单克隆抗体制备和应用-四川大学课程中心30

第一节杂交瘤技术的基本原理第一页，共80页。第一代抗体多克隆抗体（polyclonalantibody)第二代抗体单克隆抗体（monoclonalantibody)第三代抗体基因工程抗体（geneticengineeringantibody)抗体种类第二页，共80页。。淋巴细胞第三页，共80页。。淋巴细胞发育第四页，共80页。。浆细胞第五页，共80页。。抗原接种第六页，共80页。BALB/c小鼠7~12周龄20~25g体重动物第七页，共80页。B淋巴细胞:寿命短,分泌特异系性抗体骨髓瘤细胞：寿命长杂交瘤细胞：寿命长，单克隆抗体单克隆抗体第八页，共80页。聚乙二醇（PEG）：细胞融合剂，使免疫的小鼠脾细

胞与小鼠骨髓瘤细胞融合HAT培养基的选择培养：反复的免疫学检测筛选克隆化增殖的杂交瘤

细胞系单克隆抗体生成：接种杂交瘤

细胞于小鼠腹腔，腹水中即可得到高效价的单克隆抗体杂交瘤技术原理第九页，共80页。流程第十页，共80页。RPM1640培养液DMEM培养液培养液第十一页，共80页。PEG:分子量4000的PEG是最常用的细胞融合剂作用机理：诱导细胞膜上脂类物质结构重排，使细胞膜易打开而有助于细胞融合作用特点：随机发生的，不同厂商、批号、分子量的PEG，其纯度与毒性有所不同细胞融合剂第十二页，共80页。次黄嘌呤磷酸核糖转化酶胸腺嘧啶核苷激酶HGPRT酶与TK酶第十三页，共80页。H（Hypoxanthine）:次黄嘌呤A（Aminopterin）：氨基喋呤；叶酸拮抗物，阻断DNA合成主要途径T(Thymidine)：胸腺嘧啶核苷；“核苷酸前体”，供细胞通过替代途径合成DNAHAT培养基第十四页，共80页。8-杂氮鸟嘌呤聚乙二醇应用液第十五页，共80页。不产生Ig的重链和轻链HGPRT-;TK-与提供淋巴细胞的动物品系相同骨髓瘤细胞系的选择第十六页，共80页。SP2/O:HGPRT-，TK-;长命淋巴细胞:HGPRT+，TK+;短命(7天)杂交瘤细胞:HGPRT+，TK+;长命骨髓瘤细胞、淋巴细胞与杂交瘤细胞第十七页，共80页。淋巴细胞：不能生长，5-7天死亡；DNA合成的主要途径被A阻断骨髓瘤细胞：不能生长，5-7天死亡；HGPRT缺乏，DNA合成的替代途径受阻HAT选择作用第十八页，共80页。长期生长繁殖。利用淋巴细胞的HGPRT，将H合成为嘌呤碱并最终与T一起合成DNA，从淋巴细胞获得产生某种抗体的遗传信息从骨髓瘤细胞获得不断繁殖的能力

杂交瘤细胞第十九页，共80页。有限稀释法显微操作法FACS法半固体琼脂糖法克隆化第二十页，共80页。特点：不需任何特殊设备克隆出现效率高实验室常用方法方法：细胞悬液通过系列稀释每个培养孔含0.5～1个细胞有限稀释法第二十一页，共80页。效率最高价格昂贵FACS第二十二页，共80页。配制方案：杂交瘤细胞（1～5x106/ml)+细胞冻存液(30%-40%牛血清，50%-60%RPMI-1640培养液，10%DMSO)“慢冻”：分步冷冻，30℃→-70℃→液氮

“快融”：取出立即浸入37℃-40℃水浴中，使其迅速融化、复苏杂交瘤细胞的冻存与复苏第二十三页，共80页。防止污染避免染色体丢失防止非分泌细胞的过度生长防止细胞密度过高而死亡细胞冷冻的意义第二十四页，共80页。第二节单克隆抗体制备第二十五页，共80页。选择对数生长期的细胞进行传代培养细胞形态：浑圆、透亮、均一、排列整齐避免细胞返祖：定期用8-AG处理细胞注意事项：切忌过多传代培养，可将细胞分装冻存于-80℃或液氮及干冰中培养骨髓瘤细胞第二十六页，共80页。1×108

淋巴细胞无菌手术免疫脾细胞的制备第二十七页，共80页。细胞密度过低不利于细胞生长繁殖常用小鼠腹腔细胞作饲养细胞其中MQ还有清除死亡细胞的作用饲养存活一般不超过2周，不影响杂交瘤细胞的纯化采取饲养细胞第二十八页，共80页。。饲养细胞第二十九页，共80页。骨髓瘤细胞与淋巴细胞(1:3)50%PEG1min内加完;2min内加10ml培养液融合方法第三十页，共80页。SP2/0细胞与脾细胞的比例为1：2-51ml50%的PEG（无菌，预温37℃）在1分钟内滴完,静置90秒,时间一到,将事先准备的培养液一滴一滴加入,停止PEG作用根据细胞数量加入HAT培养基，使之分加到96孔板中时每孔细胞数为0.5-1.5×105个。融合后7天，换用HT培养液。细胞融合第三十一页，共80页。10~20天出现克隆HAT筛选挑克隆融合细胞的早期培养第三十二页，共80页。可溶性抗原：ELISA抗体捕获法细胞、亚细胞结构上的抗原：免疫荧光法（用丙酮和甲醇按1:1比例固定细胞）筛选常用方法第三十三页，共80页。ELISA第三十四页，共80页。ELISA第三十五页，共80页。多头加样枪第三十六页，共80页。。免疫荧光法第三十七页，共80页。体外培养中空纤维培养系统

单抗含量不高，牛血清Ab难以去除动物接种每次用BALB/c或F1代小鼠，5-10╳105/只

生产单克隆抗体第三十八页，共80页。

细胞性抗原：1-2×107/只，不加佐剂，2-3周重复一次可溶性抗原：首次，完全福氏佐剂+100微克抗原，3-6周100-200微克抗原，融合前3天，加强免疫免疫小鼠第三十九页，共80页。腹腔注射法第四十页，共80页。前5天进行,预先腹腔注射pristane1~5×106细胞1~3w形成腹水高滴度腹水第四十一页，共80页。盐析沉淀亲和层析离子交换层析McAb的纯化第四十二页，共80页。Ig类型、亚类测定：双扩法或ELISA法特异性测定：抗原类似物的交叉反应效价测定：用腹水或培养液的稀释度表示

表位测定：几株单抗是否为不同表位特异的,用竞

争抑制法，相加指数法及微机集群分析亲和性测定：测定亲和常数K杂交瘤细胞染色体：秋水仙素裂解法，小鼠B细胞染色体40条，SP2/0细胞68条，杂交瘤细胞一般100多条McAb靶抗原分子量：常用westernblotMcAb的鉴定第四十三页，共80页。

McAb

PcAb

抗原要求可以不纯纯度高得量高低特异性高低稳定低高沉淀反应无有成本高低McAb与PcAb的比较第四十四页，共80页。McAbandPcAb第四十五页，共80页。第三节基因工程抗体第四十六页，共80页。

根据研究者的意图，采用基因工程方法，在基因水平，对免疫球蛋白基因进行切割、拼接或修饰后导入受体细胞进行表达，产生新型抗体。主要包括嵌合抗体、单链抗体、人源化抗体、双价抗体和双特异性抗体。基因工程抗体

Geneticengineeringantibody第四十七页，共80页。将小鼠的CDR序列移植到人抗体可变区框架中，产生的抗体称为CDR移植抗体将小鼠Ig基因敲除，转染人Ig基因，在小鼠体内产生人Ab，再经杂交瘤技术，产生大量完全人源化抗体人源化抗体第四十八页，共80页。方法：从杂交瘤细胞分离出功能性可变区基因，与人Ig恒定区基因连接，插入适当表达载体，转染宿主细胞，表达人-鼠嵌合抗体特点：减少了鼠源性抗体的免疫原性保留了亲本抗体特异性结合抗原的能力嵌合抗体chimericantibody第四十九页，共80页。嵌合抗体chimericantibody第五十页，共80页。人抗体V区的骨架区取代鼠源单抗CDR以外骨架区改型抗体reshapedantibody第五十一页，共80页。定义：指利用基因工程技术，将人抗体可变区（V）中互补决定簇（CDR）序列改换成鼠源单抗CDR序列。重构成既具有鼠源性单抗的特异性又保持抗体亲和力的人源化抗体。RAb亦叫“重构型抗体”，因其主要涉及CDR的“移植”，又可称为“CDR移植抗体意义：多种特异的鼠源单抗有可能应用于临床治疗改形抗体（RAb）第五十二页，共80页。

Fab：抗原结合片断

Fv：可变区片段

ScFv：单链可变区片段小分子抗体第五十三页，共80页。小分子抗体第五十四页，共80页。其它生物活性蛋白融合抗体融合蛋白第五十五页，共80页。

许多抗原抗体反应要求双价的抗原结合位点，使抗原分子上的两个表位交联或使两个抗原分子连接。将识别肿瘤抗原的抗体和识别细胞毒性免疫效应细胞表面分子的抗体连结在一起，可使效应细胞更容易与肿瘤细胞结合识别，取得杀伤肿瘤细胞的作用。双特异性抗体第五十六页，共80页。化学交联BsAb分别分离纯化两种不同的McAb，使各抗体解离为单价抗体，再使两种不同抗原特异性的单价抗体通过化学试剂交联起来，然后分离出目的组分。此法缺点是容易导致抗体失去活性，产物均一性不佳。基因工程BsAb多采用抗体分子片段,如Fab,Fv或ScFv,经基因操作修饰后,或体外组装为BsAb,或直接表达分泌型的BsAb。双特异性抗体第五十七页，共80页。细胞工程BsAb将两种分泌不同特异性单抗的杂交瘤细胞进行再次融合，产生四源杂交瘤(quadroma)。但二次杂交瘤细胞株分泌的是两套重链，轻链的随机组合物。BsAb在其中的比例可为10%～50%不等。多倍杂交瘤细胞的稳定性差，BsAb的产量少且活性低，费时费力，临床应用时存在人抗鼠抗体免疫反应(HAMA)，因此不适用于临床。双特异性抗体第五十八页，共80页。定义：将体外克隆的抗体基因片段插入噬菌体载体，转染工程细菌进行表达，然后用抗原筛选即可获得特异的单克隆噬菌体抗体。利用这一技术可以得到完全人源性的抗体，在HIV等病毒感染和肿瘤的诊断与治疗方面有其独特的优越性噬菌体抗体库技术第五十九页，共80页。用PCR扩增人抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因克隆到噬菌体载体并以融合蛋白的形式表达在其外壳表面用抗原抗体反应筛选出表达所需要抗体的克隆并扩增。使抗体基因以分泌的方式表达，获得可溶性的抗体片段。抗体库：组合抗体文库：在建库过程中如果将VH和VL随机组合人天然抗体库：抗体mRNA来源于未经免疫的正常人

基本原理

第六十页，共80页。噬菌体抗体库第六十一页，共80页。①从外周血或脾、淋巴结等组织中分离B淋巴细胞，提取mRNA并逆转录为cDNA；②应用抗体轻链和重链引物，根据建库的需要通过PCR技术扩增不同的Ig基因片段；③构建噬菌体载体。噬菌体抗体库载体有λ噬菌体、丝状噬菌体和噬菌粒三种，其中后二者是目前构建表面表达的噬菌体抗体库(surfacedisplayantibodylibrary)常用载体；④表达载体转化细菌，构建全套抗体库。通过多轮的抗原亲合吸附-洗脱-扩增，最终筛选出抗原特异的抗体克隆。

构建噬菌体抗体库第六十二页，共80页。模拟天然全套抗体库抗体文库可以达到或超过1011库容,能包含B细胞全部克隆建库的外源基因来自人体多克隆细胞的总mRNA通用引物具有人的种属普遍性抗体的VH和VL基因的随机重组也增加了抗体的多样性噬菌体抗体库特点第六十三页，共80页。避开了人工免疫和杂交瘤技术抗体库的大容量抗体库极高的筛选效率可获得高亲和力的人源化抗体VH和VL基因的随机重组模拟了体内抗体亲和力成熟的过程所用的抗体基因又来自人体第六十四页，共80页。

第四节单克隆抗体应用第六十五页，共80页。诊断病原体肿瘤的诊断淋巴细胞表面标志物检测检验医学体外诊断试剂标记免疫测定第六十六页，共80页。肝炎病毒:HAV,HBV,HCV,HDV,HEVTORCH：弓形虫,风疹病毒,巨细胞病毒，单纯疱疹病毒病原体测定第六十七页，共80页。CD4/CD8:Th/Tc白血病的分型细胞表面CD测定第六十八页，共80页。内分泌疾病的诊断激素的测定药物测定(TDM)抗排斥药物抗肿瘤药物地高辛第六十九页，共80页。越来越多未知功能cDNA的克隆对复杂的基因功能和多肽蛋白功能的研究需求增加研究工作中的探针第七十页，共80页。免疫沉淀第七十一页，共80页。干扰素的精制物质的纯化第七十二页，共80页。MACS第七十三页，共80页。同位素标记McAb进行影像诊断体内定位诊断第七十四页，共80页。定义：

分子量较小但具有抗原结合功能的分子片段优点：分子量小,穿透性强,抗原性低不含Fc段，不会与带有Fc段受体的细胞结合，不良反应少可在原核系统表达及易于基因工程操作半衰期短，有利于及时中和