基因组学的教案

基因组学的教案第1页/共93页表观遗传学的例子

1)细胞的分化是一种典型的表观遗传学现象,如人类眼睛细胞和肌肉细胞含有相同的基因组,但基因的表达差异很大.2)whileamutationintheaxingenecalledaxin-fusedproducesmicewithkinkytails(弯曲尾巴),thedegreeofkinkinessvariesamonggeneticallyidenticallittermates(同一窝老鼠)(Figure).第2页/共93页Epigenetics的历史1)上世纪40年代,Waddington首创“epigenetics”一词,用以概括研究基因及其产物如何转变为表现型的领域.

用现在的话说,就是遗传信息如何转变为表型的过程.2)就词义而言,“epi”是“其上”(upon)或“超越”(over)的意思.因此,在epigenetics的定义中,genetics只涉及基因的结构层次,而epigenetics则涉及基因如何发挥其功能以及基因之间的互作关系.3)在Waddington的“epigenetics”定义中,epigenetics的位置处于遗传学,发育和生态学的交叉口.第3页/共93页表观遗传的通俗解释我国古代有“橘生淮南则为橘，生于淮北则为枳，叶徒相似，其实味不同”的记载，说明相同基因型的生物在不同的环境条件下表型有很大的差别。同一种中药材在不同产地生长，其药效相差甚远，这也是环境影响基因表达的突出例子。这种因环境影响而改变的基因表达模式并不涉及基因型的变异，但可以重复出现，稳定遗传，是一种典型的表观遗传现象。同卵孪生子的表型趋异也是一种表观遗传.最近的研究发现,随着年龄的增长同卵孪生子的表型差异有扩大的趋势.第4页/共93页Epigenetics概念的变迁1)1982年“DictionaryofBiology”的定义:epigenetics系指遗传因子与发育过程之间的互作,通过这种互作使基因型转变为表型.2)1992年,Hall在其所著的“EvolutionaryDevelopmentalBiology”一书中,将epigenetics定义为:在发育过程中遗传因子和非遗传因子作用于细胞,选择性控制基因的表达,并逐步增加表型复杂性的过程.3)1996年,在“EpigenticMechanismsofGeneRegulation”一书中将epigenetics定义为:不涉及DNA顺序的改变而发生的基因功能的差异,这种差异能通过有丝分裂和减数分裂稳定传递.4)2001年Science杂志对epigenetics的定义为:不涉及DNA顺序的变异但能通过有丝分裂和减数分裂遗传的基因表达模式的改变.第5页/共93页表观遗传学表观遗传学(epigenetics):研究在不改变DNA顺序的情况下基因表达出现可遗传变化的分支学科.这种表达模式的改变可通过有丝分裂和减数分裂传递给子代细胞或个体.表观遗传学是功能基因组学研究的重要领域.表观遗传是基因组程序化的一种表现形式.第6页/共93页表观遗传学的内容广义的表观遗传(epigenetic)包括以下内容:1)DNA的甲基化2)位置效应3)核小体和组蛋白的修饰(乙酰基化和甲基化)4)RNAi(siRNA和miRNA)导致的基因沉默5)染色质重建(如X-染色体的失活)6)免疫组织细胞DNA的重排7)基因组印记(genomicimprinting)8)等位基因的副突变及同源抑制，颠换效应9)朊蛋白(Prion)第7页/共93页欧洲已启动epigonome计划InOctober2000,theHumanEpigenomeConsortium(theSangerInstitute,EpigenomicsAG,andtheCentreNationaldeGénotypageinEvry,France)startedaEuropeanUnion-fundedpilotprojecttomapthemethylationsiteswithinthemajorhistocompatibilitycomplex(MHC)regioninsevendifferenthumantissues.2000年10月,欧共体启动了一项探索计划:绘制人类基因组7种不同组织细胞主要组织相容性复合体(MHC)区甲基化位点图.第8页/共93页表观遗传--位置效应1)位置效应是指由于基因在染色体上的位置发生改变而引起的表型改变的现象。2)位置效应表明,基因的功能以及基因对生物表型的影响可以在不改变遗传物质本身的顺序组成情况下仅仅由于遗传物质在染色体上的位置差别而发生变化。3)位置效应实际上反映了基因组不同区域特定染色质结构对基因施加的影响。

第9页/共93页两种位置效应美国学者E.B.刘易斯把位置效应分为两大类型：稳定型和花斑型。稳定型位置效应简称S型位置效应，表型改变是稳定的。花斑型位置效应简称V型效应，其表型改变是不稳定的，从而导致显性和隐性性状嵌合的花斑现象。

第10页/共93页花斑型位置效应当某一基因由于染色体重排从原来的常染色质区移到异染色质区附近,因异染色质的扩散效应,造成基因表达的改变.这种抑制效应的差别使基因表达受抑程度不同,由此产生嵌合.第11页/共93页位置效应--座位控制区1)什么是座位控制区(locuscontrolregion,LCR).Thelevelofactivityofaeuchromaticregionofachromosomeisregulatedbyacis-actingDNAelementdesignatedalocuscontrolregion.

可调控常染色质区活性水平的一段顺式DNA成分.2)LCR的功能:以顺式(cis-)方式调控与其连锁的基因表达.3)第一个LCR首先在人类β-球蛋白基因座位区发现.见:Blood,100:3077-3086,2002第12页/共93页β

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球蛋白质基因座位控制区第13页/共93页β-球蛋白质基因座位控制区的结构球蛋白基因簇含有5个功能基因，分别为ε、γG、γA、δ、β,分布在50kb的DNA区段。球蛋白基因只在血红细胞中表达，但每个基因表达的时期与组织特异性各不相同。ε-球蛋白基因在胚胎卵囊中表达，Gγ和Aγ卵黄囊表达，δ和β仅在成体骨髓中表达。尽管每个球蛋白基因都有一套彼此独立的调控系统，但它们都毫无例外地受到位于该区上游一段长约12kb的LCR控制.5’HSs1-5是LCR区5个DNA-I酶高敏感位点,是处在开放状态的染色质区.5’HSs1-4位点是类红细胞专一性的调控区,5’HSs5-7为非类红细胞活性.增强子活性位于5’HSs2-3位点.humanhispanicdeletion为LCR区缺失,引起地中海贫血病.卵圆型为气味受体基因区(olfactorreceptorgenes).第14页/共93页LCR区ncRNA的调控作用第15页/共93页副突变副突变:(paramuta-tion)最初在玉米中发现的在杂合子中某一基因影响同一座位上另一等位基因的表型.副突变在转基因表现型中也已发现,称为同源抑制.第16页/共93页副突变的分子机制控制玉米紫色基因b1副突变的成分位于该基因上游100kb，是一段含有多个拷贝的重复顺序。杂合子中已发生副突变的b1基因可将其修饰模式（B‘）“拷贝”到等位基因B-1，使后者转变为副突变状(B＇）

B-I和B’都有7个串接重复顺序，重复顺序单位长853bp。重复顺序的多少涉及副突变和b1的转录水平。B-I和B‘的DNA顺序完全相同，不同的只是表达水平。B-I状态重复顺序的甲基化程度高于B’.玉米的B-I和B’的副突变涉及siRNA路线（AllemanM等，2006）。

第17页/共93页小RNA与玉米

B-I基因的沉默第18页/共93页染色质位置阻隔效应—绝缘子1）1985年，Udvardy等在果蝇染色体87A7条带热激蛋白基因座的两侧发现了两段取名为scs和scs’(specializedchronatinstructures,特化染色质区)

的顺序。scs和scs’长分别为350bp和200bp，对

DNAaseI有高度抗性。这两个序列的两侧均有DNAaseI超敏位点，各为100bp。2）将scs置于控制眼睛颜色的基因两侧然后导入果蝇，转化的果蝇品系不管转基因位于何处，均可产生类似表型，说明scs可使转基因免受内源染色质“位置影响”3)这种可以阻止邻近位置激活或失活效应的顺序称之为绝缘子（insulator）或隔离子。第19页/共93页

果蝇绝缘子（insulator）第20页/共93页

果蝇多线染色体横纹区SCS

专一性结合蛋白质第21页/共93页绝缘子可阻止相邻基因之间增强子的彼此干扰1)真核生物增强子具有双向作用,超长距离功能,从而带来位置相邻基因之间的彼此干扰问题.2)有些基因位于异染色质邻近,会受到抑制效应的干扰.绝缘子可以阻止上述因位置原因产生的对基因表达的抑制效应.第22页/共93页绝缘子的定向控制第23页/共93页

绝缘子效应的方向性绝缘子的效应具有方向性果蝇的yellow（y）座位有4个增强子元件，2个位于启动子上游，另2个位于外显子1和2之间，它们分别负责不同组织特异性的yellow基因的表达。将含有绝缘子的果蝇逆转录转座子gypsy依次分别插入每个增强子元件的附近，绝缘子对增强子的阻隔效应依位置不同而异:1)如果插入位置在启动子的5’方向，将影响绝缘子上游增强子元件的作用。2)如果插入位置在启动子的3’方向，只影响下游增强子元件的功能。3)

如果插入位置不在增强子与启动子之间，绝缘子对增强子无阻隔效应。第24页/共93页

绝缘子（2）第25页/共93页

绝缘子结合蛋白（CTCF）（1）第26页/共93页

绝缘子DNA结合蛋白一种DNA-结合蛋白CTCF(CCCTC-bindingfactor,CCCTC结合因子)可专一性与该42bp顺序结合。CTCF已在其它实验中被证明参与基因的转录激活与沉默，是一个含有11个锌指的分子量为82kD的蛋白质。人体T细胞受体α/δ座位及爪蟾（Xenopus）RO(repeatorganizer,重复顺序组织者)rRNA基因调控区绝缘子均有保守的CTCF结合位点(Bell,2001)。这些在进化上处于不同地位的物种中广泛存在绝缘子的现象表明，以绝缘子界定增强子的作用范围是真核基因组一种普遍的控制基因活性的机制第27页/共93页绝缘子与果蝇BX-C基因调控第28页/共93页果蝇腹节模式决定区中的绝缘子第29页/共93页染色质修饰与重建第30页/共93页

增强子作用的DNA环化模型与绝缘子的关系第31页/共93页高等生物基因组普遍存在甲基化1)DNA分子的化学修饰主要是甲基化，脊椎动物基因组中约60-80%双核苷酸CpG的胞嘧啶(C)被甲基化。被子植物基因组中，甲基化位置主要出现在CpG和CpNpG回文对称顺序，大约20-30%的胞嘧啶(C)被甲基化。DNA的甲基化在基因的表达调控中起重要作用。2）基因组的甲基化模式可影响表型并能通过体细胞遗传，但不该变细胞的基因型.

基因组的甲基化是表观遗传的重要内容之一.3)基因组DNA甲基化是基因表达调控的重要方式,并与染色体重建(chromatinremodeling)有关.第32页/共93页DNA去甲基化与肌肉细胞分化第33页/共93页基因组DNA甲基化的生物学1）细胞命运的确定与基因组DNA的甲基化状态有关；2）DNA甲基化是决定基因表达模式的重要因素；3）DNA甲基化模式可以在上下代细胞之间传递；4）DNA甲基化只限于碱基的修饰，并不改变DNA的顺序组成。

第34页/共93页染色质重建1)染色质重建(chromatinremodeling)系指染色体结构状态的改变.染色质重建可以是可逆的,也可以是不可逆的.2)染色质重建涉及DNA的甲基化,组蛋白的乙酰基化和去乙酰基化.3)染色质重建的目的是使染色质的物理状态处于松弛或收缩,其结果使转录活化因子可接触或不能接触调控顺序.第35页/共93页DNA甲基化与染色质重建第36页/共93页siRNA可诱导异染色质形成见:CurrentOpinioninCellBiology16:230-238,2004第37页/共93页siRNA介导的染色质沉默第38页/共93页

DNA甲基化与转座子活性第39页/共93页染色质结构的不可逆变化与基因沉默在个体发育与细胞分化过程中，当某些基因已经完成预定的表达程序后必需永久性关闭。这一任务可以通过DNA甲基化促使染色质的重建完成。Polycome:多结蛋白.第40页/共93页DNA甲基化抑制转座第41页/共93页等位基因成员的非对称表达1)二倍体基因组中每个等位基因均有两个等位基因成员.2)二倍体每个等位基因成员的表达模式有三种:

母源基因表达,父源基因表达,两个成员均表达3)有三种机制决定等位基因成员的非对称表达:1.X-染色体失活;2.基因组印记;3.随机选择.第42页/共93页基因组印记1)1991年TM.德切艾拉等报道,老鼠7号染色体上中有一个称为类胰岛素生长因子Igf2的基因(insulin-likegrowthfactorII),该基因的突变纯合子表现为侏儒症.在杂合子中,如果突变等位基因来自父亲,表型异常.如果来自母亲,表型正常,即母源Igf2基因在子代被抑制.2)这种因为亲本来源不同而使等位基因表达模式发生改变的现象称为印记(imprinting).它有两个特点:

1.子代的两个等位基因中有一个发生沉默,即不表达.2.哪一个等位基因沉默取决于等位基因的亲本来源.

这是在哺乳动物中最早发现的表观遗传现像.随后又在老鼠中发现另外一个基因,即7号染色体上与Igf2紧密连锁的H19也有类似的情况,只是表现相反,即父源的H19等位基因在子代中不表达,母源的H19基因在子代中正常表达.

第43页/共93页基因组印记的分子机制第44页/共93页绵羊肥臀突变的遗传符合典型的基因组印记模式In1996,ateamledbyCockettandGeorgesexplainedwhatwasgoingon:Onlylambsthatinheritthecallipygemutationfromtheirfather

butnottheirmotherdevelopthetrait.Allothercombinationsofnormalandcallipygechromosomesresultinnormalsheep.Theresearchersnamedtheeffectpolaroverdominance(极性超显性效应).见:TrendsinGenetics19:248-252,2003.第45页/共93页基因组印记的其它例子第46页/共93页DNA甲基化与基因组程序化

第47页/共93页受精胚与体细胞胚的发育差异哺乳动物体细胞胚胎发与受精卵胚胎发育存在许多异.这些差异主要表现在体细胚与受精胚基因组的程序化.受精胚的雄核与雌核在去甲化的程序上存在时间差.甲化程序的差异会导致胎发育异常.第48页/共93页双卵融合克隆小鼠

哺乳动物均有基因组印记,因此哺乳动物没有孤雌生殖.只有将野生型H19基因和突变型H19基因的卵细胞融合才得到成体克隆鼠.见:Nature428:860-864,2004第49页/共93页剂量效应1)剂量效应系指具有两份基因拷贝的个体和一份基因拷贝的个体在表现型上保持一致的机理.

2)多细胞生物中性别染色体在雌性和雄性细胞中的拷贝数不同,为平衡基因表达产物的数量,出现整条染色体被抑止或超激活现象.第50页/共93页染色体剂量效应染色体剂量效应可通过基因的上调或下调形式达到:1)哺乳动物雌性一条X-染色体失活,形成Barr小体;2)果蝇雄性X-染色体超表达以达到平衡;3)线虫雌性一条X-染色体低表达.第51页/共93页X

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染色体失活机制雌性老鼠在胚胎早期两个XIST等位基因低水平表达,但RNA产物不稳定,并与其编码基因结合.随着发育进行,其中一个XIST基因的表达逐步稳定最终覆盖了其所在的整个X-染色体.另一X-染色体上的XIST基因则随之因启动子甲基化而关闭.选择那条X-染色体失活是一个随机的过程.第52页/共93页干细胞与表观遗传第53页/共93页人类皮肤细胞诱导成

胚胎多能干细胞美日两国研究小组2007年11月20日分别在两家权威科学杂志发表相关研究报告,宣称成功将人类皮肤细胞诱导成多能干细胞,即iPS(inducedpluripotentstem)

。美国威斯康星大学詹姆斯·汤姆森实验室的研究发表在《科学》杂志，而日本京都大学教授山中伸弥领导的研究小组把报告发表在《细胞》杂志。两个小组的研究方法和原理大同小异。山中伸弥研究小组从一名36岁女性的脸部提取了科学家称为纤维原细胞的皮肤细胞。詹姆斯·汤姆森实验室的皮肤细胞来自一名新生儿的阴茎包皮细胞。詹姆斯·汤姆森实验室的旅美华人女科学家俞君英参与了这次皮肤干细胞的研究。学界评价这一突破可能意味着风靡一时的胚胎干细胞克隆技术将退出舞台。

第54页/共93页俞君英在汤姆森实验室内进行

有关干细胞的试验

第55页/共93页基因组程序化与胚胎干细胞1)什么是胚胎干细胞?2)胚胎干细胞的医学意义3)如何获取胚胎干细胞?4)人类胚胎干细胞获取的困难5)从人体体细胞诱导胚胎干细胞的可能性6)哺乳动物体细胞重新程序化(reprogramming)第56页/共93页人类iPS细胞的培育过程1)筛选与克隆控制胚胎干细胞基因组重新程序化的基因.2)把4种基因注入皮肤细胞，这些特定基因能够“重组”皮肤细胞的基因.3)将普通人体皮肤细胞成功改造成干细胞.4)培育器官从理论上讲，这种干细胞的功能类似通过胚胎克隆技术取得的胚胎干细胞，能够最终培育成人体组织或器官.

第57页/共93页灵长类胚胎干细胞ThomsonJA对灵长类胚胎干细胞所给出的定义特征如下:1)来自未植入子宫之前的胚胎;2)可以无限保持未分化及增生状态;3)即使在培养之后仍然可以稳定地发育成胚胎的三个胚层,具有多向分化的潜能.见:Science282,1998第58页/共93页胚胎的特征及发育第59页/共93页全能性干细胞所应具有的特征1)来源于一个全能性的细胞群体;2)具有正常的细胞核型;3)具永生性,半场在胚胎状态下能无限制的分裂;4）培养的细胞株在体外或在畸胎瘤中能自发分化成胚胎外组织（extraembryonictissues）和分属所有3种胚层的体细胞此前所有已培养成功的哺乳动物细胞中，除小鼠外，灵长类动物ES细胞只满足上述4条标准的前3条。

第60页/共93页体细胞可以逆转成为胚胎干细胞1)就基因组的遗传信息组成而言,每个体细胞都具备潜在的可能.2)因为体细胞是胚胎发育与形态建成的终极产物,自然状态下这是一个屗可逆的过程3)胚胎发生与细胞分化是基因组程序化的结果,体细胞要逆转为胚胎干细胞必需重新程序化.4)因体细胞核移植到卵细胞中可以获得类似自然受精发育的胚胎,在卵细胞中必定存在使基因组重新程序化的因子.5)将基因组重新程序化的因子导入体细胞可以使体细胞命运逆转,产生具有多能分化的干细胞.第61页/共93页几个关键的步骤1)基因组重新程序化基因的筛选2)基因组重新程序化基因的转化3)转化细胞的筛选与鉴定4)iPS细胞的功能验证第62页/共93页常规胚胎干细胞的获取及培养第63页/共93页诱导哺乳动物体细胞转变为

胚胎干细胞1)根据核移植可以判断卵细胞中含有促使体细胞基因组重新程序化的因子.2)胚胎干细胞可以持续维持多能分化的潜力,表明有控制胚胎干细胞属性(identity)的遗传因素.3)分离与鉴定与胚胎干细胞生成与维持的基因是逆转体细胞程序化的前提.第64页/共93页寻找决定胚胎干细胞命运的基因1)Yamanaka等选择24个在胚胎干细胞和肿瘤细胞中表达上调的基因作为胚胎干细胞决定候选基因.2)将上述基因构建到逆转录病毒表达载体中,它们处于Fbx15基因的调控顺序下游,并将它们转化老鼠胚胎成纤维细胞(MEF).3)Fbx15基因是胚胎干细胞专一性表达的.4)实验结果证实单个外源基因的导入不能获得胚胎成纤维细胞的逆转,但组合的转化可产生具有胚胎干细胞形态特征的细胞,这些细胞被称为iPS(inducedpluripotentstem)细胞.见:Cell126:663-676,2006第65页/共93页胚胎干细胞命运决定基因筛选策略第66页/共93页胚胎干细胞决定基因的筛选1)上述小组在10个基因组合产生MEF细胞逆转的基础上,采取排除法确定4个基因为MEF细胞逆转所必需,分别为:Oct3/4,Klf4,Sox2和c-Myc.2)在这初筛的4个基因中任意缺失一个基因,均不能产生类胚胎干细的特征.因此这4个基因是最低要求的逆转MEF细胞的因子.3)Oct3/4,Klf4,Sox2和c-Myc四个基因转化的MEF细胞可促使Fbx15和Nanog基因的表达.4)Fbx15和Nanog基因的表达可作为筛选iPS细胞的标记.第67页/共93页iPS细胞功能的验证1)iPS-MEF细胞系具有类似天然胚胎干细胞的形态特征.2)iPS-MEF细胞系的Oct3/4和Nanog基因的启动子区核小体组蛋白的乙酰基化和K9的甲基化以及CpG双碱基甲基化模式与胚胎干细胞类似.3)iPS-MEF细胞系的DNA芯片杂交检测基因表达譜也与胚胎干细胞类似.4)将iPS-MEF细胞系注入到裸鼠皮下细胞可产生畸胎瘤,表明具有胚胎干细胞特征.第68页/共93页iPS-MEF具多向分化潜能将iPS-MEF转化细胞注入到裸鼠皮下组织后可产生的畸胎瘤含有不同的组织细胞,具多向分化潜能.第69页/共93页逆转的老鼠胚胎成纤维细胞具多向分化潜能第70页/共93页Nanog更适合iPS细胞筛选因为以Fbx15为标记筛选的iPS-MEF与天然老鼠囊胚混合后不能生成嵌合成体,其胚胎干细胞潜能竞争力差.实验证明Nanog更适合.第71页/共93页Nanog

更适合iPS

细胞筛选以Nanog为标记的筛选可获得具有细胞增生的iPS及畸胎瘤分化的胚胎干细胞.第72页/共93页转化人类皮肤细胞为胚胎干细胞Yu等的研究如下:1)选择14个涉及胚胎干细胞形成与维持相关的基因构建到逆转录病毒载体中转化体细胞.2)根据不同的基因组合转化体细胞为胚胎干细胞效果,确定4个基因即Oct4,Sox2,Nanog和Lin28足以转化体细胞为胚胎干细胞.3)由人类皮肤体细转化为胚胎干细胞的验证.第73页/共93页由人类皮肤体细转化为

胚胎干细胞的验证1)iPS细胞具有人类自然胚胎干细胞的形态.2)iPS细胞具有正常的核型.3)具端粒酶活性.4)细胞表面膜蛋白标记与自然胚胎干细胞相同.5)基因表达譜相一致.6)Oct4启动子甲基化模式与自然胚胎干细胞相似.7)具有发育成三胚层细胞的潜能,来自iPS细胞的畸胎瘤可分化为多种组织细胞.第74页/共93页畸胎瘤的分化iPS细胞系接种到裸鼠肌肉组织产生畸胎瘤并分化出不同的组织细胞:左,神经细胞,内胚层发育;右,肠道细胞,内胚层发育.第75页/共93页iPS细胞具有癌症倾向1)iPS细胞可与天然小鼠胚胎囊胚期细胞混合并参于胚胎发育长成成年个体.2)含有iPS来源的小鼠个体有一定的比例产生癌症.3)产生癌症的原因:1,LTR载体的影响;2,

c-Myc基因具有癌变的潜能.4)路漫漫兮其修远,……….第76页/共93页产生iPS

细胞的多种方法NatureBiotechnology,26:1246,2008第77页/共93页干细胞重新程序化方法比较第78页/共93页染色质重建与基因转录基因转录时要以编码DNA为模板合成mRNA前体,但DNA分子缠绕在核小体上,因此必需使DNA离开核小体.第79页/共93页染色质的结构第80页/共93页染色质重建依赖于组蛋白的修饰1)核小体的修饰是染色质水平进行基因表达调控的中心环节.2)核小体修饰的目的是促使核小体核心8聚体与DNA分子的结合或者松弛或者强化,便于核小体移动