高级生物化学蛋白质性质和分离

关于高级生物化学蛋白质性质和分离第一页，共一百六十五页，编辑于2023年，星期四一、蛋白质的变性与复性蛋白质在某些物理和化学因素作用下，其特定的空间构象被破坏，也即有序的空间结构变成无序的空间结构，从而导致其理化性质改变和生物活性的丧失。1.蛋白质变性的概念2.变性的本质次级键（有时包括二硫键）被破坏，天然构象解体。变性不涉及一级结构的破坏DenaturationP233第二页，共一百六十五页，编辑于2023年，星期四3.变性理论

1931年，我国生物化学前辈吴宪提出了“蛋白质变性后，其肽链由原来紧密有序的构象变成了松散无序的构象”。这就是变性作用，并且认为天然蛋白质的紧密构造及晶体结构是由分子中的次级键互相联系而形成的，所以容易被物理的和化学因素所破坏，这个观点反映了蛋白质变性本质。4.

变性的因素①物理因素：高温、高压、紫外线、电离辐射、超声波②化学因素：强酸、强碱、有机溶剂、重金属盐等。（如十二烷基硫酸钠即SDS、尿素、盐酸胍）变性理论和变性的因素第三页，共一百六十五页，编辑于2023年，星期四变性的因素作用机理清洁剂丙醇丙酮凝结使纠缠第四页，共一百六十五页，编辑于2023年，星期四常用的变性剂：尿素尿素：与多肽主链竞争氢键；增加非极性侧链在水中的溶解度，从而降低疏水相互作用。尿素或者胍第五页，共一百六十五页，编辑于2023年，星期四变性剂：十二烷基硫酸钠（SDS）第六页，共一百六十五页，编辑于2023年，星期四5、变性蛋白质的特性生物活性丧失或者降低，如：Hb变性不能输送O2,酶变性失去催化作用。物性理质改变，如：溶解度降低，粘度升高，密度降低，失去结晶能力，旋光值改变，光谱发生变化。(分子量不变）化学性质改变，如结构的伸展松散而暴露，易与化学试剂反应，易为蛋白质水解酶所分解。

制备活性蛋白质时严防蛋白质变性。第七页，共一百六十五页，编辑于2023年，星期四1.酶在有底物存在时比没有底物存在时更稳定，解释原因？-2012年山东大学生物化学2.二硫键多蛋白质难变性3.胶原蛋白有特殊共价键4.纯化一个耐热稳定的酶是否需要低温处理？5、一般的酶都是低温保存，但低温不稳定性酶在低温时变性，推测其机理。-2012年中山大学生物化学6.酶敏感性的概念？思考题第八页，共一百六十五页，编辑于2023年，星期四思考题临床医学上，变性因素常被应用来消毒及灭菌。此外,防止蛋白质变性也是有效保存蛋白质制剂（如疫苗等）的必要条件。误服重金属解毒方式?长期从事重金属作业的人吃高含蛋白质类食物？

一种发生在蛋白质内部的Ala-Val突变导致蛋白质丧失活性，然而，如果这种蛋白质在第二位置发生Ile-Gly的突变，可使蛋白质恢复活性，试提出一种合理的解释。

-江南大学2009年生物化学第九页，共一百六十五页，编辑于2023年，星期四思考题

蛋白质变性后的现象

-2011四川大学生物化学第十页，共一百六十五页，编辑于2023年，星期四核酸的变性(一)、DNA的变性(denaturation)1

定义：在某些理化因素作用下，DNA双链解开成两条单链的过程。2

方法：过量酸，碱，加热，变性试剂如尿素、酰胺以及某些有机溶剂如乙醇、丙酮等3变性后其它理化性质变化：OD260增高 粘度下降

比旋度下降 浮力密度升高酸碱滴定曲线改变 生物活性丧失DNA的变性是爆发式的P508第十一页，共一百六十五页，编辑于2023年，星期四增色效应

增色效应：DNA变性后对260nm紫外光收增加的现象。

DNA分子中碱基间电子的相互作用是紫外吸收的结构基础，但双螺旋结构有序堆积的碱基又“束缚”了这种作用。变性DNA的双链解开，碱基中电子的相互作用更有利于紫外吸收，故产生增色效应。不同来源DNA的变化不一，如大肠杆菌DNA经热变性后，其260nm的光密度值可增加40%以上，其它不同来源的DNA溶液的增值范围多在20~30%之间。

假定一个DNA大分子最初全部是双螺旋结构，在热变性后A260nm上升30%以上第十二页，共一百六十五页，编辑于2023年，星期四DNA和蛋白质变性的比较

DNA降解：指多聚核苷酸中的磷酸二酯键断裂，使分子量下降，其过程不可逆。DNA变性：空间结构遭到破坏，一级结构完好共价键完好，一般是可逆的。比较DNA和蛋白质变性的异同-2012中南大学生物化学第十三页，共一百六十五页，编辑于2023年，星期四

4、DNA的熔解温度（Tm）TmDNA的变性是爆发式的，变性作用发生在一个很窄的温度范围内。第十四页，共一百六十五页，编辑于2023年，星期四

DNA的熔解温度（Tm）：（1）定义：DNA的双螺旋结构失去一半时对应的温度。

变性剂如甲酰胺、尿素、甲醛等破坏氢键，妨碍碱基堆积，使Tm下降。DNA的Tm一般在82—95℃之间（2）影响DNA熔解温度Tm值的因素:①DNA均一性：

②G-C含量：G-C含量与Tm值成正比。③介质中离子强度：第十五页，共一百六十五页，编辑于2023年，星期四1、概念:若蛋白质变性程度较轻，去除变性因素后，可缓慢地重新自发折叠成原来的构象，恢复或部分恢复其原有的构象和功能，称为复性(renaturation)

这种变性也称为可逆变性。2、方法：透析或超滤除去变性剂，或稀释3、举例：有些蛋白质的变性作用是可逆的，其变性如不超过一定限度，经适当处理后，可重新变为天然蛋白质。

7、蛋白质的复性第十六页，共一百六十五页，编辑于2023年，星期四牛胰核糖核酸酶变性和复性第十七页，共一百六十五页，编辑于2023年，星期四1DNA复性(renaturation)的定义

在适当条件下，变性DNA的两条互补链可恢复天然

的双螺旋构象，这一现象称为复性。

热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，这一过程称为退火(annealing)。2DNA复性后的理化性质变化减色效应:DNA复性时，其溶液OD260降低DNA的复性粘度上升浮力密度降低生物活性部分恢复第十八页，共一百六十五页，编辑于2023年，星期四热变性DNA在缓慢冷却时可以复性，快速冷却不能复性。

①序列简单的分子复性快，如poly(dT)和poly(dA)识别快②DNA片段愈大，扩散速度愈低，复性慢③离子强度↑→有利于复性④DNA浓度↑→复性↑复性速度与DNA的浓度成正比

⑤

环状DNA易复性一般认为比Tm低25℃左右的温度是复性的最佳条件，越远离此温度，复性速度就越慢影响复性的因素第十九页，共一百六十五页，编辑于2023年，星期四复性速度可用Co·t衡量Cot1/2值：（1）概念：当C/CO＝１/2时的Cot值定义为Cot1/2值，

Cot1/2＝１/K，即复性一半时的Cot值.（2）影响Cot1/2值的因素：不同的DNA

的Cot1/2值是不同的与k值有关；而且DNA分子序列的复杂性影响K值．DNA分子序列的复杂性（X值）：

(1)定义为：最长的没有重复序列的核苷酸对的数值．

如（ATATAT）,其X值为2,（ATGC）（ATGC）n的X值为4．(2)X值与Cot1/2值的关系，X=K·Cot1/2

Cot1/2是与基因组的大小成正比的第二十页，共一百六十五页，编辑于2023年，星期四Cot1/2

表明基因组所包含不同序列的总长度复性的Cot1/2

与其复杂度成正比。任何DNA

的复杂度可以通过与复杂度已知的DNACot1/2

比较得出。通常以大肠杆菌DNA

作为标准。假设4.2×106

bp

大肠杆菌基因组由不同序列组成第二十一页，共一百六十五页，编辑于2023年，星期四（1）阳离子可以中和DNA中所带负电荷的磷酸基团，减弱DNA链间的静电作用，促进两条互补的多核苷酸的相互靠近，从而促进DNA的复性。（2）温度升高可使DNA变性，因此温度降低到熔点以下可以促进DNA的复性。（3）DNA链的浓度增加可以加快互补链随机碰撞的速度，从而促进DNA的复性。试述下列因素如何影响DNA的复性过程。(1)阳离子的存在(2)低于Tm的温度(3)高浓度的DNA链思考第二十二页，共一百六十五页，编辑于2023年，星期四

在复性反应中如何知道单链已经结合成双链了呢可以通过哪些法来检测？

(1)减色效应(hpochromiceffcef)

测定光密度,即OD值(opticaldensity),DNA从单链变成双链，OD260减少30%

(2)羟基磷灰石柱层析

羟基磷灰石对双链DNA吸附较牢,不易吸附单链

思考判断：蛋白质构象变化是分子内的共价键断裂导致的。厦门大学2009年生物化学考研试题厦第二十三页，共一百六十五页，编辑于2023年，星期四蛋白质变性后，其性质有哪些变化？并解释

四川大学2011、厦门大学2005生物化学2.蛋白质变性主要由于氢键的破坏这一概念是由Anfinsen提出来的（是非题-）复旦大学2000年3.蛋白质变性的实质是非共价键断裂，天然构象解体，但共价键未发生断裂。（是非题

-）中国科学院06年4.1所有变性蛋白质都可以复性。（是非题-）4.2核酸变性后对紫外光的吸收能力增强。（是非题+）4.3核酸热变性有何特点？Tm值和Cot值分别表示什么？各有何应用价值？华东师范大学2006年思考题第二十四页，共一百六十五页，编辑于2023年，星期四

江苏大学2004年硕士研究生入学考试生物化学试卷5.1核酸变性或降解时，出现减色效应。（是非题-）5.2结晶蛋白质都是变性蛋白质。（是非题-）5.3盐析法可使蛋白质沉淀，但不引起变性，所以常用于蛋白质的分离和纯化。（是非题+）5.4蛋白质的变性是蛋白质分子立体结构的破坏，因此常涉及肽键的断裂。（是非题-）5.5变性DNA的复性与

、

、

、

、

等有关。思考题第二十五页，共一百六十五页，编辑于2023年，星期四6．下列关于蛋白质变性的叙述，哪项是错误的（）?

A．生物活性降低或丧失

B．蛋白质空间构象破坏

C．280nm光吸收反应增强

D．溶解度增加

E．易被蛋白酶水解江苏大学医学院2005年医学生物化学（硕士）7.双链DNA分子中GC含量越高，Tm值就越大（判断？）

复旦大学2000年8.DNA的Tm值（）

A.只与DNA链的长短有直接关系

B.与GC碱基对的含量成正比

C.与AT碱基对的含量成正比D.与碱基组成无关

E.所有真核生物Tm都一样湛江海洋大学2003年

思考题第二十六页，共一百六十五页，编辑于2023年，星期四8．中山大学生物化学试题8.1变性温度与DNA分子中的G－C含量成()关系8.2尿素是蛋白质的变性剂，高浓度尿素可拆开蛋白质分子中的二硫键。(判断正误题)

8.3简述导致蛋白质变性的原因。在实验操作中，可采取哪些手段减少蛋白质分离纯化过程中的变性机会？

8.4酶的抑制剂通过使酶蛋白变性而引起酶活力的降低或失活(判断正误题)。9.一段DNA的Tm为83摄氏度，求ATCG百分比？-厦大2012生化思考题第二十七页，共一百六十五页，编辑于2023年，星期四9.DNA变性时，随着结构和性质的变化，下述变化除何种外均会发生。(

)A.发生螺旋－线团转换B.沉降系数增加

C.减色效应D.黏度下降10.

碱基堆积力在稳定核酸结构中非常重要。（1）碱基堆积力的化学本质究竟是什么。（2）在核酸结构中，经常看到结合的金属元素，他们所起的作用是什么。（3）氢键也参与稳定核酸的结构，但在哪一方面不同于碱基堆积力和金属离子与核酸的作用

-江南大学2009年生物化学

11.简述导致蛋白质变性的主要因素，如何在蛋白质分离纯化中减少其变性的机会。

-江南大学2010年生物化学思考题第二十八页，共一百六十五页，编辑于2023年，星期四12.

有两份DNA样品，一份含腺嘌呤32%，另外一份含17%，求两份样品的鸟嘌呤，胞嘧啶，胸腺嘧啶的相对比例，并分析当中那个可能取自于嗜热菌，依据是什么？

-2012暨南大学生物化学13.何为核酸变性，何为增色效应，产生增色效应的原因是什么？-2012年山东师范大学生物化学14.从生物样品中提取天然蛋白时，为什么一般要求用缓冲液而且有一定离子强度？为什么强调在低温下操作而不是常温。

-中国农业大学2010年生物化学思考题第二十九页，共一百六十五页，编辑于2023年，星期四（一）蛋白质的两性电离

蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，氨基酸残基侧链中某些基团，在一定的溶液pH条件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。

在蛋白质分子中，游离的α—NH2和α—COOH相距较远，静电引力减弱，故：

a末端的α—NH2的pK′值减少

b末端的α—COOH的pK′值增大二、蛋白质的理化性质P291第三十页，共一百六十五页，编辑于2023年，星期四蛋白质的等电点(isoelectricpoint,pI)

当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的pH称为蛋白质的等电点。在等电点时蛋白质的溶解度最小，在电场中不移动。第三十一页，共一百六十五页，编辑于2023年，星期四

pH=pI时，蛋白质净电荷为零，蛋白质分子在电场中不移动

pH＞pI

时，蛋白质净电荷为负，蛋白质分子在电场中向阳极移动

pH＜pI

时，蛋白质净电荷为正，蛋白质分子在电场中向阴极移动在pI时，蛋白质失去了胶体的稳定条件，即没有相同电荷相互排斥的作用。所以不稳定，溶解度最小，易沉淀。溶液中蛋白质颗粒

可用pI-pH衡量蛋白质或氨基酸所带电荷第三十二页，共一百六十五页，编辑于2023年，星期四

判断氨基酸所带的净电荷，用pI-pH比pH-pI更好，为什么？

当一种氨基酸的净电荷用q=pI-pH表达时，若q为正值，则该氨基酸带正电荷；若q为负值，则该氨基酸带负电荷。 q值的正与负和该氨基酸所带电荷的种类是一致的。如果采用q=pH-pI来表达，则会出现相反的结果，即q为负值时，氨基酸带正电荷；q为正值时，氨基酸带负电荷。因此，用pI-pH更好。思考题第三十三页，共一百六十五页，编辑于2023年，星期四思考题第三十四页，共一百六十五页，编辑于2023年，星期四1．处于等电点的蛋白质（）

a.分子不带电荷b.分子最不稳定,易变性

c.分子带的电荷最多d.易聚合成多聚体

e.易被蛋白酶水解

2．将蛋白质溶液的PH值调节到其等电点时（）

a.可使蛋白质稳定性增加

b.可使蛋白质表面的净电荷不变

c.可使蛋白质表面的净电荷增加

d.可使蛋白质胶体溶液稳定性降低，易于沉淀。

e.对蛋白质表面水化膜无影响思考题第三十五页，共一百六十五页，编辑于2023年，星期四

中国科学院2002年研究生入学试题（判断）3.1酶的最适pH与酶的等电点是两个不同的概念,但两者之间有相关性,两个数值通常比较接近或相同.3.2蛋白质的等电点和它所含的酸性氨基酸残基和碱性氨基酸残基的数目比例有关3.3蛋白质在处于等电点时的溶解度A.最小;B.最大;C.与等电点没有关系.4.1．溶液的pH可以影响氨基酸的等电点（判断）.

南京大学20005、在某一溶液中含有三种蛋白质，其性质如下

a

相对分子质量40000

等电点8.5b

400005.9c

600005.9设计一个方案纯化这三种蛋白。苏州大学2005思考题第三十六页，共一百六十五页，编辑于2023年，星期四2、蛋白质的等离子点（特征常数）

蛋白质的等电点在有中性盐存在下可以发生明显的变化，原因是蛋白质分子中某些解离基团与中性盐中的离子相结合。蛋白质的等电点在一定程度上决定于介质中离子的组成。

等离子点（isoionicpoint）：没有其它盐类干扰时，蛋白质质子供体基团解离出来的质子数与质子受体基团结合的质子数相等时的pH称为等离子点(蛋白质的等离子点：指在纯水中（即没有其它盐类存在）蛋白质的正离子数等于负离子数的pH值。)第三十七页，共一百六十五页，编辑于2023年，星期四（二）、蛋白质的胶体性质1.蛋白质溶液稳定的因素：

蛋白质分子大小属于胶体质点范围（1）水化层：分子表面上亲水基团在水溶液中能与水分子起水化作用（2）双电层（电荷）：分子表面上的可解离基团，在适当的pH条件下，都带有相同的电荷，与其周围的反离子构成稳定的双电层。

P299第三十八页，共一百六十五页，编辑于2023年，星期四2、蛋白质的沉淀（1）概念：蛋白质分子发生凝聚，从溶液中析出的现象。（2）原理：破坏稳定因素：水化膜和双电层（3）沉淀方法：①盐析法②有机溶剂沉淀③重金属盐沉淀条件:pH＞pI(Pr-M+)

④某些酸类沉淀条件：pH＜pI(Pr+X-)

⑤加热变性沉淀沉淀⑥等点的沉淀第三十九页，共一百六十五页，编辑于2023年，星期四①盐析法定义：加高浓度中性盐使蛋白质沉淀析出的现象。

常用的中性盐主要有硫酸铵，优点是温度系数小而溶解度大（另外：NaCl、NaSO4等）。原理：破坏蛋白质胶体周围的水化膜，中和了蛋白质分子的电荷，使蛋白质沉淀而析出。分段盐析：调节盐浓度，可使混合蛋白质溶液中的几种蛋白质分段析出。蛋白质不变性温度;pH值;蛋白质浓度影响盐析的因素有：第四十页，共一百六十五页，编辑于2023年，星期四盐析法-实例分析蛋清中加硫酸铵至50%饱和度，则球蛋白先析出；继续加入硫酸铵至饱和，则清蛋白沉淀析出。微生物发酵生产酶制剂就是采用盐析的作用原理，从发酵中把目的酶分离提取。实验室常用的盐析试剂为硫酸铵的原因：中山大学2009

第四十一页，共一百六十五页，编辑于2023年，星期四②有机溶剂沉淀

有机溶剂（和水互溶）乙醇、丙酮等。

原理：有机溶剂引起蛋白质沉淀的主要原因是（1）加入有机溶剂使水溶液的介电常数降低，因而增加了两个相反电荷基团之间的吸引力，促进了蛋白质分子的聚集和沉淀。（2）有机溶剂引起蛋白质沉淀的另一种解释认为与盐析相似，有机溶剂与蛋白质争夺水化水，致使蛋白质脱除水化膜，而易于聚集形成沉淀。低温蛋白质不变性有机溶剂沉淀蛋白质时，介电常数的增加使离子间的静电作用的减弱而致（判断）复旦大学2002生物化学第四十二页，共一百六十五页，编辑于2023年，星期四有机溶剂沉淀

pH=pI时，可加速蛋白质沉淀。

低温（0℃∽4℃）。第四十三页，共一百六十五页，编辑于2023年，星期四有机溶剂沉淀注意事项有机溶剂长时间作用于蛋白质会引起变性，操作时需注意：（1）低温操作：提取液和有机溶剂都需事先冷却。向提取液中加入有机溶剂时，要边加边搅拌，防止局部过热，引起变性。（2）有机溶剂与蛋白质接触时间不能过长，在沉淀完全的前提下，时间越短越好，要及时分离沉淀，除去有机溶剂。实例分析：食品级的酶制剂的生产，中草药注射液、胰岛素的制备大都用有机溶剂分离沉淀蛋白质。有机溶剂的添加量最好不超过沉淀目的酶所必要的数量，多加有机溶剂会使更多的色素、糊精及其它杂质沉淀。第四十四页，共一百六十五页，编辑于2023年，星期四③重金属盐沉淀

氯化高汞、硝酸银、醋酸铅、三氯化铁等。蛋白质变性重金属与蛋白质形成不溶性盐而沉淀。第四十五页，共一百六十五页，编辑于2023年，星期四反应条件:

pH

<

pI

NH3+PrCOO-

NH3+Pr

COOHH+X-

NH3+

X-Pr

COOH不溶性蛋白盐

苦味酸、单宁酸、钨酸、鞣酸、三氯乙酸等。X-：酸根蛋白质变性

机理：在酸性条件下，蛋白质带正电，可以与生物碱试剂的酸根离子结合而产生沉淀。④

生物碱试剂和某些酸类沉淀第四十六页，共一百六十五页，编辑于2023年，星期四生物碱试剂和某些酸类沉淀实例分析实例分析：在啤酒生产工艺中有麦芽汁加啤酒花煮沸的工序，其目的之一就是借酒花中的单宁类物质怀变性蛋白质或盐形成沉淀，使麦芽汁得以澄清，从而防止成品啤酒产生蛋白质混浊。“柿石症”的产生就是由于空腹吃了大量的柿子，柿子中含有大量的单宁酸，使肠胃中的蛋白质凝固变性而成为不能被消化的“柿石”第四十七页，共一百六十五页，编辑于2023年，星期四⑤等电点沉淀：蛋白质不变性，原理？第四十八页，共一百六十五页，编辑于2023年，星期四⑥加热变性沉淀实例分析：我国很早便创造了将大豆蛋白质的浓溶液加热并点入少量盐卤（含MgCl2）的制豆腐方法，这是成功地应用加热变性沉淀蛋白的一个例子。老豆腐：盐卤作凝固剂（含水量80%—85%）嫩豆腐：石膏或葡萄糖酸内酯作凝固剂制（含水量为85%—90%）第四十九页，共一百六十五页，编辑于2023年，星期四思考题1.蛋白质溶液出现沉淀与蛋白质变性存在必然的关系。

-中国科学院2005年生物化学判断题2.蛋白质沉淀剂都能引起蛋白质明显的变性

2003年福州大学生物化学蛋白质沉淀未必变性，变性未必沉淀第五十页，共一百六十五页，编辑于2023年，星期四A.可逆沉淀

在发生沉淀反应时，分子内部、空间结构并未发生显著变化，基本上保持原有的性质，沉淀因素除去后，能再溶于水溶液中。这种作用称为可逆沉淀反应。如大多数蛋白质的盐析作用或在低温下用乙醇（或丙酮）短时间作用于蛋白质以及利用等电点的沉淀，提纯蛋白质时，常利用此类反应。B.不可逆沉淀/变性沉淀在发生沉淀反应时，内部结构、空间构象遭到破坏，失去原来的天然性质，这时蛋白质已发生变性。这种变性蛋白质的沉淀不能再溶解于原来溶剂或水溶液中的作用称为不可逆沉淀反应或变性沉淀。重金属盐、生物碱试剂，强酸、强碱、加热、震荡、超声波、有机溶剂等都能使蛋白质发生不可逆沉淀反应。沉淀类型第五十一页，共一百六十五页，编辑于2023年，星期四沉淀DNA1、预冷无水乙醇沉淀DNA（0.6倍体积的异丙醇）

DNA溶液是DNA以水合状态稳定存在，当加入乙醇时，乙醇会夺去DNA周围的水分子，使DNA失水而易于聚合。一般实验中，是加2倍体积的无水乙醇与DNA相混合。2.在用乙醇沉淀DNA时，为什么一定要加NaAc或NaCl

？

在pH为8左右的溶液中，DNA分子是带负电荷的，加一定浓度的NaAc或NaCl，使Na+中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，易于互相聚合而形成DNA钠盐沉淀。在用乙醇沉淀DNA时可使B-DNA向A-DNA转化？第五十二页，共一百六十五页，编辑于2023年，星期四沉淀DNA1.酒精沉淀核酸时，下列何种长度核苷酸不能被沉淀（）

10；

20；

50；

100

中国科学院2003年生物化学

2.与氨基酸相似的蛋白质性质是:

A,高分子性质B,胶体性质C,沉淀性质D,两性性质E,变性性质

青岛大学2009年

生物化学第五十三页，共一百六十五页，编辑于2023年，星期四（三）蛋白质的紫外吸收大部分蛋白质均含有带芳香环的苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。这三种氨基酸的在280nm附近有最大光吸收。因此，大多数蛋白质在280nm

附近显示强的吸收。蛋白质的OD280与其浓度呈正比关系，因此可作蛋白质定量测定利用这个性质，可以对蛋白质进行定性定量鉴定。第五十四页，共一百六十五页，编辑于2023年，星期四比色管第五十五页，共一百六十五页，编辑于2023年，星期四三、蛋白质的分子大小和形状蛋白质是分子量很大的生物分子，相对分子质量大于6000，最高可达40000000（烟草花叶病毒）。测分子量的方法：★化学组成测定最低分子量★SDS法★凝胶过滤法★渗透压法★扩散系数法★沉降系数法和沉降平衡法第五十六页，共一百六十五页，编辑于2023年，星期四

利用化学分析定量测定蛋白质中某一特殊元素的含量，并假定蛋白质分子中含1个这种元素，即可测算最低Mr。

如：用化学分析法测定血红蛋白质中含Fe0.34％，则

最低Mr=55.84×100/0.34=16700；

用其它方法测定，其实际Mr为16700的4倍，由此可知，血红蛋白含有4个Fe的原子，而不是1个Fe。

牛血清白蛋白含Trp0.58%

最低M=35200，实际为69000，含2个Trp1、根据化学成分测定最小相对分子质量一个蛋白质样品中氮素含量1.2g，则含蛋白质为（）厦门大学2009第五十七页，共一百六十五页，编辑于2023年，星期四例题：一种纯酶含亮氨酸（Mr131）1.65%，含异亮氨酸

（Mr131）2.48%，求最低相对分子质量。解：按照Leu的百分含量计算，最低MrX1：

X1=(100

131)/1.65=7939.4按照Ile的百分含量计算最低MrX2：

X2=(100

131)/2.48=5282.3由于X1和X2数字差异较大，提示这种酶含Leu和Ile不止1

个，为了估算Leu和Ile的个数，首先计算：

X1/X2=7939.4/5282.3≈1.5

这种酶含任何氨基酸的个数均应是整数，说明该酶至少含有2个Leu，3个Ile，其最低相对分子质量为：

7939.42=15878.8或5282.3×3=15846.9根据化学成分测定最小相对分子质量第五十八页，共一百六十五页，编辑于2023年，星期四2、根据渗透压测定平均分子量渗透压摩尔数等电点附近称重第五十九页，共一百六十五页，编辑于2023年，星期四3、扩散系数法测定平均分子量扩散：由于浓度差引起的溶质分子的净迁移。扩散的热力学驱动力是熵的增加。扩散系数D：等于当浓度梯度为一个单位时，在一秒钟内通过1cm2面积所扩散的溶质量。扩散系数随Mr的增加而降低，但对Mr的变化不敏感。对球形的大分子来说，扩散系数与Mr的立方根成反比。第六十页，共一百六十五页，编辑于2023年，星期四扩散系数法测定平均分子量第六十一页，共一百六十五页，编辑于2023年，星期四

沉降速度法

在高速离心力作用下，蛋白质的沉降速度与分子大小和形状有关，因为沉降系数S大体上和分子量成正比关系，故可应用超速离心法测定蛋白质分子量，但对分子形状高度不对称的大多数纤维状蛋白质不适用。超速离心法既可以用来测定蛋白质的分子量也可以用作分离纯化蛋白质。4.沉降分析法分为沉降速度法和沉降平衡法两种，也可以用于蛋白质或DNA的分离第六十二页，共一百六十五页，编辑于2023年，星期四沉降分析法-沉降速度法沉降系数：溶质颗粒在单位离心场中的沉降速度，用S表示。一个S单位，为1×10-13秒。相对分子质量越大，S值越大。蛋白质的沉降系数：1～200S。

s=————vω2x

沉降系数：质量1克的物质在离心场中受到1dyn的离心力作用下，1秒钟下降的距离。第六十三页，共一百六十五页，编辑于2023年，星期四沉降分析法-

（B）.沉降平衡法

在离心过程中，外围高浓度区的蛋白质向中心扩散，如转速较低，二者可达到稳定平衡。此时测定离心管中不同区域的蛋白浓度，可按下式计算分子量：其中C2和C1是离轴心距离为x2和x1时的蛋白质浓度。沉降平衡法的优点是不需要扩散系数，且离心速度较低（8000－20000转每分）。但要达到平衡常常需要几天时间。M=2RTln(C2/C1)÷[ω2(1－Vρ)(x22－x12)]第六十四页，共一百六十五页，编辑于2023年，星期四比较：核酸的沉降特性P515（1）密度梯度超速离心测定核酸的浮力密度：

8MCsCl，45000rpm，16h

密度梯度：1.80g/ml→1.55g/ml

平衡时：浮力密度=CsCl密度=离心力ρ=ρ0+4.2ω2（r2-r02）×10-10（2）密度梯度超速离心测定DNA的G-C含量

G-C含量与DNA的浮力密度之间呈正比关系

ρ=0.1xG-C+1.658xG-C=（ρ-1.658）×10

但是5-甲基胞嘧啶多的DNA，其实际浮力密度会降低，低于理论值？。第六十五页，共一百六十五页，编辑于2023年，星期四核酸的沉降特性与超速离心的应用超螺旋DNA或RNA＞DNA变性DNA＞双链DNA＞蛋白质，变性程度越大，浮力密度越大密度（3）密度梯度超速离心研究核酸的构象（4）密度梯度超速离心纯化

RNA或不同构象的DNA第六十六页，共一百六十五页，编辑于2023年，星期四5、凝胶过滤法

原理：凝胶过滤所用介质为凝胶珠，其内部为多孔网状结构。一定型号的凝胶网孔大小一定，只允许相应大小的分子进入凝胶颗粒内部，大分子则被排阻在外。洗脱时大分子随洗脱液从颗粒间隙流下来，洗脱液体积小；小分子在颗粒网状结构中穿来穿去，历程长，后洗脱下来，洗脱体积大。也可以用于蛋白质分离纯化。

洗脱体积：自加入样品开始到该组分的洗脱峰峰顶（即收集液中该组分浓度最大时）出现时所流出的洗脱液体积。第六十七页，共一百六十五页，编辑于2023年，星期四凝胶过滤法第六十八页，共一百六十五页，编辑于2023年，星期四凝胶过滤法测定样品蛋白质分子量的方法：①测得几种标准蛋白质的洗脱体积〔Ve〕；②以相对分子质量对数（logM）对Ve作图,得标准曲线；③再测出未知样品洗脱体积〔Ve〕；④从标准曲线上可查出样品蛋白质的相对分子质量。第六十九页，共一百六十五页，编辑于2023年，星期四（二）、SDS电泳来测定蛋白质的分子量

蛋白质在电场中的迁移率取决于它所带的净电荷以及分子大小和形状等因素。加入SDS（十二烷基磺酸钠）和少量巯基乙醇，则蛋白质分子的迁移率主要取决于它的分子量，而与原来所带电荷、分子形状无关。

SDS是变性剂，它能破裂蛋白质分子中的氢键和疏水作用。巯基乙醇打开二硫键，因此使蛋白质分子处于伸展状态。此时SDS以其烃链与蛋白质分子的侧链结合成复合物，大约每两个氨基酸残基结合一个SDS分子。第七十页，共一百六十五页，编辑于2023年，星期四SDS的两个作用

1、由于SDS是阴离子，使多肽表面覆盖的负电荷远远超过蛋白质分子原有的电荷量，消除了原来的电荷差异。

第七十一页，共一百六十五页，编辑于2023年，星期四SDS的两个作用

2、改变了蛋白质单体分子的构象，都成雪茄状，不同蛋白质的SDS复合物的短轴长度都相同，长轴长度随其分子量的大小成正比变化。第七十二页，共一百六十五页，编辑于2023年，星期四SDS电泳

SDS电泳电泳时，它的迁移率一般电泳时它的迁移率第七十三页，共一百六十五页，编辑于2023年，星期四SDS电泳来测定蛋白质的分子量的方法①用SDS和巯基乙醇（打开二硫键）处理蛋白质变性并与SDS结合，形成SDS-蛋白质复合物，使得不同蛋白质分子均带负电（SDS带负电），且荷质比相同；不同蛋白质分子具有相似的构象。②用几种标准蛋白质相对分子质量的对数值对它们的迁移率作图③测出待测样品的迁移率④从标准曲线上查出样品的相对分子质量第七十四页，共一百六十五页，编辑于2023年，星期四SDS电泳来测定蛋白质的分子量的方法绘制标准曲线：以标准蛋白质分子量的对数log(M)为纵坐标，Rf值为横坐标，绘制标准曲线。第七十五页，共一百六十五页，编辑于2023年，星期四Disc(native)(自然性电泳法)第七十六页，共一百六十五页，编辑于2023年，星期四NoncovalentcovalentHowaboutcovalentlink?或巯基乙醇★此方法只能测得亚基肽链的相对分子质量第七十七页，共一百六十五页，编辑于2023年，星期四SDS：十二烷基磺酸钠

1、溶解膜蛋白及脂肪，从而使细胞膜破裂2、溶解核膜和核小体，使其解聚，将核酸释放出来，使蛋白质与核酸分离3、使蛋白质变性沉淀4、对核酸酶有抑制作用5、屏蔽蛋白质电荷：SDS6、改变蛋白质形状：SDS

简要说明下列5种试剂在生物化学实验中的应用

SDS，EDTA，SephadexG-25，琼脂糖和缓冲液

-2009南京农业大学生物化学第七十八页，共一百六十五页，编辑于2023年，星期四SDS：十二烷基磺酸钠

1．下列哪种方法可用于测定蛋白质分子量（）

a.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳b.凯氏定氮法

c.280/260nm紫外吸收比值d.荧光分光光度法

e.茚三酮反应

2．蛋白质变性是由于（）

a.蛋白质一级结构改变b.蛋白质亚基解聚

c.蛋白质空间构象破坏d.辅基脱落

e.蛋白质水解第七十九页，共一百六十五页，编辑于2023年，星期四四、蛋白质分离纯化的一般原则盐析、等电点沉淀、有机溶剂沉淀层析和电泳第八十页，共一百六十五页，编辑于2023年，星期四保存方法：①晶体保存：结晶过程本身也伴随着一定程度的提纯。能否结晶不仅是纯度的一个指标，也是判断制品是否有活性的指标。纯度越高，溶液越浓，越容易结晶。结晶方法：使溶液略处于过饱和状态。降低温度、盐析、加有机溶剂、调节pH、接入晶种。②冻干粉保存：③溶液保存：加入抗冻剂（50%甘油）后-20-70℃保存。第八十一页，共一百六十五页，编辑于2023年，星期四蛋白质纯化的一般注意事项操作尽可能置于冰上或者冷库内进行；不要太稀，蛋白质浓度维持在μg/mlmg/ml；合适的pH，除非是进行聚焦层析，所使用的缓冲液pH避免与pI相同；使用蛋白酶抑制剂，防止蛋白酶对目标蛋白的降解；避免样品反复冻融和剧烈搅拌，以防蛋白质变性；缓冲溶液成分尽量模拟细胞环境；在缓冲溶液加入0.11mmol/LDTT（或-巯基乙醇），防止蛋白质的氧化；加110mmol/LEDTA金属螯合剂，防止重金属对目标蛋白的破坏；使用灭菌溶液，防止微生物生长。第八十二页，共一百六十五页，编辑于2023年，星期四五、分离纯化蛋白质第八十三页，共一百六十五页，编辑于2023年，星期四思考题1.说出5种分离蛋白质的方法及依据-中山大学2012生物化学

2.怎样从组织中分离提纯某一特定蛋白质？（简述主要步骤和使用的方法）

-华南理工大学2009生物化学第八十四页，共一百六十五页，编辑于2023年，星期四（一）、根据分子大小和形状的差异：①透析和超滤法：除去小分子物质②密度梯度离心法③凝胶过滤法方法

1、透析和超过滤

透析：根据的是蛋白质不能通过半透膜的性质，而水和无机盐等小分子自由通过，此方法只能将蛋白质和小分子物质分开，不能将不同蛋白质分开。第八十五页，共一百六十五页，编辑于2023年，星期四超过滤超过滤：是利用外加压或离心使水和其他分通过半透膜，蛋白质留在膜上。

浓缩：使用超滤来增加所需大分子溶质的浓度，即大分子被超滤膜截留而小分子和溶剂可自由通过。梯度分离：按分子大小梯度分离样品中的溶质分子时，超滤是一种经济有效的方法。脱盐／纯化：脱盐即从大分子溶液中去除盐、非水性溶剂和小分子物质的过程。超滤的主要应用：第八十六页，共一百六十五页，编辑于2023年，星期四透析和超过滤1、辅酶或辅基的判断2、可逆抑制剂和不可逆抑制剂判断3、蛋白质浓缩除盐或小分子化合物4、牛胰核糖核酸酶本性和复性试验第八十七页，共一百六十五页，编辑于2023年，星期四2.密度梯度（区带）离心

在密度梯度介质中进行的依密度而分离的离心法。各组分会依其密度分布在与其自身密度相同的液层中。密度梯度可以离心前预先制备(如叠加不同浓度蔗糖、甘油)或在离心中自然形成(如使用氯化铯时)。可用于分析型或制备型的离心分离。通常分为速率区带离心和等密度离心两种方式。

第八十八页，共一百六十五页，编辑于2023年，星期四密度梯度（区带）离心第八十九页，共一百六十五页，编辑于2023年，星期四3、凝胶过滤又称分子筛层析，是根据分子大小分离蛋白质混合物最有效的方法之一。常用葡聚糖凝胶（商品名为Sephadex)和琼脂糖凝胶（商品名Sepharose）。网孔大小—用交联剂与葡聚糖或琼脂糖的比例实现。大分子先洗脱下来，小分子后洗下来。（保持天然酶状态）

凝胶过滤可用于：蛋白质分离纯化、分子量鉴定、或浓缩除盐第九十页，共一百六十五页，编辑于2023年，星期四葡聚糖凝胶（商品名为Sephadex)交联葡聚糖凝胶的种类有G-10，G-15，G-25，G-50，G-75，G-100，G-150，和G-200。G后面的阿拉伯数为凝胶得水值的10倍。例如，G-25为每克凝胶膨胀时吸水2.5克，同样G-200克每克千胶吸水20克。因此，“G”反映，凝胶的交联程度，膨胀程度及分部范围。后面的阿拉伯数字越大,表示交联越小,凝胶孔径越大,分子量分离范围越大.凝胶的溶胀体积.

当我们从生物组织中用盐析法提取蛋白质后，常需要进行蛋白质的脱盐工作，可介质为葡聚糖凝胶G-25用适当的洗脱剂进行洗脱，经凝胶层析，就可以将大分子蛋白质与小分子盐类分离。蛋白质和盐哪个先洗脱？第九十一页，共一百六十五页，编辑于2023年，星期四凝胶过滤第九十二页，共一百六十五页，编辑于2023年，星期四凝胶过滤1．今有下列蛋白质的混合物：

A.分子量12000pI=10

B.分子量62000pI=4

C.分子量28000pI=7

D.分子量9000pI=5

若不考虑其它因素，当它们：

（1）流经阴离子交换剂DEAE纤维素，用线性盐梯度洗脱时（2）流经SephadexG-50凝胶排阻柱时；这些蛋白质的洗脱顺序如何？6、有一个多亚基球状蛋白质，其肽链间有二硫键。试问由一下那种方法，可以测得该蛋白质的分子量？请说明理由。（1）SDS（2）等密度沉降（3）凝胶过滤法2008年中国农业大学生物化学第九十三页，共一百六十五页，编辑于2023年，星期四（二）利用溶解度差别的分离方法：盐析法有机溶剂沉淀法等电点沉淀法重金属盐选择性沉淀法（pH》pI，蛋白质带负电荷）生物碱和酸选择性沉淀法（pH《pI，蛋白质带正电荷）热处理沉淀法（铜锌SOD，65℃、15分钟、稳定第九十四页，共一百六十五页，编辑于2023年，星期四

1.等电点沉淀和PH控制

在等电点时，蛋白质分子以两性离子形式存在，其分子净电荷为零，此时蛋白质分子颗粒在溶液中因没有相同电荷的相互排斥，分子相互之间的作用力减弱，其颗粒极易碰撞、凝聚而产生沉淀，所以蛋白质在等电点时，其溶解度最小，最易形成沉淀物。

不同的蛋白质，具有不同的等电点。在生产过程中应根据分离要求，除去目的产物之外的杂蛋白第九十五页，共一百六十五页，编辑于2023年，星期四2、有机溶剂分级分离法（1）定义：利用不同蛋白质在不同浓度的有机溶剂中的溶解度不同而使蛋白质分离的方法，称为有机溶剂沉淀法。经常使用的有机溶剂是乙醇和丙酮。（2）作用机理：

（1）降低水溶液的介电常数，使溶质溶解度降低；（2）破坏大分子周围水膜，使溶解度降低。（3）优点：比盐析法析出的沉淀容易过滤或离心分离，分辨力比盐析法好，溶剂也容易除去。第九十六页，共一百六十五页，编辑于2023年，星期四3、盐溶和盐析常用的盐：为溶解度大的中性盐，如(NH4)2SO4、NaCl、MgCl2、NH4Cl、KCl等的饱和溶液盐溶：低浓度的中性盐在蛋白质分子表面形成双电层使蛋白质溶解度增加；盐析：高浓度的中性盐破坏蛋白质分子表面的水化层使蛋白质溶解度降低，发生沉淀析出。（PH多在PI）分段盐析：不同蛋白质盐析所需的盐浓度不同，蛋白质溶液中，逐渐增大盐浓度，不同蛋白质先后析出，称分段盐析（例如：半饱和硫酸铵溶液可沉淀可卵清球蛋白，而饱和硫酸铵溶液沉淀卵清清蛋白）第九十七页，共一百六十五页，编辑于2023年，星期四盐溶第九十八页，共一百六十五页，编辑于2023年，星期四盐析第九十九页，共一百六十五页，编辑于2023年，星期四有A,B,C

三种蛋白质,在PH=7进行电泳，结果如下图。若在PH=7用中性盐沉淀这三种蛋白质，哪种首先沉淀，其次是哪一种，最后是哪一种？

从电泳结果可知

PH7时C蛋白带电最多，B蛋白次之，A最少，在PH7时用中性盐沉淀，带电最少的首先沉淀。因此

A先沉淀，其次是B，最后是C。思考题第一百页，共一百六十五页，编辑于2023年，星期四（三）根据电荷不同的分离方法

电泳：带电颗粒在电场中移动的现象。分子大小不同的蛋白质所带净电荷密度不同，迁移率不同，电泳时可以分开自由界面电泳：又称移动界面电泳，是指在没有支持介质的溶液中进行的电泳。其装置复杂，价格昂贵，费时费力，不便于推广应用。区带电泳：是指有支持介质的电泳，待分离物质在支持介质上分离成若干区带。支持介质的作用主要是防止电泳过程中的对流和扩散，以使被分离的成分得到最大分辨率的分离。电泳和离子交换层析第一百零一页，共一百六十五页，编辑于2023年，星期四支持介质种类的不同，区带电泳可分为：①纸电泳：用滤纸作为支持介质，多用于核苷酸的定性定量分析。②醋酸纤维素薄膜电泳：医学上，常用于分析血清蛋白、胎盘球蛋白，其优点是简便迅速，便于保存照相，比纸电泳分辨率高。以上二种类型的电泳，由于介质的孔径度大，没有分子筛效应，主要靠被分离物的电荷多少进行分离。第一百零二页，共一百六十五页，编辑于2023年，星期四支持介质种类的不同，区带电泳可分为：③淀粉凝胶电泳：多用于同工酶分析，凝胶铺厚些，可一层一层剥层分析（一板多测）。天然淀粉经加工处理即可使用，但孔径度可调性差，并且由于其批号之间的质量相差很大，很难得到重复的电泳结果，加之电泳时间长，操作麻烦，分辨率低，实验室中已很少使用。④琼脂糖凝胶电泳：一般用于核酸的分离分析。琼脂糖凝胶孔径度较大，对大部分蛋白质只有很小的分子筛效应。⑤聚丙烯酰胺凝胶电泳：可用于核酸和蛋白质的分离、纯化及检测。其分辨率较高。聚丙烯酰胺和琼脂糖是目前实验室最常用的支持介质第一百零三页，共一百六十五页，编辑于2023年，星期四聚丙烯酰胺凝胶电泳

PAGE根据其有无浓缩效应，分为连续系统和不连续系统两大类。

连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷效应不同和分子筛效应进行分离。

不连续系统中由于缓冲液离子成分，pH，凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均比前者更佳。第一百零四页，共一百六十五页，编辑于2023年，星期四浓缩效应：样品胶中间浓缩胶下层分离胶第一百零五页，共一百六十五页，编辑于2023年，星期四聚丙烯酰胺凝胶电泳示意图第一百零六页，共一百六十五页，编辑于2023年，星期四

1.某蛋白质溶液分别用SDS和阳离子交换柱层析进行分析，得到如图所示的结果。关于该溶液中蛋白质的组成，你的结论是什么？思考题阳离子交换柱层析进行分析SDS2.比较说明SDS(SDS-聚丙烯酰胺电泳)和琼脂糖凝胶电泳的物质浙江大学2004第一百零七页，共一百六十五页，编辑于2023年，星期四

2、等电聚焦电泳：

在电泳支持介质中加入载体两性电解质通以直流电后在正负极之间形成稳定、连续和线性的pH梯度，蛋白质在pH梯度凝胶中受电场力作用下泳动，它的分离仅仅决定于其本身的等电点。

当蛋白质分子一旦到达它的等电点位置，分子所带净电荷为0，就不能再迁移。如果它向等电点两侧扩散，净电荷就不再为0，都会被阴极或阳极吸引回来，直至回到净电荷为0的位置，因此蛋白质在与其本身pI相等的pH位置被聚焦成窄而稳定的区带。这种效应称之为“聚焦效应”。保证了蛋白质分离的高分辨率，是等电聚焦最为突出的优点。第一百零八页，共一百六十五页，编辑于2023年，星期四等电聚焦电泳：第一百零九页，共一百六十五页，编辑于2023年，星期四2Delectrophoresis1stdimensionSeparationbasedonpIisoelectricfocusing2nddimensionNormalSDS第一百一十页，共一百六十五页，编辑于2023年，星期四

3、离子交换层析法离子交换层析（IonExchangeChromatography简称为IEC）是以离子交换剂为固定相，特定的离子溶液为流动相，依据各种离子或离子化合物与离子交换剂的结合力不同进行分离纯化的层析方式。由于蛋白质也有等电点，当蛋白质处于不同的pH条件下，其带电状况也不同。如：阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋白质，所以这类蛋白质被留在柱子上，然后通过提高洗脱液中的盐浓度等措施，将吸附在柱子上的蛋白质洗脱下来。结合较弱的蛋白质首先被洗脱下来。第一百一十一页，共一百六十五页，编辑于2023年，星期四

Ionexchangechromatography离子交换剂由基质、电荷基团（或称功能基团）和反离子

组成。基质一般是不溶性聚合物，如树脂，纤维素，葡聚糖，醇脂糖等；

树脂－N+(CH3)—

OH-

纤维素－O—CH2—COO-—Na＋

基质电荷基团

反离子

阳离子交换树脂：

阴离子交换树脂：阳离子交换剂：CM（羧甲基）阴离子交换剂：DEAE（二乙胺乙基）第一百一十二页，共一百六十五页，编辑于2023年，星期四离子交换基质阳离子交换树脂-负电荷+++阴离子交换树脂-正电荷---蛋白质+蛋白质PI=3PI=7PI=10蛋白质-第一百一十三页，共一百六十五页，编辑于2023年，星期四离子交换基质阳离子交换树脂-负电荷阴离子交换树脂-正电荷---1.蛋白质+蛋白质1.PI=32.PI=73.PI=102.蛋白质+3.蛋白质+第一百一十四页，共一百六十五页，编辑于2023年，星期四(2)洗脱方法在离子交换层析过程中，常用梯度溶液进行洗脱，而溶液的梯度则是由盐浓度或酸碱度的变化形成的。一种是增加离子强度的梯度溶液。二、改变pH值的梯度溶液，如果使用的是阳离子交换剂，pH值应从低到高递增；如果使用的是阴离子交换剂，pH值应从高到低递减。阳离子交换剂适合分离PI>7的蛋白质(先用pH值低于7的缓冲液处理)阴离子交换剂适合分离PI<7的蛋白质(先用pH值高于7的缓冲液处理)第一百一十五页，共一百六十五页，编辑于2023年，星期四

1.SDS测定蛋白质分子量的方法是根据蛋白质分子所带电荷不同（判断）。苏州大学2004

2.SDS是根据蛋白质分子极性大小来对它们进行分离的一种电泳技术（判断）.

中国科学院微生物研究所

3.下列有关核酸电泳和SDS电泳说法错误的是

A.核酸电泳和SDS电泳中DNA和蛋白均向正极泳动；

B.SDS不连续垂直电泳中，上层是分离胶，下层浓缩胶

C.RNA分离需要变性条件下的琼脂糖凝胶电泳；

D.核酸电泳中溴化乙啶结合DNA的碱基对，在紫外下显色

中国计量学院2008年

思考题第一百一十六页，共一百六十五页，编辑于2023年，星期四

1、极性的硅胶和氧气铝以及非极性的活性碳等具有吸附能力

2、吸咐层析法是：利用物质与不同蛋白质的吸附能力的强弱不同达到分离目的。

3、蛋白质提纯中，最广泛和最有效的是结晶磷酸钙即羟基磷灰石。（四）蛋白质的选择吸附分离羟基磷灰石第一百一十七页，共一百六十五页，编辑于2023年，星期四疏水作用层析疏水层析利用高盐吸附、低盐洗脱的原理利用蛋白质表面存在的疏水区域的强度、大小不同，而被吸附到连接有疏水基团的层析介质上。离子强度增大可增强吸附能力，因此常常在2mol/L或3mol/LNaCl溶解样品，洗脱时可通过降低盐浓度、增加乙二醇浓度进行梯度洗脱。第一百一十八页，共一百六十五页，编辑于2023年，星期四

原理：利用分子间具有专一亲和力而设计的层析技术。

专一亲和力分子对：酶与底物、特异性抗原与抗体、DNA和RNA、激素和其受体

载体：使亲和物固相化的水不溶性化合物。如：纤维素、聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶、聚苯乙烯、乙烯、多孔玻璃。Affinitychromatography（五）根据配体特异性的分离—亲和层析第一百一十九页，共一百六十五页，编辑于2023年，星期四从总RNA分离纯化mRNA-亲合层析法第一百二十页，共一百六十五页，编辑于2023年，星期四假定你发现一种新的蛋白质：蛋白质X

1.

如何得到这种蛋白质?-蛋白质的分离、纯化技术

2.这种蛋白质的大小？-（SDS）

3.

它的pI是多少？-（等电聚焦）

4.

其他细胞或其他生物体内是否存在？-Western印迹）

5.其一级结构如何？

（序列分析）

6.其三维结构又如何？

X-射线衍射和核磁共振思考：从蛋白质粗提液分离一种靶酶，说明每一步原理，如何鉴定靶酶纯度

-中国海洋大学2012生物化学思考题：蛋白质研究方法第一百二十一页，共一百六十五页，编辑于2023年，星期四已知蛋白质X是一种真核生物蛋白质。某实验室利用大肠杆菌对该蛋白质进行了表达，以获得一定量的高纯度的蛋白质进行研究。蛋白质X特性如下：

①相对分子质量为49500；

②等电点为4.2；

③具有磷酸水解酶活性，最适pH=8.0；

④在大肠杆菌中表达时容易形成包涵体。

请为该蛋白质设计一套最有效的纯化方案。要求：

①纯化方案开始于收集菌体，终止于蛋白质X的鉴定，实验分步进行；②充分利用已知条件；③解释每一步操作的理由；北京师范大学2006年思考题第一百二十二页，共一百六十五页，编辑于2023年，星期四包涵体包涵体是外源基因在原核细胞中表达时，尤其在大肠杆菌中高效表达时，形成的由膜包裹的高密度、不溶性蛋白质颗粒，在显微镜下观察时为高折射区，与胞质中其他成分有明显区别。分析：（1）.用缓冲液漂洗菌体细胞，离心收集菌体（2）.破碎细胞，离心收集包涵体（3）.破碎包涵体释放蛋白质（4）.根据等电点和分子量设计分离方式（5）.根据活性鉴定分离得到的酶第一百二十三页，共一百六十五页，编辑于2023年，星期四思考题1.怎样从组织中分离提纯某一特定蛋白质？（简述主要步骤和使用的方法）（20分）华南理工大学2006生物化学2.1在一抽提液中含有三种蛋白质,其性质如下:

蛋白质

相对分子质量

等电点A

20000

8.5B

21000

5.9C

5000

6.0试设计一个方案来分离纯化这三种蛋白质。2若细胞色素C，ß-乳球蛋白，一种未知蛋白质和血红蛋白用凝胶过滤分离时，其洗脱体分别为118、58、37与24ml，试问未知蛋白质的相对分子质量。(假定所有蛋白质都是球形的,相对分子质量都是在凝胶过滤的分级分离范围内。)

华东师范大学2007年生物化学

第一百二十四页，共一百六十五页，编辑于2023年，星期四思考题中山大学2010年生物化学

第一百二十五页，共一百六十五页，编辑于2023年，星期四核酸的分离纯化1细胞的破碎液氮研磨法、化学处理法(SDS等）生化法（溶菌酶、纤维素酶等）2核蛋白的解聚、变性蛋白的去除

核酸与蛋白质的结合力主要是正负静电吸力(核酸与碱性蛋白的结合)、氢键和非极性的范德华力。

2.1

加入浓盐溶液：核酸-蛋白质加入NaCl后，破坏静电吸力，使氢键破坏，核蛋白解聚第一百二十六页，共一百六十五页，编辑于2023年，星期四核酸的分离纯化

2.2加入SDS:SDS除有破胞和抑制核酸酶的作用外，还具有使核酸从蛋白质上游离出来的功能2.3氯仿抽提

酚／氯仿混合使用能增加去除蛋白的效果，并对核酸酶有抑制作用。氯仿比重大，能加速有机相与水相分层，减少残留在水相中的酚，同时氯仿具有去除植物色素和蔗糖的作用。在酚/氯仿抽提核酸提取液时，需要振摇，为防止起泡和促使水相与有机相的分离，再加上一定量的异戊醇（氯：异戊醉=24：1）。第一百二十七页，共一百六十五页，编辑于2023年，星期四核酸沉淀

（1）乙醇优点：对盐类沉淀少，沉淀中所含迹量乙醇易挥发除去，不影响以后实验。缺点：需要量大，一般要求低温操作。（2）异丙醇

优点：需体积小，速度快，适于浓度低、体积大的DNA样品沉淀。一般不需低温长时间放置。

缺点：易使盐类、蔗糖与DNA共沉淀．异丙醇难以挥发除去。所以，最后用70％乙醇漂洗数次。第一百二十八页，共一百六十五页，编辑于2023年，星期四核酸的分离纯化(1)电泳:(2)层析法:层析法是利用不同物质某些理化性质的差异而建立的分离分析方法。包括吸附层析、亲和层析、离子交换层析等方法在内的层析法。(3)密度梯度离心法:密度梯度离心也用于核酸的分离和分析。双链DNA、单链DNA、RNA和蛋白质具有不同的密度,因而可经密度梯度离心形式形成不同密度的纯样品区带,该法适用于大量核酸样本的制备。在进行密度梯度超离心时，RNA比DNA沉降快（判断）第一百二十九页，共一百六十五页，