流式细胞术的原理

流式细胞术的原理第一页，共四十一页，2022年，8月28日概念Definition流式细胞术Flowcytometry(FCM)特异性强，灵敏度高，速度快，并能实现多参数分析检测的对象主要是各种生物颗粒，包括大量的临床样本：外周血，骨髓，细胞穿刺液，洗脱液，实体组织，同时包括各种各样的科研研究对象：培养细胞，藻类、染色体、原生动物cellsuspension细胞悬液在流动的状态中被检测各项特性第二页，共四十一页，2022年，8月28日流式细胞仪的基本结构以及原理第三页，共四十一页，2022年，8月28日流式细胞仪的基本结构以及工作原理虽然每款流式细胞仪有各自的特征性结构，但是其内部结构基本组成相同。基本结构一共分三部分：液流系统光学系统电子系统第四页，共四十一页，2022年，8月28日液流系统液流系统包括流动室flowchamber液流驱动系统InjectorTipFluorescencesignalsFocusedlaserbeamSheathfluid鞘液三大作用：避免堵塞喷孔约束样本位于喷嘴中心、提高测量精度保持细胞活性第五页，共四十一页，2022年，8月28日液流系统对灵敏度要求不是很苛刻的实验，可调高样本进样速率，从而提高采样分析速度。第六页，共四十一页，2022年，8月28日光学系统主要由激发光源、光束成形及收集系统组成

弧光灯：氙灯、高压汞灯价格便宜激发光谱广但是单色性差-单一谱线上能量弱稳定性差-功率不稳定激光器：气体激光器：氩离子（488nm）、氦氖（633nm）、氪离子（647nm）、氪氩（568nm）半导体激光器：价格低、结构简单、使用寿命长。BDFACSCalibur采用的635nm染料激光器第七页，共四十一页，2022年，8月28日光学系统激光器：单波长、高能量、发散角小、高稳定性光照第八页，共四十一页，2022年，8月28日光学系统激光在检测细胞样本前经过透镜聚焦成为非常窄的高能量光束。激光光束的横截面呈椭圆形光斑，所以除了集聚能量（细胞通过检测区时就可以得到很强的信号），这样还可以避免照射到其他细胞造成干扰。激光光束成形-透镜聚焦第九页，共四十一页，2022年，8月28日光学系统收集系统

如何将混合的荧光区分开来，分别进行收集呢？滤光片置于荧光探测器前，限定其接收的荧光的波长范围第十页，共四十一页，2022年，8月28日光学系统第十一页，共四十一页，2022年，8月28日电子系统第十二页，共四十一页，2022年，8月28日流式细胞仪的工作原理第十三页，共四十一页，2022年，8月28日散射光信号前向角散射光（FSC，ForwardScatter）：细胞相对大小及其表面积侧向角散射光（SSC，SideScatter）：细胞颗粒度及细胞核相对复杂性第十四页，共四十一页，2022年，8月28日散射光信号第十五页，共四十一页，2022年，8月28日荧光信号特异荧光信号背景信号第十六页，共四十一页，2022年，8月28日荧光素什么是荧光及荧光素？某些物质在特定波长范围内的光线照射下，可发出波长比照射光波长长的光线-即荧光。而这些受激发后能产生荧光的物质称为荧光素。什么是荧光发生机理？室温下的荧光素分子大部分处于稳定的“基态”。当荧光素在激发光的照射下吸收足够的光能后，跃迁到新的状态，即“激发态”。处于激发态的荧光分子极不稳定，它可以通过极短时间（纳秒）内以发射一定波长的光量子的方式释放所吸收的能量从而返回到基态。这一过程称为荧光发射，也就是发光。第十七页，共四十一页，2022年，8月28日荧光素的激发和发射光谱所有的荧光素都有两个特征光谱。激发光谱（Excitation，Ex）：-是指能特异性地激发某种荧光素的一定波长范围内的光线，也称为吸收光谱。-我们一般标注的是吸收波峰，也就是最大吸收波长：Ex-Max发射光谱（Emission，Em）：-是指荧光素发射的一定波长范围内的荧光。所有荧光都是宽谱发射。-一般标注的是发射波峰，即最大发射波长：Em-Max第十八页，共四十一页，2022年，8月28日FITC的激发与发射光谱常用染料FITC可被488nm激光激发，Em-Max：525nm，可以配用530/30接收通道488nm525nm第十九页，共四十一页，2022年，8月28日PI的激发与发射光谱常用染料PI同样可被488nm激光激发，Em-Max：625nm，所以配用不同的585/42接收通道488nm625nm第二十页，共四十一页，2022年，8月28日APC的激发与发射光谱常用染料APC可被633nm激光激发，Em-Max：660nm，可以配用660/20接收通道633nm660nm第二十一页，共四十一页，2022年，8月28日荧光染料的选择仪器配置：激光器种类；光信号接收通道；减少发射光光谱重叠第二十二页，共四十一页，2022年，8月28日补偿——荧光染料宽谱发射的特征产生补偿问题。—PE渗漏到FITC通道的信号FL1-x%FL2—FITC渗漏到PE通道的信号FL2-x%FL1第二十三页，共四十一页，2022年，8月28日先电压，后补偿双色染色的实验中先使用阴性管调电压阴性对照（1）：细胞加上IgG1FITC,IgG1PE然后用单染管调补偿单染管（2）：细胞+抗体AFITCor抗体BPE第二十四页，共四十一页，2022年，8月28日调电压

-寻找目标细胞群;-多色实验中，分出阴阳性细胞群分界线调阈值-减少背景信号调补偿-减去干扰信号调节电压、阈值、补偿第二十五页，共四十一页，2022年，8月28日调整荧光接收器电压电压改变对数据显示的影响第二十六页，共四十一页，2022年，8月28日数据存储ListMode列表模式：每个细胞的参数依次按顺序排列存储

FSCSSCFL1FL2EVENVENT210020024540EVENT3300600100700FITC/PE双染样本第二十七页，共四十一页，2022年，8月28日数据显示二维点图（DotPlot）直方图（Histogram）等高线图（ContourPlot）密度图（Density）三维图（3DPlot）等·第二十八页，共四十一页，2022年，8月28日样本收集及处理制备单细胞悬液免疫荧光染色表型测定统计学分析流式细胞术操作流程第二十九页，共四十一页，2022年，8月28日1.样本制备第三十页，共四十一页，2022年，8月28日样本来源血液骨髓淋巴结体液（尿液、脑脊液、胸腹腔积液）灌洗液（肺泡支气管）加抗凝剂（EDTA），室温保存，24h内实体组织机械法制备单细胞悬液，保持抗原活性，不宜用酶、表面活性剂第三十一页，共四十一页，2022年，8月28日2.免疫荧光染色第三十二页，共四十一页，2022年，8月28日染色方式的选择直接染色—标有荧光染料的抗体直接特异结合目标抗原。—首选的方式：方便快捷、经济、准确、非特异结合少间接染色—标有荧光染料的二抗间接特异结合目标抗原。—在直接染色不能实现的情况下，选用的方式：非特异性结合相对增加。在流式试剂日益全面的情况下，越来越少的客户选择这种方式。仅适用于研究最新发现抗原的客户。第三十三页，共四十一页，2022年，8月28日荧光染料的选择1，首先，了解目标抗原1）细胞表面抗原2）细胞内或是核内抗原（固定、透膜步骤）3）以上两者兼备。先标记表面抗原，固定后，破膜标记胞内抗原。4）细胞内细胞因子的测定。使用细胞内蛋白分泌抑制剂，如monensin、BFA，使得细胞因子不能分泌到细胞外。（活化、固定、透膜）2，了解荧光染料及其工作原理，做出准确的选择。第三十四页，共四十一页，2022年，8月28日荧光染料的种类荧光染料分为三大类1.小分子化合物：FITC、PacificBlue2.大分子荧光蛋白：AmCyan，PerCP，PE,APC3.串联染料：PerCP-Cy5.5，PE-Cy5第三十五页，共四十一页，2022年，8月28日如何正确选择与使用荧光素仪器配置：有哪些激光器与接收通道多色实验中，尽量减少荧光素之间的相互干扰—如APC与Cy5不能串联使用，两者光谱重叠大，补偿不好调。尽量选择应用广、亮度高的荧光素—荧光素的强弱用StainIndex染色指数来表示，数值越大，信噪比越高。多色实验中，亮度高的荧光素搭配表达量低的目标抗原—例如，PE，APC这类大分子蛋白相对亮度高。关注F/P比值—尤其是使用小分子荧光素，一个抗体上会标记多个荧光素分子。在细胞本身自发荧光强的情况下，使用发射光波长大于600nm的荧光染料。避免使用串联染料，不稳定，可能发生降解。第三十六页，共四十一页，2022年，8月28日BD网站提供每一种荧光素的激发以及发射光谱第三十七页，共四十一页，2022年，8月28日常用的荧光素组合第三十八页，共四十一页，2022年，8月28日临床应用HIV诊断与治疗白血病和淋巴瘤的免疫分型肿瘤的细胞周期和倍体分析网织