第三章植物脱毒技术

第三章植物脱毒技术第一页，共四十七页，2022年，8月28日第一种类型为曾经或正在大面积或高比率发生，并造成严重为害的植原体病害，主要包括枣疯病和泡桐丛枝病。第二类型为局部或零星发生病害类型，山楂丛枝病严重地区约占20%左右。桃树黄化病和红叶病的发生面积较大，

第三种类型为国内外引种或国内苗木调运而传入病害类型，比较典型的为从以色列引进的樱桃扁枝病和黄化病。1995年北京中以示范农场从以色列引进一年生的经嫁接的6个欧洲樱桃品系的苗木3500株，栽植当年即发现患带化病苗木，1995～1996年度的发病率为3%。在从国内其它地区引入的樱桃、枣树、泡桐等新品种苗木上也都发现带病苗木。

第一节

植物脱毒的意义一、病毒病危害第二页，共四十七页，2022年，8月28日二、植物脱毒的意义

“脱毒苗”或“无病毒苗”，是指不含有该种植物的主要危害病毒，即经检测主要病毒在植物体内的存在表现为阴性反应的苗木。通过植物组织培养方法生产无病毒种苗可以同时除去真菌、细菌和线虫的寄生，因此产量大幅度增加，最高可增产300％，平均增产也在30％以上。枣疯病辣椒病毒病番茄病毒病第三页，共四十七页，2022年，8月28日第二节植物脱毒方法一、茎尖分生组织培养脱毒二、热处理脱毒三、热处理结合茎尖脱毒四、其它脱毒方法第四页，共四十七页，2022年，8月28日一、茎尖分生组织脱毒(一）通过茎尖培养脱毒的原理1、病毒在植物体内的分布茎尖和根尖分生组织不含病毒粒子或病毒浓度很低，是因为病毒在寄主植物体内随着维管系统转移，在根尖与茎尖分生组织中没有维管束系统，病毒运动很困难。病毒在寄主茎尖分生组织中的转移速度落后于茎尖的生长速度，导致顶端分生组织附近病毒浓度低，甚至不带病毒，通过茎尖（根尖）离体培养便可获得无病毒再生植株。2、茎尖大小与脱毒效果用于脱毒的茎尖外植体可以是顶端分生组织即生长点，最大直径0.1mm，也可以是带1－3个叶原基的茎尖。茎尖外植体的大小与脱毒效果成反比。外植体过小，存活困难，生长缓慢，操作难度大。但茎尖外植体过大，脱毒效果差。通常以带1－3个幼叶原基的茎尖作外植体较合适。第五页，共四十七页，2022年，8月28日第六页，共四十七页，2022年，8月28日第七页，共四十七页，2022年，8月28日第八页，共四十七页，2022年，8月28日第九页，共四十七页，2022年，8月28日（二）茎尖脱毒的方法1、取样与消毒取病害相对较轻的植株，可以从选定的植株上取顶芽梢段进行消毒接种。也可从室内培养1－2个月并进行热处理的盆栽扦插苗上，采顶芽与侧芽消毒接种，消毒方法：取顶芽梢段3－5cm，剥去大叶片，自来水冲洗，75％酒精浸泡30秒左右，用0.1％升汞消毒10分钟，最后用无菌水冲洗4－5次。第十页，共四十七页，2022年，8月28日2、拨取茎尖与接种在超净工作台上，用解剖刀将仔细剥离幼叶，至出现裸露的生长点，用刀尖切下带1－2个叶原基的生长点，将切下的茎尖转移至培养基上，每管接1－2个茎尖。第十一页，共四十七页，2022年，8月28日第十二页，共四十七页，2022年，8月28日第十三页，共四十七页，2022年，8月28日第十四页，共四十七页，2022年，8月28日3、培养接种后的材料在25±2℃，每天光照10－16h条件下培养。培养2个月左右，在茎尖再生出小绿芽，小的茎尖则需3个月以上，有的甚至更长时间才发生绿芽。其间应更换新鲜培养基。4、生根诱导一些植物茎尖培养形成绿芽后，基部很快发生不定根，而另一些植物不产生不定根，必须将无根绿苗再诱导，才能生根成为完整植株。方法：将2－3cm高的无根苗转入生根培养基，继续培养1－2个月即可形成根。第十五页，共四十七页，2022年，8月28日茎尖培养脱毒过程图

第十六页，共四十七页，2022年，8月28日茎尖剥离（1）第十七页，共四十七页，2022年，8月28日茎尖剥离（2）第十八页，共四十七页，2022年，8月28日第十九页，共四十七页，2022年，8月28日（三）影响茎尖脱毒培养的因素（1）茎尖大小：茎尖大小与脱除病毒的效果成反相关，即剥取茎尖越小，脱毒效果越好。但茎尖大小与茎尖的成活率成正相关，即茎尖越小培养难度越大，成活率越低。考虑到脱毒效果及提高成活率，一般切取0.2～0.5mm带1～2个叶原基的茎尖为培养材料。（2）培养条件：在茎尖培养中，光下培养的效果通常比暗培养效果好。（3）外植体的生理状态：茎尖最好从活跃生长的芽上切取，一般地培养顶芽茎尖比培养腋芽茎尖效果好。第二十页，共四十七页，2022年，8月28日二、热处理脱毒1.原理利用病毒耐热性差的特点，将植物组织置于高于正常温度的环境中，组织内部的病毒受热以后部分或全部钝化，但寄主植物的组织很少或不会受到伤害。第二十一页，共四十七页，2022年，8月28日2.热处理的方法(1)温汤浸渍处理适用于休眠器官、剪下的接穗或种植材料的脱毒处理。方法是将材料放在50～55℃的温水中浸渍数分钟至数小时。此方法简便易行，但易造成材料受伤。(2)热空气处理适用于生长期植物材料的脱毒处理。设备可采用有照明、通风、调温、给水动能的培养箱。方法是将待处理植株先进行盆栽，成活后移入35～40℃的培养箱中处理几十分钟至几个月。第二十二页，共四十七页，2022年，8月28日3.热处理脱毒的优点与局限性(1)优点：对设备要求不高，技术简单，短时间可除去病毒。(2)局限性：●热处理不能脱除所有病毒，此法只对那些球形病毒和线形病毒有效。而对杆状病毒不起作用。●同时同样的处理效果也不一样（具有不确定性）。●对植株有伤害，只有部分植株成活。●对寄主植物进行较长时间的高温处理有可能钝化植物组织中的阻抗因子，使寄主植物中抗病毒因子难于活化，从而增加无效植株的发生率。第二十三页，共四十七页，2022年，8月28日三、热处理结合茎尖脱毒1把切取的草莓芽洗净后2先经过高温短时间热处理，杀死部分病毒；3然后在无菌条件下对经过处理的材料，在解剖镜下解剖，4切取分生组织尖端0.2-0.3mm生长点，5迅速接种到最佳启动培养基上，在25℃下暗培养。6待长出愈伤组织后转入光培养，7接种到另一种丛芽培养基上，即产生丛生芽及绿苗。8将绿苗接种在生根培养基上，920天后待根长2-5cm时即可炼苗移栽，成活率达到95%以上。

第二十四页，共四十七页，2022年，8月28日四、其它组织培养脱毒方法（一）愈伤组织培养脱毒将感染病毒的组织离体培养获得愈伤组织，再诱导愈伤组织分化成苗，从而获得无病毒植株的方法（二）珠心胚培养脱毒柑橘类种子多为多胚种子，除具有合子胚外，还有多个珠心胚。珠心胚由珠心组织细胞即体细胞分化形成，具有和母体相同的遗传特性。病毒一般不通过种子传播，因而通过珠心胚培养获得的再生植株是无毒的，同时保存了母株的遗传特性。第二十五页，共四十七页，2022年，8月28日（三）茎尖微体嫁接第二十六页，共四十七页，2022年，8月28日试管内嫁接法接穗砧木培养基无毒苗微枝茎尖第二十七页，共四十七页，2022年，8月28日（四）花药培养脱毒草莓花药培养可产生无病毒植株。草莓花药培养脱毒率高于茎尖脱毒苗率，一般可达80％以上，有些报道可达100％

第二十八页，共四十七页，2022年，8月28日（五）低温处理低温处理又称冷疗法。适当增加低温处理时间可提高脱毒效果。菊花植株在5℃下，经4－7.5个月处理后，切取茎尖进行离体培养，可以有效去除菊花矮化病毒与菊花褪绿斑驳病毒，仅茎尖培养则无此效果，目前低温脱毒的报道尚少，但不失为一种脱毒的方法。第二十九页，共四十七页，2022年，8月28日（六）化学处理许多化学药品（包括嘌呤、嘧啶类似物、氨基酸、抗菌素等）在植物体内和植物叶片内，进行其抑制病毒的增殖或使之不活化的测定，在某种程度上抑制了病毒的增值或不活化。整株植物用化学疗法不能除去病毒，但离体培养和原质体培养效果明显。第三十页，共四十七页，2022年，8月28日第三节脱毒苗的鉴定（一）指示植物检测法（二）抗血清检测法（三）酶联免疫吸附检测法（四）其它鉴定方法第三十一页，共四十七页，2022年，8月28日（一）指示植物检测法指示植物检测是利用病毒在植物体上产生的枯斑作为鉴别病毒种类的依据，也叫枯斑测定法。这种专门用以产生局部病斑的寄主称为指示植物，又称鉴别寄主。第三十二页，共四十七页，2022年，8月28日1.汁液涂抹法：待鉴试管苗取幼叶1-3g加水和磷酸缓冲液研磨纱布过滤指示植物上涂一薄层金刚砂手指蘸滤液摩擦5min后冲去叶面汁液和金刚砂至于温室中2-6天观察没有出现不含病毒出现枯斑有病毒第三十三页，共四十七页，2022年，8月28日2.嫁接鉴定法：

适用于木本多年生果树和草莓、甘薯等无性繁殖的草本植物，采用汁液接种法比较困难，通常采用嫁接接种的方法，以指示植物作砧木，被检测植物作接穗，可采用劈接、靠接、芽接等方法嫁接。第三十四页，共四十七页，2022年，8月28日对指示植物的要求应根据不同的病毒选择适合的指示植物。所选指示植物一年四季都容易栽培。能够在较长时期内保持对病毒的敏感性。容易接种。较广的范围内具有同样的反映。指示植物一般有两种类型：一种是接种后产生系统性症状，其出现在病毒扩展到的植物非接种部位，通常没有局部病斑明显；另一种是只产生局部病斑，常由坏死、褪绿或环斑构成。第三十五页，共四十七页，2022年，8月28日指示植物检测法的优缺点

(1)优点：条件简单，操作方便，是一种经济有效的检测方法，所以大多数植物检测用指示植物检测法。(2)缺点：不能测出病毒总的核蛋白浓度，而只能测出病毒的相对感染力。第三十六页，共四十七页，2022年，8月28日（二）抗血清检测法抗体是动物在外来抗原的刺激下产生的一种免疫球蛋白，抗体主要存在于血清中，含有抗体的血清即称为抗血清。不同病毒产生的抗血清都有各自的特异性，因此抗血清在病毒的检测中成为一种高度专化性的试剂，其特异性高，检测速度快，一般几小时甚至几分钟可以完成。第三十七页，共四十七页，2022年，8月28日1.检测方法抗原的制备：病毒的接种繁殖→病叶的研磨→病毒的提纯。抗血清的制备：动物的选择和饲养→抗原的注射→抗血清的采集（采血）→抗血清的分离→抗血清的保藏。抗血清检测（免疫反应）：有叶绿体凝聚法、块茎沉淀法、环形接口法、酶联免疫法等方法。第三十八页，共四十七页，2022年，8月28日2.抗血清检测法的优缺点(1)优点：特异性强，灵敏度高；操作简便、安全、快速；无需特殊仪器设备，结果容易判断；可同时检测大量的样品。(2)缺点：抗血清来源困难，成本高，常规检测应用较少。第三十九页，共四十七页，2022年，8月28日（三）酶联免疫吸附检测法

第四十页，共四十七页，2022年，8月28日第四十一页，共四十七页，2022年，8月28日（四）其它鉴定方法

病毒颗粒一般小于0.1um的微粒，人的眼睛观察不到，光学显微镜仅观察200nm的微粒，而电子显微镜则将分辨能力增大至0.5nm。通过电子显微镜在病毒的薄样品或部分纯化的病毒悬浮液中容易观察到。采用电子显微镜法鉴定病毒，直接观察有无病毒颗粒存在，并观察有关病毒颗粒大小、形状和结构，由于这些特征稳定，对病毒鉴定有很大的作用。这种检测方法，需要一定的设备，常规检测应用较少。1、电镜检测法第四十二页，共四十七页，2022年，8月28日2、分子生物学检测法待测脱毒植物病毒总DNA序列ACGGGTTATCGGTCGAATAACACGGGCAATTTTACGATTAGACTAACGGGGAGAC

TGCCCAATAGCCA引物

TGCCC随机引物ACGGGTTATCGGTCGAATAACACGGGCAATTTTACGATTAGACTAACGGGGAGACTGCCCAATAGCCAGCTTATTGTGGCCCTTAAAATGCTAAT

TGCCCTGCCCACGGGTTATCGGTCGAATAACACGGGCAATTTTACGATTAGACTAACGGGGAGACTGCCCAATAGCCAGCTTATTGTGCCCGTTAAAATGCTAATCTGATTGCCCCTCTGTGCCCTGCCCTGCCC（1）PCR检测法第四十三页，共四十七页，2022年，8月28日病毒标准谱带待测植物谱带A随机引物B已知引物1kb300025001500800400100病毒标准谱带待测植物谱带12345678待测植物无谱带琼脂凝电泳板琼脂凝电泳板+-第四十四页，共四十七页，2022年，8月28日（2）核酸杂交技术(NAH)

NAH技术是根据单链可以相互结合的原理，将一段病毒特异的核酸序列加以标记制成探针，再与待测样品的核酸杂交，杂交信号能指示病毒的存在。核酸杂交技术适用于DNA、RNA病毒及类病毒的检测，具有灵敏度高、特异性强、通量高的特点。目前根据病毒检测的需要，可以制备用于检测单一病毒的单特异性探针和用于检测多种病毒的复合探针。包括核酸斑点杂交技术、核酸狭缝印迹杂交技术、Northern印迹等技术被广泛应用于植物病毒的检测。（3）双链RNA(dsR