酵母表达系统

关于酵母表达系统第一页，共四十三页，编辑于2023年，星期四三酵母表达系统甲醇酵母表达系统酿酒酵母表达系统其它酵母表达系统第二页，共四十三页，编辑于2023年，星期四（一）酿酒酵母表达系统酿酒酵母分泌系统酿酒酵母系统启动子酿酒酵母表达系统存在的问题酿酒酵母糖基化系统第三页，共四十三页，编辑于2023年，星期四1、酿酒酵母启动子UASURSTATA起始位点编码序列mRNA40-120bp20-40bp100-1400bp1、转录起始位点；4、URS：上游阻遏序列2、TATA盒：富含AT；5、DAS：下游激活序列3、UAS：上游激活序列;DAS第四页，共四十三页，编辑于2023年，星期四1）糖酵解途径中关键酶的强启动子，受葡萄糖诱导：甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因GAPDH磷酸甘油激酶基因PKG乙醇脱氢酶基因ADH酿酒酵母表达系统常用启动子第五页，共四十三页，编辑于2023年，星期四2）半乳糖激酶启动子（GAL1）GAL1GAL7GAL10UASGAL4GAL80A、GAL1、GAL7和

GAL10基因连锁在一起，独立转录，共同调控B、GAL4产物与UAS结合，促进转录；GAL80产物抑制GAL4产物的活性，阻遏转录C、野生型GAL4表达水平低，产物活性可被GLAL80产物完全抑制，半乳糖诱导效果差半乳糖诱导、葡萄糖抑制第六页，共四十三页，编辑于2023年，星期四2）半乳糖激酶启动子（GAL1）GAL1GAL7GAL10UASGAL4GAL80A、将GAL4的启动子换成GAL10的诱导型强启动子B、半乳糖诱导GAL4高表达，不受GAL80产物抑制，激活GAL1等高效转录半乳糖诱导、葡萄糖抑制PromoterGAL10第七页，共四十三页，编辑于2023年，星期四3）pho4TS-PHO5启动子A、PHO5启动子在培养基缺磷酸盐时启动转录B、PHO4基因编码产物是PHO5启动子的正调控因子C、pho4TS温度敏感，35℃时失活，PHO5关闭D、pho4TS-PHO5启动子通过降温（23℃）诱导表达低温诱导、磷酸盐抑制第八页，共四十三页，编辑于2023年，星期四酿酒酵母系统常用分泌信号肽来源：

性结合因子：MF-α

酸性磷酸酯酶：PHO5

蔗糖酶：SUC2

杀手毒素因子：KIL2、酿酒酵母分泌系统第九页，共四十三页，编辑于2023年，星期四*保守性低，大多异源宿主系统的信号肽不能互用*信号肽结构：

酿酒酵母信号肽特点正电荷区疏水区极性区Met目的蛋白信号肽剪切位点第十页，共四十三页，编辑于2023年，星期四*分泌效率高*在酵母系统具有通用性*88个残基组成

MF-α信号肽Met目的蛋白-Lys-Arg-Glu-Ala-Glu-Ala-KEX2DAPDAPDAP：STE13编码的二肽酶第十一页，共四十三页，编辑于2023年，星期四糖基化位点：Asn-X-Thr/Ser（X代表任何氨基酸）N-型糖基化：天门冬酰氨酸残基上的酰胺氮进行糖基化，对蛋白质的折叠、稳定性及活性较重要。O-型糖基化：苏氨酸/丝氨酸上的羟基氧进行糖基化

3、酿酒酵母糖基化系统第十二页，共四十三页，编辑于2023年，星期四*过糖基化（超糖基化修饰）：

N型或O型糖基的外链进一步形成庞大的、由甘露糖组成的、复杂分支结构的现象。增加了免疫原性、对活性与药代稳定性均有影响。*糖链组成O型糖链仅由甘露糖组成、而哺乳细胞的还含唾液酸基团酿酒酵母糖基化特点第十三页，共四十三页，编辑于2023年，星期四1）表达水平普遍不高

A、表达载体传代不稳定（YEp、YRp）

B、所采用的强启动子调控不严谨

C、不能利用简单的无机培养基进行高密度发酵2）分泌表达产物过糖基化4、酿酒酵母表达系统的缺陷第十四页，共四十三页，编辑于2023年，星期四（二）甲醇酵母表达系统甲醇酵母与甲醇氧化酶启动子甲醇酵母表达系统的应用甲醇酵母表达系统操作原理甲醇酵母系统高效表达影响因素与对策甲醇酵母表达系统的优缺点第十五页，共四十三页，编辑于2023年，星期四1、甲醇酵母与甲醇氧化酶启动子甲醇酵母（methylotrophicyeast)

指可利用甲醇作单一碳源的一类酵母。

毕赤酵母（Pichiapastoris)

汉森酵母（Hansenulaploymorpha)

假丝酵母（Candiaboidinii)

第十六页，共四十三页，编辑于2023年，星期四1、甲醇酵母与甲醇氧化酶启动子甲醇氧化酶A、甲醇代谢关键酶，占可溶蛋白的30%以上

B、名称和拷贝数不同毕赤酵母/假丝酵母汉森酵母

醇氧化酶甲醇氧化酶alcoholoxidase,AOXmethanoloxidase,MOXAOX1、AOX2MOX第十七页，共四十三页，编辑于2023年，星期四1、甲醇酵母与甲醇氧化酶启动子AOX1与AOX2*毕赤酵母和假丝酵母基因组存在二个AOX基因AOX1、AOX2*AOX1与AOX2基因97%同源*AOX1占主导地位，负责AOX99%以上活性第十八页，共四十三页，编辑于2023年，星期四1、甲醇酵母与甲醇氧化酶启动子甲醇氧化酶启动子A、目前已发现的、最强的真核启动子B、严谨调控型启动子AOX1：葡萄糖和甘油脱阻遏、甲醇诱导MOX：葡萄糖阻遏、甘油脱阻遏、甲醇诱导

第十九页，共四十三页，编辑于2023年，星期四2、甲醇酵母表达系统的优缺点A、表达水平高（最高水平的系统）B、产物可翻译后修饰：糖基化、磷酸化、酰脂化C、过糖基化程度比酿酒酵母少（8-15个vs100-150个甘露糖）D、产物可正确折叠和高效分泌（最高分泌表达系统）E、可利用简单无机盐培养基高密度发酵，生物量大。F、实验室和工业操作简单G、不能满足结构要求严格的糖基化

第二十页，共四十三页，编辑于2023年，星期四3、甲醇酵母表达系统操作原理宿主株与标记基因甲醇酵母系统的整合事件胞内表达与分泌表达第二十一页，共四十三页，编辑于2023年，星期四甲醇酵母系统宿主二大宿主系统主要特点项目毕赤酵母汉森酵母最适温度30℃37℃最适pH值4.54.5甘油阻遏是否糖基化部分过度较正常高密度发酵100g/L100g/L第二十二页，共四十三页，编辑于2023年，星期四甲醇酵母系统宿主二大宿主系统主要选择标记宿主

选择标记毕赤酵母

his4、G418、Zeocin、Cu++汉森酵母leu2、his3、ura3、G418第二十三页，共四十三页，编辑于2023年，星期四甲醇酵母系统宿主毕赤酵母系统主要宿主株宿主株

特点Y11430野生型、Mut+GS115his4-、Mut+KM71his4-、aox1::ARG4(AOX1-)、Muts

SMD1168his4-

、胞外蛋白酶缺陷，高分泌MC1003his4-、AOX1-、AOX2-，甲醇不生长第二十四页，共四十三页，编辑于2023年，星期四甲醇酵母系统的整合事件YRp型载体：汉森系统传代不稳定，传代过程同源或非同源重组，高选择压力迫使高拷贝数整合，可达100拷贝。YIp型载体：A、在靶序列处线性化载体DNA，诱导同源重组B、有“插入”和“取代”二类整合模式C、主要为单拷贝整合，1-10%为多拷贝整合

第二十五页，共四十三页，编辑于2023年，星期四毕赤酵母系统模式表达载体第二十六页，共四十三页，编辑于2023年，星期四1）AOX1位点插入宿主株:GS115、KM71可插入位点：5’AOX13’AOX1TT转化子：GS115:His+Mut+KM71:His+Muts第二十七页，共四十三页，编辑于2023年，星期四2）His4位点插入转化子：GS115:His+Mut+KM71:His+Muts宿主株:GS115、KM71可插入位点：5’His43’His4第二十八页，共四十三页，编辑于2023年，星期四3）多基因插入事件（串联整合）宿主株:GS115、KM71可插入位点：5’AOX13’AOX1TT转化子：GS115:His+Mut+KM71:His+Muts第二十九页，共四十三页，编辑于2023年，星期四4）基因取代（GS115，AOX1+）转化子：His4+Muts第三十页，共四十三页，编辑于2023年，星期四汉森酵母系统的高拷贝整合型表达载体高拷贝整合元件：A、高度重复序列：rDNA

提供多个整合位点B、缺陷型标记基因：Leu2d

提高选择压力C、抗性标记；neo

提高选择压力

第三十一页，共四十三页，编辑于2023年，星期四甲醇酵母系统胞内表达载体表达载体类型需要带入ATG单位点第三十二页，共四十三页，编辑于2023年，星期四甲醇酵母系统胞内表达载体表达载体类型需要带入ATG多位点第三十三页，共四十三页，编辑于2023年，星期四甲醇酵母系统分泌表达载体信号肽：PHO1第三十四页，共四十三页，编辑于2023年，星期四甲醇酵母系统分泌表达载体信号肽：MFα第三十五页，共四十三页，编辑于2023年，星期四甲醇酵母系统分泌表达载体信号肽：MFα标记：Kan第三十六页，共四十三页，编辑于2023年，星期四4、甲醇酵母系统高效表达影响因素与对策载体稳定性基因剂量整合位点甲醇利用表型mRNA5’端AT含量分泌信号表达产物稳定性第三十七页，共四十三页，编辑于2023年，星期四1）载体稳定性同拷贝数时，整合型的比自主复制型的表达水平高YRp型载体的稳定化：

选择—非选择培养交替数十代可得稳定的整合子，但费时，整合位点不确定。采用YIp型载体:

更易实现整合、整合位点清楚第三十八页，共四十三页，编辑于