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文档简介
第六章几种典型的分子生物学技术第一节凝胶电泳技术第二节DNA核苷酸序列分析第三节核酸分子杂交(DNA/DNAorDNA/RNA)技术第一节凝胶电泳技术一、概述1.核酸的凝胶电泳是一种分析鉴定重组DNA分子及蛋白质与核酸相互作用的重要实验手段,同时也是分子生物学研究方法的技术基础。2.基本原理带有负电荷的DNA或RNA核苷酸链,依靠无反应活性的稳定的介质(琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶)和缓冲液,在电场中以一定的迁移率从负极移向正极。根据核酸分子大小不同、构型或形状的差异,以及所带电荷的不同,可以通过电泳将其混合物中的不同成分彼此分开。3.电泳的迁移率
取决于核酸分子本身的大小和构型。分子量较小的DNA分子,比分子量较大的DNA分子迁移率要快;同等分子量的不同构型的核酸分子,构型紧密的比松散型的开环DNA分子或线性DNA分子迁移率要快
4.凝胶电泳的分辨力
与凝胶的类型和密度相关
例如:琼脂糖凝胶的分辨力在0.2~50Kb之间;聚丙烯酰胺的分辨力在1~1000bp之间第一节凝胶电泳技术二、凝胶电泳技术种类(一)琼脂糖凝胶电泳(二)聚丙烯酰胺凝胶电泳
(三)脉冲电场凝胶电泳
(四)变性梯度凝胶电泳(五)温度梯度凝胶电泳(六)单细胞凝胶电泳技术
(一)琼脂糖凝胶电泳
(agarosegelelectrophoresisAGE)
1.琼脂糖是一种从红色海藻中提取出的线性多糖聚合物。分为常熔点的琼脂糖和低熔点(LMP)琼脂糖。2.LMP琼脂糖熔点:62~65℃
熔解后,在37℃可保持液态数小时;在25℃可保持液态约10min3.回收DNA分子在65℃下将LMP琼脂糖凝胶熔化;加入过量的酚抽提DNA;离心获得含DNA分子的上清液;4.直接酶切(一)琼脂糖凝胶电泳
5.琼脂糖凝胶电泳的参数
缓冲液:1×
TAE(TBETPE)凝胶的含量:根据检测的DNA大小加DNA样品:<1μg,指示剂电泳条件:大片断低电压长时间,小片段高电压短时间染色和观察:溴化乙锭(ethidiumbromide,EB)染色,在300nm波长的紫外下观察(凝胶成像仪)。能看到0.05μg的微量DNADNA的片断大小与荧光强度成正比
AgarosegelelectrophoresisSeparationRangeVs.%AgaroseLowGelingAgarose4-6 0.02-0.4
用已知分子量的标准DNA对DNA片断大小的估算
SampleWell25ng1kbladder0.8%Agarose124681012kbAgaroseGelElectrophoresisEtBrDetectionLimit:~5-10ngDNA根据标准DNA相对迁移距离推测待测定的DNA片段的大小Agarosegelelectrophoresis(二)聚丙烯酰胺凝胶电泳
(polyacrylamidgelelectrophoresis,PAGE)
缓冲液:Tris-硼酸(TBE)
凝胶聚丙烯酰胺:丙稀酰胺/亚甲双丙稀酰胺(29:1);四乙基乙二胺(TEMED)和过硫酸铵(Ap)(10%)。PolyAcrylamideGels(三)脉冲电场凝胶电泳
(pulsed-fieldgelelectrophoresisPFGE)
1.1984年,D.R.Cantor发明的。分离高达107bp的超大分子量的DNA分子。2.在脉冲电泳中,电场方向是周期变化的,头一个脉冲电场方向与核酸的移动方向成45℃角,下一个脉冲的电场方向与核酸移动方向在另一侧成45℃角,由于加在琼脂糖凝胶电泳上的电场方向、电流大小、以及作用时间都在交替地变换着,这就使得DNA分子必须随时调整其泳动的方向,来适应凝胶孔隙的无规则变化。与分子量小的DNA分子相比,分子量大的DNA分子需要较多的次数来更换其构型和方位,使之能够按新的方向游动,所以迁移率就慢,从而达到了分离大分子量DNA分子的目的。PFGEcanresolvelargeDNAfragments(四)变性梯度凝胶电泳
(denaturedgradientgelelectrophoresis,DGGE)
最初是Lerman等人于20世纪80年代初期发明的,起初主要用来检测DNA片段中的点突变。Muyzer等人在1993年首次将其应用于微生物群落结构研究。后来又发展出其衍生技术。(五)温度梯度凝胶电泳
(temperaturegradientgelelectrophoresisTGGE)该技术被广泛用于微生物分子生态学研究的各个领域,目前已经发展成为研究微生物群落结构的主要分子生物学方法之一。原理:
DGGE/TGGE技术在一般的聚丙烯酰胺凝胶基础上,加入了变性剂(尿素和甲酰胺)梯度,从而能够把同样长度但序列不同的DNA片段区分开来。一个特定的DNA片段有其特有的序列组成,其序列组成决定了其解链区域(meltingdomain,MD)和解链行为(meltingbehavior)。一个几百个碱基对的DNA片段一般有几个解链区域,每个解链区域有一段连续的碱基对组成(图1)。(六)单细胞凝胶电泳技术(SCGE)是Ostling等(1984)首创的,以后经Singh等(1988)进一步完善而逐渐发展起来的一种快速检测单细胞DNA损伤的实验方法,因其细胞电泳形状颇似慧星,又称慧星试(cometassay)。SCGE是评价遗传毒性损害非常敏感的实验,可以检测到每1.657×10-37kg中0.1个DNA的断裂。与经典的染色体畸变、微核、SCE相比,SCGE可以用于活细胞DNA的检测,也能用于死亡细胞DNA的分析,使SCGE不仅可以研究低剂量下的生物效应,也可用于研究高剂量下的生物效应;同时SCGE又可提供DNA修复能力的信息,这使得SCGE非常适用于评价受试物的遗传毒性剂及材料
试剂:1)PBS(磷酸盐缓冲液)
2)0.8%正常熔点凝胶(PBS配制)3)0.6%低熔点凝胶(PBS配制)4)毛玻璃片5)盖玻片6)碱性裂解液(2.5mol/LNaCl;100mmol/LNa2EDTA;10mmol/LTris;1%肌氨酸钠),临用前加10%DNMSO,1%TritonX-1007)电泳缓冲液(1mmol/LNa2EDTA;300mmol/LNaOH;Tris-HCl,pH7.5)8)EB(2ug/ml)步骤
1.制备第一层胶:100ml0.8%正常熔点胶,加盖盖玻片,4℃固化10min;2.制备第二层胶:轻轻地去除盖玻片,在第一层胶上滴加75ul含1×10000个细胞的0.6%低熔点胶(cell与凝胶比例为1:5),加盖盖玻片,4℃固化10min;3.裂解:去掉盖玻片,将凝胶浸入冰冷的碱性裂解液内(临用前加10%DMSO(二甲基亚砜)),1%TritonX-100),4℃裂解1h;4.取出玻片,用PBS缓冲液漂洗3次后置于水平电泳槽内,加入pH13的电泳缓冲液(没过玻片2-3min),放置20min(黑闭)。5.电泳:电压20V,300mA,30min6.取出玻片,用PBS或Tris-HCl,pH7.5漂洗3次,每次3min;7.染色:胶上滴加3ulEB,加盖盖玻片,24h检测。或者4℃,潮湿,闭光的条件下保有胶片,观察时再染色,镜检。第二节DNA核苷酸序列分析传统的DNA序列分析法:Sanger双脱氧链终止法Maxam-Gilbert化学分析法新发展的DNA杂交测序法一、Sanger双脱氧链终止法1.原理:
双脱氧链终止法要求使用一种单链的DNA模板和一种适当的DNA合成引物。利用DNA聚合酶的两种酶催化反应的特性:第一,DNA聚合酶能够利用单链的DNA为模板,合成出准确的DNA互补链;第二,DNA聚合酶能够利用2’,3’-双脱氧核苷三磷酸作底物,使之参入到寡核苷酸链的3’-末端,从而终止DNA链的延长。2.影响因素:
dNTP/ddNTP=1:100,DNA的谱带分离效果较佳。可读出200个以上的核苷酸顺序。降低ddNTP(双脱氧)与dNTP的比例,就会产生出逐渐加长的片段产物,用聚丙烯酰胺凝胶分离,可读出300个左右的核苷酸顺序。必须用限制性内切酶把高分子量的DNA分子消化为合适的片断,经电泳分离纯化后,才能用来序列分析。采用分子克隆的方法,即将酶切消化的片断随机的连接到一种适合的载体上。引物(通用引物)是载体上的一段序列,它能特异性的同载体分子上克隆位点相连的单链DNA区段杂交。3.常见类型(1)Sanger双脱氧-M13体系M13是噬菌体载体,可以得到单链的DNA序列。(2)Sanger双脱氧-pUC体系pUC是一种质粒载体,利用双链质粒DNA模板的双脱氧DNA序列分析法。
二、Maxam-Gilbert化学分析法
1977年由美国大学A.M.Maxam和W.Gilbertf发明。1.原理:
用化学试剂处理末端放射性标记的DNA片断,造成碱基的特异性切割。由此产生的一组具有不同长度的DNA链的反应混合物,经凝胶电泳按大小分离和放射自显影之后,便可根据x光底片上所显示的相应谱带,直接读出待测DNA片断的核苷酸序列。由于这种化学切割反应的特异性是由碱基的修饰作用决定的,所以切割反应必定是定量的。
2.化学切割反应的试剂(1)肼(hydrazine):又叫联氨(NH2.NH2),在碱性条件下,与胸腺嘧啶(T)和胞嘧啶(C)作用。再通过六氢吡啶的作用,使两个磷酸分子从糖片断上释放出来,从而导致在核苷酸位置上发生DNA的断裂。盐存在的条件下,联氨同胸腺嘧啶(T)的反应便会被抑制,最终只发生胞嘧啶碱基特异的切割反应。由此来区别C和C+T这两种化学反应。
(2)硫酸二甲酯(dimethylsulphate(CH3O)2SO4)
一种碱性的化学试剂。在它的作用下,DNA碱基环中的氮原子会发生甲基化反应,在中性的PH值环境中,可导致配糖键发生水解,使去碱基的糖-磷酸键十分微弱,在碱性条件下磷酸分子就能从DNA链上脱落,造成链的断裂。鸟嘌呤(G)的N7>腺嘌呤(A)的N34~10倍在六氢吡啶的作用下,从脱氧核糖上移去2个磷酸分子,使DNA链在甲基化的鸟嘌呤G位点断裂。
三、DNA测序分析的自动化
用四甲基若丹明(tetramethylrhodamine)作荧光剂,预先标记M13引物DNA5’-末端,按标准的双脱氧链终止法同引物进行反应,用聚丙烯酰胺电泳分析。在电泳过程中,用激光激发电泳的片断产生荧光,被荧光感受器接受,最终转换成电信号,被计算机读出,或打印出来四、DNA杂交测序
(sequencebyhybridizationSBH)
1.原理
如果一段短的DNA探针能够与较长的靶DNA片断杂交,并形成完全的双链体分子,那么我们便可以根据此来推断在靶DNA序列长存在着相应的互补序列。2.步骤
1.将待测的靶DNA分子与一组已知核苷酸序列的寡核苷酸探针进行杂交2.对能与待测DNA杂交的探针之间的碱基重叠关系作比较分析,据此推算靶DNA的核苷酸序列。
3.两种操作方式(1.)将不同的寡核苷酸与固定在滤膜上的靶DNA序列样品进行杂交(2)应用寡核苷酸矩阵芯片的DNA杂交测序法杂交的检测:磷光成像仪和图象分析软件
错配的碱基会导致杂交信号强度下降。6mer500bp7mer2000bp8mer8000bp
4.SBH的应用
(1)检测靶DNA的单碱基突变(2)用于不同片断之间的序列比较分析(同源性序列检测)(3)用表达序列标签(EST)的矩阵芯片,检测不同类型细胞中或不同生长发育状态下的细胞中特定基因的表达状况。(4)检测传统的测序技术所得DNA片断的核苷酸序列数据。第三节核酸分子杂交(DNA/DNAorDNA/RNA)技术及其应用
核酸分子杂交技术,是在1968年由华盛顿卡内基学院(CavnegieInstituteofWashington)的RoyBritten及其同事发明的。所依据的原理是,带有互补的特定核苷酸序列的单链DNA或RNA,当它们混合在一起时,其相应的同源区段将会退火形成双链的结构。
核酸分子杂交:把亲源关系较近的,不同生物个体来源的变性DNA或RNA单链,经退火处理形成DNA-DNA或DNA-RNA这一过程叫分子杂交
杂种核酸分子:彼此退火的核酸来自不同的生物有机体,而形成的双链分子。DNA/DNA的杂交作用:检测特定生物有机体之间的亲源关系DND/DNA或RNA/DNA的能力:揭示核酸片断中某种特定基因的位置。一、核酸分子杂交技术的原理
有互补特定核苷酸序列的单链DNA或RNA混在一起时,其相应同源区段将会退火形成双链结构。如把一段已知基因(DNA或RNA)核酸序列用合适标记物(如放射性同位素、生物素等)予以标记,当作探针(probe),与变性后的单链基因组DNA或RNA进行杂交。再用合适方法(如放射自显影或免疫组织化学等技术)把标记物检测出来,就可确定靶核苷酸序列是否存在、拷贝数及表达丰度等。
二、核酸探针的制备
1.探针(Probe)的概念:一段带有检测标记的与目的基因或目的DNA特异互补的已知核苷酸序列。
2.探针的制备方法长度一般以50~300bp为宜。制备方法:(1)DNA重组技术(2)PCR扩增(3)化学合成3探针的分类
据来源及性质不同可分为:(1)基因组DNA探针(2)cDNA探针(3)RNA探针(4)寡核苷酸探针4合成寡核苷酸探针注意原则(1)长度(10-50bp);(2)G:C对含量40%-60%;(3)探针内避免互补;(4)避免同一碱基连续出现;(5)与非靶序列有70%以上同源性或连续8个以上碱基序列相同,最好不用。三、核酸探针的标记
为确定探针是否与相应基因组DNA杂交,有必要对探针加以标记,以便在结合部位获得可识别的信号。
1.标记的种类同位素:32P、35S、3H、125I等标记探针非同位素:生物素、地高辛配体、荧光素等作为标记物两者比较:后者不及前者敏感,但后者保存时间较长,无同位素污染。一个理想的标记物应满足:(1)标记前后探针基本结构、化学性质相同;(2)特异性强、本底低、重复性好;(3)操作简单、节时;(4)安全、无环境污染。2探针的标记方法(1)缺口平移法(2)随机引物标记法(3)末端标记法(4)生物素光照标记法(1)缺口平移法
将DNAaseI的水解活性与大肠杆菌DNApolymeraseI的5`→3`的聚合酶活性和5`→3`的外切酶活性相结合。首先用E.coli的DNAseI在探针DNA双链上造成缺口,然后再借助于DNApolI的5`→3`外切酶活性,切去带有5`-磷酸的核苷酸;同时利用该酶5`→3`聚合酶活性,使生物素或同位素标记的互补核苷酸补入缺口。这两种活性同时作用,缺口不断向3`方向移动,DNA链上的核苷酸不断为标记的核苷酸取代,成为带有标记的DNA,纯化除去游离脱氧核苷酸后成为标记DNA探针。
(2)随机引物法
是使用寡核苷酸引物和大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段来标记DNA片段。1.优点:(1)标记核苷酸在DNA探针中的掺入率可达50%以上。由于在反应过程中加入的DNA片段不被降解,故在随机引物反应中加入的DNA可少于200ng,甚至10ng也能有效地标记。(2)DNA片段的大小不影响标记的结果。标记物沿所加入的全长DNA被均等地掺入。标记的探针可以直接使用而不需要去除未掺入的核苷酸;(3)单链双链DNA都可作为随机引物标记的模版。随机引物可用于较小的DNA片段(100~500bp),而缺口平移法对大DNA片段(>1000bp)效果最好。2.缺点(1)产生的标记探针量比缺口平移的要少些,(2)环状DNA不能有效地标记,必须先用限制性内切核酸酶线形化或用碱法或DNA酶Ⅰ产生缺口。(3)末端标记法(1)一种是在5`末端加成标记法:先用碱性磷酸酶(AP)去掉dsDNA5`-磷酸,再用T4多核苷酸激酶催化标记的ATP的γ-磷酸转移加到DNA片段5`-OH上。(2)在探针3`-末端用末端转移酶掺入一个单标记的[α-32P]dNTP。(4)生物素光照标记法
光敏生物素在紫外线照射下与DNA或RNA的碱基发生化学加成反应,获得生物素标记的DNA探针。四、核酸分子杂交技术硝酸纤维素膜不能滞留小于150bp的DNA片断,不能同RNA结合。应用1mol/L醋酸铵和0.2mol/L的NaOH缓冲液代替SSC缓冲液可改善对小片断DNA的滞留能力。RNA变性后也能十分容易的结合到膜上。尼龙膜或硝酸纤维素膜杂交的步骤:1.核酸印迹转移:将核酸样品转移到固体支持膜上。利用的是毛细管作用2.印迹杂交:将具有核酸印迹的滤膜同带有标记的DNA/RNA进行杂交。核酸杂交常用几种膜的性能比较
印迹转移前的凝胶处理:分子量不同所需转移的时间不同;浸泡在0.25M的HCL溶液中脱嘌呤,再进行碱变性碱水解,DNA链断裂单链在进行核酸印迹转移的时1.要将以转好的硝酸纤维素膜在80度下烘烤1~2小时;2.紫外线交联法,将DNA分子上的部分胸腺嘧啶残基同尼龙膜表面的带正电荷的氨基基团之间进行交联。根据毛细管作用的原理,使在电泳凝胶中分离的DNA片段转移并结合在适当的滤膜上,然后通过同标记的单链DNA或RNA探针的杂交作用检测这些被转移的DNA片段,这种实验方法叫做DNA印迹杂交技术。由于它是由E.Southern于1975年首先设计出来的,故又叫SouthernDNA印迹转移技术。
1Southern(萨瑟恩)印迹杂交(a)(b)(c)(d)(e)基因组DNADNA限制片段硝酸纤维素滤膜同探针同源杂交的基因DNA片段X光底片Southern凝胶转移杂交技术白瓷盘玻璃板滤纸凝胶尼龙膜滤纸吸水纸玻璃板重物吸水纸转膜。真空转膜槽滤纸尼龙膜凝胶盖子+-真空转膜SouthernDNA印迹杂交之X光显像图片
水稻(OryzasativaL.)的叶绿体DNA分别用核酸内切限制酶BglⅡ(A-C)、BamHⅠ(D-F)、EcoRⅠ(G-I)、和HindⅢ(J-L)消化,加样在含有EtBr染料的1%的琼脂糖凝胶电泳中作电泳分离,然后同32P标记的玉米psbA探针作Southern杂交。X光底片中显现的阳性条带,表明含有水稻的psbA基因序列。2Northern(诺赛恩)印迹杂交
检测目的RNA的存在与否及含量。
1979年,J.C.Alwine等人发展而来,是将RNA分子从电泳凝胶转移到硝酸纤维素滤膜或其他化学修饰的活性滤纸上,进行核酸杂交的一种实验方法。由于这种方法与萨瑟恩DNA印迹杂交技术十分类似,所以叫做诺赛恩RNA印迹技术(Northernblotting)。
3Western(韦斯顿)印迹杂交
将蛋白质从电泳凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜上,然后同放射性同位素125I标记的特定蛋白质之抗体进行反应,这种技术叫做韦斯顿蛋白质杂交技术(Westernblotting)。4斑点印迹杂交和狭线印迹杂交Dotblottingandslotblotting是在Southern印迹杂交的基础上发展的量种类式的快速检测特定核酸(DNA和RNA)分子的核酸杂交技术。由于在实验的加样过程中使用了特殊设计的加样装置,使众多待测样品能够一次同步转移到杂交滤膜上,并有规律地排列成点阵或线阵。适于核酸样品定量检测,而不是定性检测。5原位杂交
insituhybridization是应用已知碱基顺序并带有标记物的核酸探针与组织、细胞中待检测的核酸按碱基配对的原则进行特异性结合而形成杂交体,然后再应用与标记物相应的检测系统,通过组织化学或免疫组织化学方法在被检测的核酸原位形成带颜色的杂交信号,在显微镜或电子显微镜下进行细胞内定位。分为菌落、噬菌斑及真核细胞原位杂交原位杂交(Insituhybridization)
1)同位素原位杂交(Isotopicinsituhybridization)
——70年代
2)非同位素原位杂交(Non-isotopicinsituhybridization)
——80年代中后期
(1)免疫酶联
(2)荧光原位杂交(Fluorescenceinsituhybridization,FISH)
**同位素原位杂交的不足之处:
1)不稳定;
2)高背景;
3)曝光时间长;
4)结果统计学处理繁琐。5)同位素的使用和处理
第7章现代生物技术在环境监测与评价中的应用第一节生物传感器技术在环境监测与评价中的应用
第二节PCR技术在环境监测与评价中的应用
第三节荧光原位杂交技术在环境监测与评价中的应用第四节生物芯片技术在环境监测与评价中的应用第一节生物传感器技术在环境监测与评价中的应用
一、生物传感器简介1.概念:是指由一种生物敏感部件(元件)和(转化器)传导器紧密结合,对特定种类化学物质或生物活性物质具有选择性和可逆响应的分析装置。它是发展生物技术必不可少的一种先进的检测与监控方法,也是对物质在分子水平上进行快速和微量分析的方法
2.生物传感器优点(1)根据生物反应的特异性和多样性,理论上可以制成测定所有生物物质的传感器,因而测定范围广泛(2)一般不需进行样品的预处理,它利用本身具备的优异选择性把样品中被测组分的分离和检测统一为一体,测定时一般不需另加其他试剂,使测定过程简便迅速,容易实现自动分析(3)体积小、响应快、样品用量少,可以实现连续在位检测(4)通常其敏感材料是固定化生物元件,可反复多次使用(5)准确度高,一般相对误差可达到1%以内(6)可进行活体分析(7)传感器连同测定仪的成本远低于大型的分析仪,因而便于推广普及(8)有的微生物传感器能可靠地指示微生物培养系统内的供氧状况和副产物的产生,能得到许多复杂的物理化学传感器综合作用才能获得的信息2.生物传感器优点
3.生物传感器工作原理
生物传感器的工作原理是待测物质经扩散作用进入固定生物膜敏感层,经分子识别而发生生物学作用,产生的信息如光、热、音等被相应的信号转换器变为可定量和处理的电信号,再经二次仪表放大并输出,以电极测定其电流值或电压值,从而换算出被测物质的量或浓度。生物传感器基本原理示意图
4.生物传感器类型
(1)将化学变化转变成电信号
酶传感器为例,酶催化特定底物发生反应,从而使特定生成物的量有所增减.用能把这类物质的量的改变转换为电信号的装置和固定化酶耦合,即组成酶传感器.常用转换装置有氧电极、过氧化氢。
4.生物传感器类型
(2)将热变化转换成电信号
固定化的生物材料与相应的被测物作用时常伴有热的变化.例如大多数酶反应的热焓变化量在25-100kJ/mol的范围.这类生物传感器的工作原理是把反应的热效应借热敏电阻转换为阻值的变化,后者通过有放大器的电桥输入到记录仪中.
4.生物传感器类型
(3)将光信号转变为电信号
例如,过氧化氢酶,能催化过氧化氢/鲁米诺体系发光,因此如设法将过氧化氢酶膜附着在光纤或光敏二极管的前端,再和光电流测定装置相连,即可测定过氧化氢含量.还有很多细菌能与特定底物发生反应,产生荧光.也可以用这种方法测定底物浓度.上述三原理的生物传感器共同点:都是将分子识别元件中的生物敏感物质与待测物发生化学反应,将反应后所产生的化学或物理变化再通过信号转换器转变为电信号进行测量,这种方式统称为间接测量方式.
4.生物传感器类型
(4)直接产生电信号方式这种方式可以使酶反应伴随的电子转移、微生物细胞的氧化直接(或通过电子递体的作用)在电极表面上发生.根据所得的电流量即可得底物浓度.
5.生物传感器发展历程开端于20世纪60年代。1962年克拉克等人报道了用葡萄糖氧化酶与氧电极组合检测葡萄糖的结果,可认为是最早提出了生物传感器(酶传感器)的原理。1967年Updike等人实现了酶的固定化技术,研制成功酶电极,这被认为是世界上第一个生物传感器。20世纪70年代中期后,生物传感器技术的成功主要集中在对生物活性物质的探索、活性物质的固定化技术、生物电信息的转换以及生物传感器等研究,并获得了较快的进展,如Divies首先提出用固定化细胞与氧电极配合,组成对醇类进行检测所谓“微生物电极”。1977年,钤木周一等发表了关于对生化需氧量(BOD)进行快速测定的微生物传感器的报告,并在微生物传感器对发酵过程的控制等方面,作了详细报导,正式提出了对生物传感器的命名。
5.生物传感器组成部分(1)是生物分子识别元件(感受器),是具有分子识别能力的生物活性物质(如组织切片、细胞、细胞器、细胞膜、酶、抗体、核酸、有机物分子等);(2)是信号转换器(换能器),主要有电化学电极(如电位、电流的测量)、光学检测元件、热敏电阻、场效应晶体管、压电石英晶体及表面等离子共振器件等,当待测物与分子识别元件特异性结合后,所产生的复合物(或光、热等)通过信号转换器变为可以输出的电信号、光信号等,从而达到分析检测的目的。
6.生物传感器分类
根据传感器输出信号的产生方式,可分为生物亲合型生物传感器、代谢型或催化型生物传感器;根据生物传感器的信号转换器可分为电化学生物传感器、半导体生物传感器、测热型生物传感器、测光型生物传感器、测声型生物传感器等根据生物传感器中生物分子识别元件上的敏感材料可分为酶传感器、微生物传感器、免疫传感器、组织传感器、基因传感器、细胞及细胞器传感器。上面介绍的各种名称都是类别的名称,每一类又都包含许多种具体的生物传感器例如,仅酶电极一类,根据所用酶的不同就有几十种,如葡萄糖电极、尿素电极、尿酸电极、胆固醇电极、乳酸电极、丙酮酸电极等等.就是葡萄糖电极也并非只有一种,有用pH电极或碘离子电极作为转换器的电位型葡萄糖电极,有用氧电极或过氧化氢电极作为转换器的电流型葡萄糖电极等.实际上还可再细分。7.生物传感器介绍(按敏感器件分类)
(1)酶传感器(EnzymeSensor)
(1)酶传感器(EnzymeSensor)它将活性物质酶覆盖在电极表面,酶与被测的有机物或无机物反应,形成一种能被电极响应的物质。例如,脲在尿素酶催化下发生反应1967年Updick和Hicks将固定化的葡萄糖氧化酶膜结合在氧电极上,做成了第一支葡萄糖电极;此后,这类酶传感器通常是通过检测产物H2O2的浓度变化或氧的消耗量来检测底物。葡萄糖电极缺点:(1)溶解氧的变化可能引起电极响应的波动;(2)由于氧的溶解度有限,当溶解氧贫乏时,响应电流明显下降而影响检测限;(3)传感器响应性能受溶液pH值和温度影响较大第二代生物传感器,即介体型生物传感器,常用媒介体有铁氰化物、有机染料、醌及其衍生物、导电有机盐类和二茂铁及其衍生物。最近,人们更关注酶与电极之间的直接电子传递研究,并用于构造第三代生物传感器依据信号转换器的类型,酶传感器大致可分为酶电极(主要包括离子选择电极、气敏电极、氧化还原电极等电化学电极)、酶场效应晶体管传感器(FET-酶)和酶热敏电阻传感器等
(2)组织传感器(TissueSensor)组织传感器是以动植物组织薄片中的生物催化层与基础敏感膜电极结合而成,该催化层以酶为基础,基本原理与酶传感器相同.与酶传感器比较,组织传感器具有如下优点:1.酶活性较离析酶高.2.酶的稳定性增大.3.材料易于获得.例如:肝组织电极动物肝组织中含有丰富的H2O2酶,可与氧电极组成测定H2O2及其它过氧化物的组织电极.1981年Mascini等研究了数种哺乳动物和其它动物(鸟、鱼、龟)的肝组织电极,翌年,报道了基于牛肝组织的H2O2电极.
植物组织膜电极结构图解a一木瓜,b一果皮,c-中果皮,d-内果皮1-中果皮组织薄片2-固定化骨架3-透气健,4-垫圈5-内电解质6-复合PH电极7-塑料电极体3-7为二氧化碳气敏电极结构(3)微生物传感器(MicroorganismSensor)微生物传感器分为两类:一类是利用微生物在同化底物时消耗氧的呼吸作用;另一类是利用不同的微生物含有不同的酶。好氧微生物在繁殖时需消耗大量的氧,可以氧浓度的变化来观察微生物与底物的反应情况。装置是:由适合的微生物电极与氧电极组成。原理是:利用微生物的同化作用耗氧,通过测量氧电极电流的变化量来测量氧气的减少量,从而达到测量底物浓度的目的.例如,荧光假单胞菌,能同化葡萄糖;芸苔丝孢酵母可同化乙醇,因此可分别用来制备葡萄糖和乙醇传感器,这两种细菌在同化底物时,均消耗溶液中的氧,因此可用氧电极来测定基于不同类型的信号转换器,常见的微生物传感器有电化学型、光学型、热敏电阻型、压电高频阻抗型和燃料电池型,抗体(antibody)抗体是一种免疫球蛋白.免疫球蛋白有5种,分别命名为IgG,IgA,IgM,IgD和IgE.无脊椎动物不产生免疫球蛋白.鱼有IgM,两栖类有IgM和IgG.除人类有5种免疫球蛋白外,大多数哺乳动物只有IgG,IgA,IgM和IgE四种免疫球蛋白.抗原(antigen)抗原是一种进入机体后能刺激机体产生免疫反应的物质.它可能是生物体(如各种微生物),也可能是非生物体(如各种异类蛋白、多糖等).通常,分子量大于10000,而且具有一定结构(如苯环或杂环等结构)的物质均可成为抗原性物质,都能有效地诱发产生抗体.
(4)免疫传感器(Immunosensor)抗体对相应的抗原具有识别和结合的双重功能,在与抗原结合时,选择性强,灵敏度高,免疫传感器就是利用其双重功能将抗体或抗原和换能器组合而成的装置。由于蛋白质分子(抗体或抗原)携带有大量电荷、发色基团等,当抗原抗体结合时,会产生电学、化学、光学等变化,通过适当的传感器可检测这些参数,从而构成不同的免疫传感器,总的来说可分为两类:(1)非标记型;(2)标记型如黄曲霉毒素传感器,它由氧电极和黄曲霉毒素抗体膜组成,加到待测样品中,酶标记的及未标记的黄曲霉毒素便会与膜上的黄曲霉毒素抗体发生竞争反应,测定酶标黄曲霉毒素与抗体的结合率,便可知样品中的含量根据使用的信号转换器,有电化学免疫传感器、光学免疫传感器、压电免疫传感器及表面等离子体共振(SPR)型传感器。(5)核酸传感器(TheSensorofNucleicAcid)依据生物体内核苷酸顺序相对稳定,核苷酸碱基顺序互补的原理而设计出核酸探针传感器,即基因传感器。基因传感器一般有10~30个核苷酸的单链核酸分子,能够专一地与特定靶序列进行杂交从而检测出特定的目标核酸分子。根据换能器种类不同可分为电化学型、光学型、压电免疫传感器及表面等离子体共振型基因传感器,这种传感器可用于检测食品中的病原体,为食品中病原体的鉴定提供了新的手段。8.生物传感器的应用在食品分析中的应用在生物医学上的应用在军事上的应用在环境监测中的应用
优点:选择性高,灵敏度高,稳定性好,成本低,能在复杂的体系中进行快速在线连续监测。例子:一个典型应用是测定生化需氧量(BOD),传统方法测BOD需5天,且操作复杂。1977年Karube等首次报道了BOD微生物传感器,只需15分钟即能测出结果,连续使用寿命达17天;废气或环境大气的监测:可用于测定空气中SO2、NOX、CO2、NH3、CH4等的含量;
二、在环境监测中的应用BOD生物传感器示意图
二、生物传感器在环境监测中的应用
2.酚类微生物传感器3.阴离子表面活性剂传感器4.水体富营养化监测传感器5.生物传感器检测硝酸盐、亚硝酸盐及氨氮6.检测有毒有害物质的生物传感器7.抗体传感器8.空气和废气监测传感器
第二节PCR技术在环境监测与评价中的应用
聚合酶链反应(polymerasechainreaction,PCR)是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法,有称之为体外扩增法。一、PCR技术简史DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’解旋酶解链酶DNA解旋解链合成引物子链延长一、PCR技术简史DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明1971年,Khorana提出:经过DNA变性,与合适引物杂交,用DNA聚合酶延伸引物,并不断重复该过程便可克隆tRNA基因。但由于测序和引物合成的困难,以及70年代基因工程技术的发明使克隆基因成为可能,所以,Khorana的设想被人们遗忘了……PCR技术简史DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’DNA解旋解链合成引物子链延长GGAUCG5‘AUCGCG5‘引物酶引物酶RNA引物RNA引物PCR技术简史DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’DNA解旋解链合成引物子链延长GGAUCG5‘AUCGCG5‘TAGCGCTATCGCATCGACGCT3’ATAGCGTAGCTGCGAGGATCG3’DNA聚合酶DNA聚合酶一、PCR技术简史DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明1985年,美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了聚合酶链反应(PCR)基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制最初采用E-coliDNA聚合酶进行PCR,由于该酶不耐热,使这一过程耗时,费力,且易出错耐热DNA聚合酶的应用使得PCR能高效率的进行,随后PE-Cetus公司推出了第一台PCR自动化热循环仪1993年,Mullis等因此项技术获诺贝尔化学奖二、PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点标准的PCR反应体系4种dNTP混合物各200umol/L引物各10~100pmol模板DNA
0.1~2ugTaqDNA聚合酶2.5uMg2+
1.5mmol/L计量换算1摩尔(mol)=1000毫摩尔(mmol)1毫摩尔(mmol)=1000微摩尔(μmol)1微摩尔(μmol)=1000纳摩尔(nmol)1纳摩尔(nmol)=1000皮摩尔(pmol)1皮摩尔(pmol)=1000飞摩尔(fmol)(1)dNTPdNTP浓度取决于扩增片段的长度四种dNTP浓度应相等浓度过高易产生错误碱基的掺入,浓度过低则降低反应产量
dNTP可与Mg2+结合,使游离的Mg2+浓度下降,影响DNA聚合酶的活性。(2)引物浓度
0.1-0.5mol/L
浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降。引物设计:(1)序列应位于高度保守区,与非扩增区无同源序列。(2)引物长度以15-40bp为宜。(3)碱基尽可能随机分布,G+C占50-60%。(4)引物内部避免形成二级结构。(5)两引物间避免有互补序列。(6)引物3’端为关键碱基;5’端无严格限制。(3)模板单、双链DNA均可。不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。一般100ngDNA模板/100L。模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。(4)Taq
DNA聚合酶(thermusaquaticus)0.5-2.5U/50l
酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。(5)Mg2+
Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。0.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系。Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降;Mg2+过高影响反应特异性。Mg2+可与负离子结合,所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。1234522557294时间(min)温度(℃)二、PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点适温延伸3高温变性1低温退火2重复1~3步25~30轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍变性使双链DNA解链为单链
95oC20-30秒(2)退火温度由引物长度和GC含量决定。增加温度能减少引物与模板的非特异性结合;降低温度可增加反应的灵敏性。(3)延伸
70-75oC,延伸时间由扩增片段长度决定(4)循环次数主要取决于模版DNA的浓度一般为25-35次次数过多:扩增效率降低错误掺入率增加温度(℃)时间(min)94726094℃变性(1min)60℃退火(1min)72℃延伸(1.5min)循环1循环2循环3PCR反应的温度循环周期PCR反应的每一个温度循环周期都是由DNA变性、引物退火和反应延伸三个步骤完成的。图中设定的反应参数是94℃变性1min,60℃退火1min,72℃延伸1.5min。如此周而复始,重复进行,直至扩增产物的数量满足实验需求为止。
PCR原理示意图二、PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点灵敏度高皮克(pg=10-12)量级扩增到微克(ug=10-6)水平能从100万个细胞中检出一个靶细胞病毒检测的灵敏度可达3个RFU细菌检测的最小检出率为3个细菌简便、快速一次性加好反应液,2~4小时完成扩增扩增产物一般用电泳分析对标本的纯度要求低血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织的粗提DNA检验PCR扩增效率的指标特异性、高效性和忠实性。PCR技术有如下特点:(1)操作简便;(2)省时;(3)灵敏度高;(4)特异性强;(5)模板材料易获得;(6)有一程度的单核苷酸错误掺入;(7)TagDNA聚合酶催化的PCR扩增终产物3’端加尾,这种多出来的“毛边”碱基几乎总是A;(8)PCR反应过程遵循酶促动力学规律。
1.不对称PCR2.反向PCR3.逆转录PCR4.锚定PCR
三、PCR的类型1.不对称PCR
目的:扩增产生特异长度的单链DNA。方法:采用两种不同浓度的引物。分别称为限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是0.01∶0.5μM,关键是限制性引物的绝对量。用途:制备核酸序列测定的模板制备杂交探针基因组DNA结构功能的研究
高浓度引物低浓度引物2.反向PCR(reversePCR)
是用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段,对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。可对未知序列扩增后进行分析,如探索邻接已知DNA片段的序列;用于仅知部分序列的全长cDNA的克隆,扩增基因文库的插入DNA;建立基因组步移文库。已知序列未知序列未知序列3.RT-PCR:在mRNA反转录之后进行的PCR检测RNA分子;获取测序模板DNA;克隆mRNA之cDNA拷贝。4.锚定PCR特别适用于扩增那些只知道一端序列的目的DNA四、PCR应用研究基因克隆,DNA测序,分析突变诊断细菌、病毒、寄生虫检测,诊断人类基因组工程遗传图谱的构建,DNA测序,表达图谱法医犯罪现场标本分析肿瘤各种肿瘤检测其他……
应用:(1)检测特定生物有机体之间是否存在亲缘关系;(2)用来揭示核酸片段中某一特定基因的存在与否、拷贝数及表达丰度。
父’父子母现嫌1嫌2嫌3正常突变电泳四、PCR技术在环境微生物检测中的应用
(1)应用PCR技术研究某一特定环境中微生物区系的组成,进而了解其种群动态;(2)应用PCR技术监测环境中特定种群(如致病菌、工程菌等)的动态。基本步骤主要包括:(1)从环境样品中提取核酸(DNA或RNA);(2)以提取的DNA或RNA样品为模板进行PCR扩增(3)对PCR反应产物进行检测与分析第三节荧光原位杂交技术在环境监测与评价中的应用一、荧光原位杂交技术简介(fluorescenceinsituhybridization,FISH)荧光是指一种光致发光的冷发光现象。当某种常温物质经某种波长的入射光(通常是紫外线或X射线)照射,吸收光能后进入激发态,并且立即退激发并发出比入射光的的波长长的出射光(通常波长在可见光波段);而且一旦停止入射光,发光现象也随之立即消失。具有这种性质的出射光就被称之为荧光。1.荧光原位杂交的特点:
1)快速;2)信号强;3)特异性高;4)多色。
**FISH有上述优点的原因:
使用了荧光标记与检测系统取代放射性标记与检测系统
标记探针的物质:(1)生物素(biotin)/地高辛(digoxigenin)
——半抗原报告分子(间接标记)
(2)荧光物质(直接标记)
2.染色体复染的物质:
PropidiumIodide(PI)(红色)DAPI(兰色)quinacrine(绿色)chromomycineA3(绿色)
3.FISH的基本原理是将DNA(或RNA)探针用特殊的核苷酸分子标记,然后将探针直接杂交到染色体或DNA纤维切片上,再用与荧光素分子偶联的单克隆抗体与探针分子特异性结合来检测DNA序列在染色体或DNA纤维切片上的定性、定位、相对定量分析。
二、FISH技术特点
(1)操作简便,探针标记后稳定,一次标记后可使用2年;
(2)方法敏感,能迅速得到结果;
(3)在同一标本上,可同时检测几种不同探针;(4)可用于分裂期细胞染色体数量及基因改变的研究。
三、FISH技术的应用
1)基因(或DN
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