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第4章基因突变的应用第一节诱变育种第二节突变株的筛选与应用第三节菌种退化及其防止当前1页,总共65页。

第一节诱变育种

目前菌种选育常采用自然选育和诱变育种等方法,带有一定的盲目性,尚属于经典育种的范畴。随着微生物学、生化遗传学的发展,出现了转化、转导、原生质体融合、代谢调控和基因工程等较为定向的育种方法。当前2页,总共65页。一、自然选育

在生产过程中,不经过人工处理,利用菌种的自然突变而进行菌种筛选的过程叫做自然选育。所谓自然突变就是指某些微生物在没有人工参与下所发生的那些突变。一般认为引起自然突变有两个原因:即多因素低剂量的诱变效应和互变异构效应。当前3页,总共65页。

自然选育是一种简单易行的选育方法,它可以达到纯化菌种,防止菌种衰退、稳定生产、提高产量的目的。但是自然选育的最大缺点是效率低、进展慢。因此,经常把自然选育和诱变育种交替使用,这样可以收到良好的效果。一般程序:⑴自然选育(自然分离)是把菌种制备成单孢子悬浮液;⑵经过适当的稀释以后,在固体平板上进行分离;⑶挑取部分单菌落进行生产能力的测定;⑷经反复筛选,以确定生产能力更高的菌株代替原来的菌株。当前4页,总共65页。二、诱变育种1、诱变育种的基本原理诱变育种的理论基础是基因突变,所谓突变是指由于染色体和基因本身的变化而产生的遗传性状的变异。突变主要包括染色体畸变和基因突变二大类。当前5页,总共65页。根据突变发生的原因又可分为自然突变和诱发突变。自然突变是指在自然条件下出现的基因突变。诱发突变是指用各种物理、化学因素人工诱发的基因突变。诱变因素的种类很多,有物理的、化学的和生物的三大类。经诱变处理后,微生物的遗传物质、DNA和RNA的化学结构发生改变,从而引起微生物的遗传变异。当前6页,总共65页。2、诱变育种在育种工作中的作用(1)提高目标产物的产量菌株NRRL-B25的诱变过程Strain Mutagen Yield(U/ml)TimeNRRL-B25 250 1943NRRL-X1612 X-rays 500 1943NRRL-Q176 UVlight 850 1945NRRL-WIS-47-1564UVlight 850 1947--- --- 50000 1977当前7页,总共65页。(2)改善菌种特性,提高产品质量,简化工艺条件当前8页,总共65页。(3)开发新产品

庆大霉素生产菌棘状小单孢菌耐受无机磷突变株MechinosporaMutant129-P1产生一种新的氨基糖苷抗生素复合物GP,经分离纯化获两个单组分GPA和GPB。研究结果证明抗生素GPB与紫色小单孢菌突变株M.Purpureaji20所产生的抗生素JI-20同质,抗生素GPA与相模湾小单孢菌突变株

M.sagamiensisNRRL110060/31生物转化的产物抗生素TBJ-B同质。(4)给代谢调控育种提供技术手段当前9页,总共65页。3、诱变育种工作中应注意的问题A选择好出发菌株选好出发菌株对诱变效果有着极其重要的作用。有些微生物比较稳定,其遗传物质耐诱变剂的作用强。如果用这种菌株于生产是很有益的,而用作出发菌株则不适宜。用作诱变的出发菌株必须对它的产量、形态、生理等方面有相当了解。挑选出发菌株的标准是产量高、对诱变剂的敏感性大、变异幅度广,再确定诱变剂的使用及筛选条件。当前10页,总共65页。B复合诱变因素的使用在微生物诱变育种中,可利用各种物理、化学诱变因素来处理菌种。对野生型菌株单诱变因素有时也能取得好的效果,但对老菌种单一诱变因素重复使用突变的效果不高,这时可利用复合因素来扩大诱变幅度,提高诱变效果。当前11页,总共65页。C剂量选择各种诱变因素有它们各自的诱变剂量单位,如紫外线剂量单位用焦耳,x一射线剂量单位是库(仑)每千克,中子剂量单位是戈。化学诱变因素一般是以溶液浓度来计算剂量单位的。对不同微生物使用的剂量是不同的,致死率取决于诱变剂量,而致死率和变异率之间有一定关系。因此可以用致死率作为选择适宜剂量的依据。当前12页,总共65页。D变异菌株的筛选诱变育种工作的一个主要任务是获得高产变异菌株。从经诱变的大量个体中挑选优良菌种不是一件容易的事。因为不同的菌种表现的变异形式是不同的,一个菌种的变异规律去发现那些与产量有关的特性,并根据这些特性,分门别类地挑选一定数最的典型菌株进行发酵和鉴定,以确定各种类型与产量之间的关系。这样,可大大提高筛选的工作效率。当前13页,总共65页。E高产菌株的获得需要筛选条件的配合在诱变育种过程中高产菌株的获得还必须有合适的筛选条件的配合,如果忽视这一点,则变异后的高产菌株不可能被挑选出来。

诱变与筛选可以说是一个问题的两个方面,必须用辩证的观点来看待。只重视诱变而忽视筛选,或过份重视菌种而忽视发酵条件的观点都是片面的,这样会影响高产菌株的获得。总之,在诱变育种过程中要正确处理出发菌株,诱变因素和筛选条件三者的关系。全面辩证地考虑上述三者之间的关系,将是诱变育种能否获得理想效果的重要关键。当前14页,总共65页。①对早期生物技术的发展贡献巨大;②适用于途径或基因未得到研究的菌株;③产生的变异程度相对较低;④变异的位点及性质不明;⑤实质上也是基因的变异,没有相应的基因就不可能发生新功能。4、诱变育种技术的特点当前15页,总共65页。5、物理、化学诱变剂的使用方法A紫外线

紫外线是一种使用时间较久、值得推广的诱变剂,它的辐射光源便宜,危险性小,诱变效果好,故应用最广泛,研究得也最多。虽然紫外线的波长范围很宽,但对诱变最有效的波长仅仅是260nm左右(253-265)nm一般诱变时用菌(孢子)悬浮液进行处理,紫外灯的功率为15W,距离固定在30cm左右。

当前16页,总共65页。

紫外线诱变的操作步骤使用UV照射最为方便。取5ml单细胞悬液置于直径6cm的培养皿中,开盖照射;时间不短于10~20s,也不长于10~20min。当前17页,总共65页。B化学诱变剂的使用:化学诱变剂的种类、浓度和处理方法尤其是终止反应的方法很多。出发菌株含诱变剂的液体培养基接种培养培养接种分离选择优良突变株当前18页,总共65页。使用化学诱变剂的十分简便的方法:①平板上涂布出发菌株②在其上分区并放置诱变剂颗粒或沾有诱变剂溶液的小滤纸片③保温培养④诱变剂周围有一透明的制菌圈,在制菌圈的边缘存在有若干突变株的菌落⑤一一制成菌悬液⑥分别涂布在琼脂平板表面并保温培养⑦长成大量单菌落⑧选出所需突变菌株。当前19页,总共65页。例如:N一甲基一N′硝基一N一亚硝基弧(NTG)

亚硝基胍是亚硝基烷基类化合物的一种,可诱发营养缺陷型突变,不经淘汰便可直接得到12%一80%的营养缺陷型菌株,故有超诱变剂之称。它在pH低于5-5.5的条件下,形成HNO2而引起菌种突变;在碱性条件下以重氮甲烷的形式对DNA起烷化作用;在pH6时,两者均不产生,此时的诱变效应可能是由于NTG本身对核蛋白体引起的变化所致。在缓冲液中较难溶解,而在甲酰胺中溶解度较大,因此用甲酰胺溶解NTG,可以提高处理浓度。通常在浓度为300μg/mL,温度为28℃和时间为60分钟的条件下进行处理,容易得到高产菌株。

当前20页,总共65页。第二节突变株的筛选与应用一、抗噬菌体菌株的选育1、噬菌体的分布凡是有寄主细胞的地方,一般容易找到它们的噬菌体。2、

抗噬菌体菌株的选育在工业微生物发酵过程中,有不少品种遭受噬菌体的感染,使生产不能进行。这种裂解细胞的噬菌体称为烈性噬菌体。在出现噬菌体以后必须选育抗噬菌体菌株和配合其他措施使生产继续进行。由于噬菌体很易发生变异,因此又会出现新的噬菌体,对噬菌体原具有抗性的菌株又会出现不抗。所以既要不断收集噬菌体,又要不断选育新的抗性菌株,以确保生产正常进行。当前21页,总共65页。

细菌的抗性是基因突变的结果,抗噬菌体突变可以发生在接触噬菌体以前,它和噬菌体的存在与否无关。3、

抗噬菌体菌株选育的几种方法根据基因突变规律,可采用自然突变和诱发突变等方法获得。(1)自然突变

以噬菌体为筛子,敏感菌株的孢子不经任何诱变由其自然突变为抗性菌株,这种方法获得的抗性突变频率很低。当前22页,总共65页。(2)诱发突变

A敏感菌株先经诱变因素处理,然后将处理过的孢子液分离在含有高浓度的噬菌体的平板培养基上,经诱变后的存活孢子中,如存在抗性变异菌株就能在此平板上生长。这种菌落生长的速度一般与正常菌落的生长速度相近,诱变可以提高抗性菌株的频率。

B还可将敏感菌孢子经诱变后接入种子培养基,待菌丝长浓后加入高浓度的噬菌体再继续培养几天,再加入噬菌体反复感染,使敏感菌被噬菌体所裂解,最后取再生菌丝进行平板分离,从中筛选抗性菌株。当前23页,总共65页。4、

抗噬菌体菌株的特性试验

无论从自然突变或诱发突变所得到的抗噬菌体菌株,在用于生产之前,均需经过反复验证,才能使用。(l)抗噬菌体性状的稳定性试验抗性菌株分别在孢子培养、种子培养和发酵培养过程中用点滴法或双层琼脂法测定噬菌斑。如都不出现噬菌斑,说明该菌株对此噬菌体具有抗性。此外,还可以观察抗性菌株经多次传代后对噬菌体的抗性是否稳定。当前24页,总共65页。(2)抗性菌株的产量试验在选育抗噬菌体菌株时,既要求具有抗性,同时亦要求生产能力不低于原敏感菌株。(3)其正抗性与溶源性的区别试验菌株的抗噬菌体特性具有遗传的相对稳定性。

抗性表现力多种多样,可因细胞壁结构的改变而阻止噬菌体吸附侵入,也可因生理代谢的改变,使噬菌体不能侵染,即使侵染后也不能增殖释放。这些菌株都具有真正的抗性。溶原性菌株则因细胞中存在原噬菌体,对同一类型噬菌体具有免疫性。表面上看来,这种菌株具有抗性,但可采用物理、化学因素诱导不同的敏感菌看它是否会释放噬菌体。出现噬菌斑的菌株就是溶源菌,而不是真正抗性菌。当前25页,总共65页。5、噬菌体的防治

不同发酵类型遭到不同种类噬菌体侵染所出现的现象是不同的,而同一菌种被相同的噬菌体侵染,由于侵染的时间不同,也会造成不同的后果。但都会出现畸形菌丝,菌体迅速消失,pH上升,发酵产物停止积累,甚至下降等现象。噬菌体的防治是多方面的。大概可以分以下几个方面:(1)正确判断

(2)普及有关噬菌体的知识(3)选育抗噬菌体菌株(4)消灭噬菌体当前26页,总共65页。

在发生噬菌体感染时发酵罐排出的废气夹带有大量噬菌体,造成严重污染和扩散。因此,必须在排气口及下水道喷洒药剂,防止噬菌体扩散。常用的药物有漂白粉、甲醛、石灰水等。种子室应尽量设法与外界减少接触,严格执行无菌操作,并检查空气中有无噬菌体存在。在噬菌体感染期间,车间内亦要定时检查噬菌体的分布情况,采取有效措施直至消灭为止。(5)收集和保存噬菌体在生产上出现噬菌体后要收集并保藏起来,以进行研究。因为这是选育抗性菌株及研究防治措施的材料和依据。总之,防治噬菌体,应以预防为主,杜绝噬菌体的滋生,两者结合,才是有效的防治措施。当前27页,总共65页。二、营养缺陷型突变株的筛选与应用(一)营养缺陷型突变株的应用1、阻断代谢途径,积累中间代谢产物2、阻断分支代谢,改变代谢流向,积累另一终端代谢产物3、解除反馈抑制,积累代谢产物4、利用渗漏缺陷型进行代谢调控育种

渗漏缺陷型是一种特殊的营养缺陷型,是一种遗传代谢障碍不完全。的营养缺陷型。其酶的活力下降但不完全丧失,使其能少量合成某一代谢产物,但产物的量又不造成反馈抑制。当前28页,总共65页。当前29页,总共65页。(二)营养缺陷型突变株的筛选步骤1、诱变处理2、后培养后培养是指诱变处理后,立即将处理过的细胞转移到营养丰富的培养基中进行培养,使突变基因稳定、纯合并表达。3、淘汰野生型热差别杀菌法抗生素法菌丝过滤法饥饿处理法4、检出缺陷型和鉴别缺陷型5、生产能力测试当前30页,总共65页。当前31页,总共65页。当前32页,总共65页。

三、代谢控制育种

通过特定突变型的选育,达到改变代谢通路、降低支路代谢终产物的产生或切断支路代谢途径及提高细胞膜的透性,使代谢流向目的产物积累方向进行。当前33页,总共65页。反馈调节是指当合成代谢途径的终产物或分支代谢途径的终产物过量合成时,抑制合成代谢途径的关键酶的活力或其酶合成。反馈调节分为反馈抑制和反馈阻遏。(一)直线式代谢途径中的反馈抑制

当前34页,总共65页。(二)分支代谢途径中的反馈抑制

①优先合成:分支途径中一个终产物优先被合成,浓度过量后,抑制自身合成途径,使代谢转向合成另一个终产物。(例如黄色通杆菌优先合成谷氨酸,当谷氨酸过量后,使代谢转向合成天冬氨酸。)

②协同反馈抑制:分支途径中两个或两个以上的终产物单独存在时不能抑制共同途径中第一个酶,只有几个终产物同时过量存在时,才能抑制此酶。当前35页,总共65页。当前36页,总共65页。

③合作反馈抑制:分支途径中末端产物单独存在时仍有微弱的抑制作用,当几个末端产物共同存在时抑制作用增强。

(AMP和GMP单独存在都对磷酸核糖焦磷酸酶有抑制,但共同存在时,其抑制作用大于两个单独存在时的和。)当前37页,总共65页。④累积反馈抑制:分支途径中每一末端产物单独存在时,只是部分地抑制共同途径中地第一个酶。各个终产物地抑制作用互不影响,只有同时过量存在时,才使酶活力完全受到抑制,并且抑制的总百分数等于各单独抑制的百分数的和。当前38页,总共65页。⑤同工酶调节:一个共同途径的起始反应受两个或两个以上的酶所催化。这些酶催化同一个反应,但起分子结构不同。

当前39页,总共65页。⑥顺序反馈抑制:分支代谢途径中几个末端产物抑制分支点后第一个酶,使分支点产物累积,结果分支点产物又反馈抑制了共同途径中的第一个酶,最后使整个代谢途径停止。当前40页,总共65页。1、组成型突变株的选育

组成型突变株:是指操纵基因或调节基因突变引起酶合成诱导机制失灵,菌株不经诱导也能合成酶、或不受终产物阻遏的调节突变型。(三)代谢调节控制育种当前41页,总共65页。筛选方法及实例:(1)限量诱导物恒化培养将野生型的菌种经诱变后移接到低浓度诱导物的恒化器中连续培养。由于该培养基中底物浓度低到对野生型菌株不发生诱导作用,所以诱导型的野生型菌株不能生长,而突变株由于不经诱导就可以产生诱导酶而利用底物,因而很快得以生长成为组成型菌株。培养过程正确控制培养时间,使组成型突变株得以繁殖,而诱导型菌株则被淘汰。

例如在低浓度乳糖恒化器内连续培养大肠杆菌,其中组成型突变株不要加诱导物也能合成半乳糖苷酶,把乳糖分解成葡萄糖和半乳糖作为能源和代谢原料,迅速得以生长,但野生型菌株因缺少诱导物和相应的酶,不能利用乳糖而淘汰。

当前42页,总共65页。

(2)循环培养

要解除诱导的菌株,移接到含有诱导物和不含诱导物的培养基上交替连续循环培养。由于组成型突变株在两个培养基上都能产酶,生长逐渐占优势。先诱导,将培养物移接到含诱导物培养甚中培养,此时组成型菌株立即开始生长,而诱导型菌株须经一段停止时间才开始生长,只要细心控制在含诱导物培养基中培养时间,反复交替培养,组成型逐渐占优势,诱导型却被淘汰。当前43页,总共65页。(3)鉴别性培养基的利用如将诱变孢子悬液涂布在甘油作唯一碳源的平板上,培养后长出菌落。然后在菌落上喷上O-对硝基苯酚-β-D半乳糖苷(ONPG),组成型成黄色,诱导型呈白色。这是由于组成突变株在没有诱导底物存在时仍能产生β-半乳糖苷酶,将无色试剂水解,放出O-硝基苯酚,因而很容易挑选。此方法为目测法,可免去上述几种方法的浓缩富集过程。当前44页,总共65页。(4)筛选经诱变剂处理后的菌体移接到含有诱导能力低,但能作为良好碳源的诱导物的培养基中培养,突变体能良好生长,野生型不能生长。当前45页,总共65页。二抗分解调节突变株的选育抗分解调节突变就是指抗分解阻遏和抗分解抑制的突变。在实际生产中,最常见的是碳源分解调节、氮源分解调节和磷酸盐分解调节(尤其在次级代谢)。(例如以甘油和铵盐培养产气杆菌时,能产生组氨酸,当采用葡萄糖代替甘油作碳源,则酶的合成受抑制。易迅速利用的碳源对次级代谢的影响也很大,特别对抗生素。)当前46页,总共65页。(一)解除碳源调节突变株的选育筛选方法与实例:1.循环培养法将诱变剂处理后的微生物移接到快速利用的碳源和慢速利用的碳源培养基上进行交替培养,然后筛选需要的突变株。

当前47页,总共65页。2.特殊氮源用葡萄糖为碳源,受阻遏酶的底物作为唯一氮源配制成培养基,连续移接诱变后的产气杆菌,可以选出不受葡萄糖阻遏的组氨酸酶突变株。由于野生型菌株合成组氨酸酶被葡萄糖阻遏,而突变株则可产生组氨酸酶,能迅速生长形成菌落。3.葡萄糖结构类似物(2-Dg,3-Mg)筛选方法当前48页,总共65页。(二)解除氮源分解调节突变株的选育

氮源分解调节主要指含氮底物的分解酶受快速利用的氮源阻遏。细菌、酵母、霉菌等微生物对初级代谢产物的氮降解物具有调节作用。次级代谢的氮降解物的阻遏主要指铵盐和其他快速利用的氮源对抗生素生物合成具有分解调节作用。

筛选芽孢杆菌中耐氨基酸菌株,是提高蛋白酶产量的一种有效方法。因为高浓度氨基酸会抑制芽孢的形成,并且也阻遏蛋白酶的合成。据试验若从高浓度葡萄糖培养基中筛选高产蛋白酶芽孢杆菌,也能得到同样效果。当前49页,总共65页。(三)抗反馈调节实变株的选育

抗反馈调节突变株:是一种解除合成代谢反馈调节机制的突变型菌株。特点是所需产物不断积累,不会因其浓度超量而终止生产。如果由于结构基因突变而使变构酶成为不能和代谢终产物相结合的,便是失去了反馈抑制的突变,称为”抗反馈突变型”,若是由于调节基因突变引起调节蛋白不能和代谢终产物相结合而失去阻遏作用的,称为“抗阻遏突变型”。当前50页,总共65页。

筛选抗反馈调节突变株可以通过以下途径:1、回复突变引起的抗反馈调节突变株“原养型→营缺型→原养型”当前51页,总共65页。2、耐自身产物突变株选育一个菌株的生产能力与耐自身抗生素的浓度是呈正相关的。为了提高抗生素发酵水平,除了增强对发酵条件耐受性外,主要是选育对自身抗生素敏感性低,钝化酶活性高的突变株。当前52页,总共65页。3、抗终产物结构类似物突变株的选育结构类似物对于微生物是致死的,往往具有抑菌作用,在含有结构类似物的培养基上野生型是不能生长的,而抗结构类似物的突变株能生长。

筛选方法:把结构类似物做为筛选的遗传标记,采用浓度梯度法。当前53页,总共65页。4、累积前体和耐前体突变株的选育前体物对抗生素生物合成的产量影响:其一作为组成成分掺入生物合成,其二导致反馈调节。

用一系列平皿,做成梯度浓度,用于涂皿培养、此法浓度跨度大,有一定价值。

1.耐“毒牲”前体突变株的选育

2.耐前体结构类似物突变株的选育

3.耐前体的有关代谢物突变株的筛选当前54页,总共65页。(四)细胞膜透性突变株的选育1.营养缺陷回复突变株的选育可改变细胞膜透性

生物素缺陷型的突变株、油酸缺陷型的突变株、甘油缺陷型的突变株(通过控制发酵培养基中的某些化学成分,达到控制磷脂,细胞膜的生物合成,使细胞处于异常的生理状态,以解除渗透障碍。)2.温度敏感突变株的选育(控制细胞壁合成的酶,在高温条件下失活,导致细胞膜某些结构的异常。)3.溶菌酶敏感突株的选育当前55页,总共65页。(五)其他抗牲突变株的选育芽孢杆菌属的许多种类是重要的酶制剂生产菌。研究表明,产酶高峰和芽孢的形成有一定的关系。一般培养到一定阶段后就会产生芽孢,芽孢数量达到高峰,就停止产酶。如能延迟或不产生芽孢,酶的产量便可提高。如蜡状芽孢杆菌产淀粉酶菌株,菌种选育时发现在抗利福平的突变型中往往有较多的无芽孢突变株,把该菌用诱变剂处理,涂布在含利福平的培养基上,长出的菌落薄而透明(无芽孢突变型的特征),镜检或使用产生芽孢的培养基进行验证,结果得到的是无芽孢突变型。淀粉酶产量以7倍高于亲株。当前56页,总共65页。代谢(途径)工程istheuseofmoleculartechniques(orrecombinantDNAtechniques)toimprovetheefficiencyofpathwaysthatsynthesizespecificproducts.

-----LMPrescottetal.,in MICROBIOLOGY,5thed当前57页,总共65页。Zymomonasmobilis的乙醇发酵途径E

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