癌患者，无论是手术还是非手术患者均得到了控制。然而，非小细胞肺癌导致局部及远处转移的分子机制尚不清楚。

在非小细胞肺癌组织中，我们证实了microRNA-224(miR-224)显著上调，尤其发生转移的组织中。增加miR-224表达水平，其通过以抑癌物质TNFα-inducedprotein1(TNFAIP1)（肿瘤坏死因子介导蛋白1）及SMAD4为靶点，从而促进了细胞的迁移，侵袭及增殖。与体外实验一致，裸鼠异体移植实验也证实了miR-224在体内非小细胞肺癌中作为强力致癌的miRNA。同时，我们还发现了在非小细胞肺癌中，启动子甲基化及ERK信号参与调节miR-224的表达。上调的miR-224通过拮抗SMAD4及SMAD4的抑制作用，从而增强非小细胞肺癌的形成及肿瘤侵袭性。当前3页，总共58页。全基因组miRNA测序miR-224在ADC及SCC中miR-224明显上调体内体外相关分析细胞转染过表达及下调系统细胞系裸鼠miR-224在肺癌中的作用寻找作用靶点TNFAIP1及SMAD4的3′-UTRs共转染3′-UTRs及miRNA转染细胞相关分析TNFAIP1及SMAD4是否为特异性靶点TNFAIP1及SMAD4与miR-224相关性及作用miR-224以TNFAIP1及SMAD4的3’端为作用靶点低甲基化探针相关分析miR-224与启动子甲基化的关系相关分析及细胞系佛脂醇治疗启动子低甲基化及激活的ERK信号通路介导miR-224的表达当前4页，总共58页。点击添加文本点击添加文本点击添加文本点击添加文本ResultsConclusionMethods非小细胞肺癌NSCLC（nonsmallcellLungcancer）非小细胞型肺癌包括鳞癌、腺癌、大细胞癌，与小细胞癌相比其癌细胞生长分裂较慢,扩散转移相对较晚。非小细胞肺癌约占所有肺癌的80%，约75%的患者发现时已处于中晚期，5年生存率很低。MicroRNAs（miRNAs）是在真核生物中发现的一类内源性的具有调控功能的非编码RNA，其大小长约20~25个核苷酸通过碱基互补配对的方式识别靶mRNA，并根据互补程度的不同指导沉默复合体降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻译，参与各种各样的调节途径，包括发育、病毒防御、器官形成、细胞增殖和凋亡等。TNFAIP1（TNFα-inducedprotein1）

肿瘤坏死因子-α（TumorNecrosisFactor，简写TNF）是一种能够直接杀伤肿瘤细胞而对正常细胞无明显毒性的细胞因子。而肿瘤坏死因子介导蛋白1涉及DNA合成及凋亡.SMAD4

Smads家族蛋白在将TGF-β(转化生长因子)信号从细胞表面受体传导至细胞核的过程中起到关键性作用。按功能分为3类：即受体活化型或通路限制性Smad(R－Smads)、共同通路型Smad(Co－Smad)和抑制性Smad(I－Smads)。当前5页，总共58页。ResultsmiR-224上调在非小细胞肺癌中的功能当前6页，总共58页。全基因组miRNA测序倍数变化的miRNAmiR-224技术路线俄亥俄州立大学综合癌症中心癌症和肿瘤基因图谱miR-224在ADC及SCC中的表达原位分子杂交在有转移的肺癌中miR-224的表达生存分析miR-224与肺癌患者的预后肺癌中miR-224的表达水平及是否与转移有关转染细胞统计细胞的迁移、侵袭及增殖能力过表达及降低系统miR-224在肺癌中的作用体外转染细胞皮下注射至裸鼠过表达及降低系统miR-224在肺癌中的作用观察肿瘤体积及镜下改变体内当前7页，总共58页。4例伴淋巴结转移的肺腺癌6例不伴淋巴结转移的肺腺癌genome-widemiRNAsequencing当前8页，总共58页。87例NSCLC48例NAT(正常)在ADC及SCC中，miR-224明显上调OhioStateUniversityComprehensiveCancerCenter(OSUCCC)俄亥俄州立大学综合癌症中心当前9页，总共58页。666例ADC及SCC86例NAT相较于NATs，miR-224在ADC及SCC中明显上调Oftheevaluable468primarylungADCpatients,46patientshadmatchednormaladjacenttissues.Oftheevaluable198primarylungsquamouscarcinomapatients,40patientshadmatchednormaladjacenttissues.TheCancerGenomeAtlas(TCGA)癌症和肿瘤基因图谱当前10页，总共58页。明确分期281例ADCN0143例ADCN1+伴淋巴结转移的患者中，miR-224明显上调miR-224expressionin281N0patientsversus143N1+patientsfromTCGAlungADCdataset当前11页，总共58页。NSCLCNATsmiR-224在61%的病例中过表达51例配对原位分子杂交

在有转移的肺癌中，miR-224表达更强

miR-224可能在有转移的肺癌中起到重要作用Summaryoftissuemicroarraydataforlungcancerandcorrespondingnormaltissue.PairedanalysisrepresentssubtractionofNATstainingscorefrommatchedlungcancertissuescores.当前12页，总共58页。miR-224表达与生存之间并无明显联系642例NSCLCKaplan–Meier生存分析TCGA当前13页，总共58页。miR-224与有(kras)/p53突变肺腺癌患者的不良预后明显相关59例ADCKaplan–Meier生存分析同样地在有(kras)/p53突变肺腺癌患者中，相较N0组，可观察到N1+组

的miR-224expression表达上调，miR-224expressionin31N0patientsversus26N1+patientsfromlungADCpatientswhohaveTP53and/orKRASmutations.当前14页，总共58页。H1299H1573H460miR-224过表达

转染含miR-224前体的Lenti-miR载体A549miR-224下调转染含miRZip-224anti–miR-224结构的载体RT-PCR当前15页，总共58页。H1299H1573miR-224过表达H1299andH1573细胞的迁移，侵袭及增殖明显增加CellmigrationassayformiR-224–overexpressingH1299andH1573cellsusingtranswellmembranesCellinvasionassay

formiR-224–overexpressingH1299andH1573cellsCellproliferationassayformiR-224–overexpressinglungcancercells当前16页，总共58页。迁移细胞计数H460MigratedcellcountsafteroverexpressingmiR-224inH460MigratedcellcountsafterknockdownmiR-224inA549cellsMigratedcellcountsafteroverexpressingmiR-224inH1299(e),H1573(f),H1299及H1573当前17页，总共58页。A549migrationassayformiR-224knockdownA549cellsCellproliferationassayformiR-224knockdownA549cellsMigratedcellcountsafterknockdownmiR-224inA549cells.当前18页，总共58页。H460/miR-224

对照组细胞系或A549/miRZip224皮下注射至裸鼠侧面相较于对照组细胞，

过表达miR-224的H460细胞系

显著增加了体内的肿瘤增长当前19页，总共58页。下调A549细胞中的miR-224皮下注射至裸鼠侧面肿瘤体积减少在肺癌中miR-224作为致癌miRNA.当前20页，总共58页。镜下当前21页，总共58页。ResultsmiR-224以TNFAIP1及SMAD4的3’端为靶点当前22页，总共58页。技术路线生物信息分析TNFAIP1及SMAD4的3′-UTRs寻找靶点共转染3′-UTRs及miRNA是否为靶点免疫荧光共转染突变3′-UTRs及miRNA靶点特异性免疫荧光TNFAIP1及SMAD4是否为特异性靶点过表达及降低系统miR-224对靶蛋白的影响OSUTCGA数据库检测TNFAIP1及SMAD4表达相关分析TNFAIP1及SMAD4与miR-224相关性转染细胞miR-224的促癌作用是否由于与靶基因TNFAIP1及SMAD4结合并降低抑癌作用过表达及降低系统转染SMAD4至过表达miR-224细胞评估SMAD4作用TGF-β治疗miR-224是否通过以SMAD4为靶点而影响TGF-β信号通路当前23页，总共58页。3′-UTRs的荧光信号持续性减低3′-UTRsmiR-224mimics293Tcells共转染miR-2243′-UTRs的突变形式野生型3′-UTRs的荧光信号持续性减低的趋势减弱野生型的及

突变的TNFAIP1andSMAD43′-UTRs与withmiR-224mimic共转染至293T细胞miRNAand3′-UTRs靶点的特异性.当前24页，总共58页。在H1299,H1573,和H460细胞系中，mRNAand蛋白质的TNFAIP1andSMAD4表达

减少过表达miR-224WesternblotandquantitativeRT-PCR检测转染了表达miR-224前体的及对照载体的肺癌胞中，TNFAIP1及SMAD4蛋白及mRNA水平当前25页，总共58页。在A549细胞中，TNFAIP1及SMAD4mRNA蛋白质水平表达增加下调miR-224WesternblotandquantitativeRT-PCR检测转染了表达

下调miR-224的及对照载体的肺癌胞中，TNFAIP1及SMAD4蛋白及mRNA水平检测miR-224对

靶蛋白及靶mRNA的影响当前26页，总共58页。TNFAIP1(P=4.9E-15)andSMAD4(P=2.2E-16)表达显著降低TNFAIP1和SMAD4表达降低原发性肺鳞癌组织,TNFAIP1和SMAD4减少.334ADC&57NATs349SSC&51NATsTCGAdataset当前27页，总共58页。NSCLC中TNFAIP1(5.23E-14)andSMAD4(2.67E-06)的表达下降TNFAIP1andSMAD4expressionsin63NSCLCpatientswith48matchedNATsfromOSUcohort63例NSCLC&48NATs当前28页，总共58页。111例NSCLCOSU306例NSCLCTGGAPearson相关分析miR-224与TNFAIP1andSMAD4呈负相关OSUcohortTCGA

当前29页，总共58页。TNFAIP1下调增加H460的迁移及增值能力

knockdownH460cellsusingtranswellmembranesmigrationassayforTNFAIP1forTNFAIP1knockdownH460lungcancercells.CellproliferationassayWesternblotanalysescellmigrationassay当前30页，总共58页。TNFAIP1下调增加H1299的迁移及增值能力

CellproliferationassayforTNFAIP1knockdownH1299lungcancercellsCellmigrationassayforTNFAIP1knockdownH1299cellsusingtranswellmembranes当前31页，总共58页。在用TNFα治疗后，相较H1299/miRCont细胞，H1299/miR-224细胞

中poly(ADP-ribose)polymerase1(PARP1)表达水平减少WesternblotanalysisH1299/miR-224andH1299/miRContcells用及不用TNFα处理4hCellproliferationassayforH1299/miR-224andH1299/miRContcells用及不用TNFα处理4h.在H1299细胞中，miR-224明显减缓TNFα介导的生长抑制

miR-224通过以

肺癌中的TNFAIP1为靶点参与TNFα介导的凋亡当前32页，总共58页。稳定过表达miR-224的肺癌细胞中转染SMAD4H1299andH1573肺癌细胞中均减弱了介导的增加增殖及迁移的能力proliferationassayandmigrationassayofmiR-224–overexpressingcellstransfectedwithSMAD4oremptyvectorWesternblotanalysisofmiR-224overexpressingcellstransfectedwithSMAD4(donotcontain3’UTR)oremptyvectorcellmigrationassayformiR-224overexpressingcellstransfectedwithSMAD4oremptyvector当前33页，总共58页。用TGF-β处理miR-224过表达组及对照组细胞

在H460细胞中，miR-224明显损害了TGF-β介导的SMAD4细胞核转录作用

miR-224明显减弱了TGF-β介导的对细胞生长及迁移能力的抑制作用miR-224以SMAD4为靶点在TGF-β信号通路中起到重要作用当前34页，总共58页。Results启动子低甲基化及激活的ERK信号通路介导miR-224的表达当前35页，总共58页。技术路线低甲基化探针检测miR-224启动子甲基化水平miR-224与启动子甲基化的关系甲基化特异高分标率溶解分析重硫酸盐序列验证TCGA数据库相关分析TCGA数据库检测ERK及miR-224表达是否相关相关分析细胞系佛脂醇治疗免疫荧光等检测miR-224是否受ERK信号通路调控当前36页，总共58页。miR-224,miR-452及GABRE的标准化表达值从TCGA数据库中提取出并进行Pearson相关分析miRNA表达受表观遗传修饰及转录激活控制。miR-224andmiR-452位于宿主基因γ-AminobutyricAcidAReceptor(GABRE)内显子5上，并且GABRE启动子

区域有CpG岛图式结构

显示miR224~miR452~GABRE的基因位点。miR-224andmiR452位于GABRE的6内显子.TSSi显示假定的转录位点。黑色区域显示CpG岛延伸到GABRE的外显子1正相关这三个基因受相同的启动子调节当前37页，总共58页。选择位于CpG岛位于启动子区域的9个甲基化探针,Pearson相关分析ADC(n=221)SCC(n=125)8个探针均显示在NSCLC中与miR-224表达的负相关miR-224andmethylationprobecg27049053in(A)lungADCand(B)SCC.启动子甲基化在抑制miR-224转录中起重要作用当前38页，总共58页。甲基化特异高分标率溶解分析469NAT489NATA549H647469NAT及485NAT细胞10–30%甲基化

，两个肺癌细胞系中0%甲基化meltingcurvesfromeachcellline--greenstandardmeltingcurves--orange当前39页，总共58页。重硫酸盐序列469NAT489NAT证实了正常肺组织中每个CpG甲基化水平用脱甲基化试剂5-aza-CdR处理3天miR-224表达水平增加非小细胞肺癌中，miR-224启动子相关CpG岛的低甲基化水平的部分原因是由于肺癌中的miR-224高表达。当前40页，总共58页。前期研究我们观察到一个趋势：相较野生型的肺癌细胞系，有RAS突变的肺癌细胞系中miR-224的表达更高。当前41页，总共58页。188例ADC总ERK2蛋白与miR-224表达水平之间存在显著正相关当前42页，总共58页。用佛脂醇活化ERK1/2H460A549相较不使用佛化醇治疗的肺癌细胞系，使用佛脂醇的细胞系中miR-224的表达均明显上调A549H460当前43页，总共58页。用佛脂醇活化

ERK1/2H460A549包含miR-224启动区域的荧光素酶显著增加了荧光素酶活性，在PMA治疗后更加明显miR-224可能被ERK信号通路调控当前44页，总共58页。点击添加文本点击添加文本点击添加文本点击添加文本目录ContentsintroductionOthersMethodsResultsDiscussion当前45页，总共58页。Discussion

大多数的人类恶性肿瘤均与异常表达的miRNA有关，有一部分miRNA作为致癌因子，另一部分作为抑癌因子。大多数报道指出，包括肝细胞癌，结直肠癌，乳腺癌等在内的实体瘤均与miR-224的上调有关

最近有研究显示，miR-224在非小细胞肺癌中具有致癌的生物学价值。当前46页，总共58页。

Kaplan–Meier生存分析显示miR-224表达与非小细胞肺癌生存率并无显著联系，可能由于分期不同，接受治疗不同。

亚组分析指出miR-224与有kras/p53基因突变的ADC患者预后差有关

miR-224作为致癌的miRNA，通过以TNFAIP1andSMAD4为靶点促进癌细胞的迁徙，增殖及侵袭TNFAIP1在ADC及SCC中明显下调，并且，miR-224与非小细胞肺癌中的TNFAIP1水平呈明显负相关。miR-224通过以TNFAIP1为靶点，减弱了由TNFα介导的细胞生长抑制作用。Discussion当前47页，总共58页。SMAD4的缺失对TGF-β的信号活化起到重要作用，非小细胞肺癌的异常的SMAD4表达机制尚未明确。在非小细胞肺癌中，SMAD4的缺失可能归因于miR-224的异常表达。我们观察到，与正常组织相比，非小细胞肺癌中的SMAD4呈现出下调，并且与miR-224呈明显负相关。肺癌细胞中，过表达的SMAD4明显减弱了miR-224介导的增殖和迁徙，且miR-224通过抑制细胞核内的SMAD4转录从而参与TGF-β信号通路。

综上，我们实验指出miR-224介导的TNFAIP1及SMAD4减少是由于非小细胞肺癌的侵袭和过程。Discussion当前48页，总共58页。miR-224的启动子区域有CpG岛，我们假设miR-224的表达可能涉及启动子甲基化。为了验证，我们采用了MS-HRM分析及重硫酸盐序列方法，在正常肺组织中发现了甲基化，而在两个肺癌细胞系中并未发现。探针cg27049053在肺鳞癌及肺腺癌中的甲基化与miR-224呈明显负相关。此外，用5-aza-CdR治疗后的肺非正常组织显著修复了miR-224表达。miR-224的上调表达可能是由于miR-224启动子的甲基化Discussion当前49页，总共58页。KRAS基因在肺鳞癌中很常见，为验证ERK信号通路的活化状态是否与miR-224的表达增