肠道致病菌检验技术

关于肠道致病菌检验技术第一页，共七十页，编辑于2023年，星期三第一节概述一、食品中常见的肠道致病菌沙门氏菌志贺氏菌大肠艾希氏菌变形杆菌耶尔森菌第二页，共七十页，编辑于2023年，星期三二、生物学特性1、形态与染色均为革兰氏阴性杆菌，中等大小，无芽胞，多数具有周身鞭毛能运动，志贺氏菌属无鞭毛无动力。2、培养和生化反应（1）、需氧或兼性厌氧，菌落中等大小，表面光滑，液体培养基混浊生长。（2）、肠道致病菌一般不分解乳糖，而非致病菌多能分解乳糖、葡萄糖产酸或产酸产气。（3）、可还原硝酸盐为亚硝酸盐。

第三页，共七十页，编辑于2023年，星期三

三、抗原类型

O抗原也称菌体抗原，细胞壁脂肪糖，耐热100℃不被破坏H抗原也称鞭毛抗原，鞭毛蛋白，不耐热，60℃30′可破坏K抗原也称表面抗原（荚膜抗原），多糖，具有阻抑O抗原发生凝集的现象，加热60℃30′可消除抑阻作用菌毛抗原第四页，共七十页，编辑于2023年，星期三四、致病性（一）、致病物质1、内毒素：能引起机体发热，白细胞减少，低血糖，血压降低，严重者休克。2、外毒素：对小肠粘膜细胞具有物殊毒害作用，引起腹泻。第五页，共七十页，编辑于2023年，星期三（二）、所致病疾

1、伤寒和副伤寒

2、食物中毒

3、细菌性痢疾第六页，共七十页，编辑于2023年，星期三

五、微生物检验的基本程序

检样→处理→增菌培养→分离培养→生化试验→血清学鉴定→报告

第七页，共七十页，编辑于2023年，星期三思考题1、肠道致病菌具有哪些生物学特性?2、肠道致病菌具有哪些抗原？又称为什么？有什么特点？3、写出肠道致病菌检验的基本程序第八页，共七十页，编辑于2023年，星期三第二节、沙门氏菌检验一、概况（一）沙门氏菌的发现与食物中毒（二）沙门氏菌的命名根据所致疾病命名根据菌的发现地区命名以发现者的名字命名（三）沙门氏菌的抵抗力

60℃30′可杀死第九页，共七十页，编辑于2023年，星期三

（四）沙门氏菌的分类地位及定义1、地位：是肠杆菌科、埃希氏菌族、沙门氏菌属中的细菌2、定义是肠杆菌科中形态和培养特征，生化反应及抗原结构相似，被O1噬菌体裂解的一群革兰氏阴性杆菌。第十页，共七十页，编辑于2023年，星期三二、生物学特性

（一）、形态与染色：革兰氏染色阴性，无荚膜，无芽胞，多数有鞭毛，有动力，短小杆菌。（二）、培养特性

1、需氧或兼性厌氧，最适温度37℃，PH7.2~7.4。第十一页，共七十页，编辑于2023年，星期三(沙门氏菌（红色）侵入人体细胞

第十二页，共七十页，编辑于2023年，星期三2、对营养要求不高，在普通培养基生长良好，37℃，24h，能形成菌落中等大小，直径2～3mm，圆形或卵形，表面光滑湿润，无色半透明，边缘整齐的菌落3、在液体培养基中，呈均匀混浊性生长，无菌膜。第十三页，共七十页，编辑于2023年，星期三（三）、生化特性1、发酵GLU，甘露醇，山梨醇产酸产气（伤寒鸡伤寒沙门氏菌少数不产气）2、不发酵乳糖，蔗糖，侧金黄花醇3、多数产生H2S（+），不产靛基质（-），不分解尿素（-），不产生乙酰甲基甲醇（V—P）（-），4、能还原硝酸盐为亚硝酸盐（+）5、在KCN培养基中生长（-），苯丙氨酸脱氨酸（-）第十四页，共七十页，编辑于2023年，星期三（四）、抗原结构主要两种：

A、O抗原

B、H抗原

C、表面抗原（K抗原）

D、菌毛抗原第十五页，共七十页，编辑于2023年，星期三2、O抗原（1）O抗原的表示方法共有58种，用字母O和阿拉伯数字标记：O1、O2、O3、O4如：伤寒杆菌：O9、O12第十六页，共七十页，编辑于2023年，星期三（2）沙门氏菌的分群及表示方法用大写字母及相关符号表示：

A、B、C、D、E、F……Z、O51~O63、O65~O67第十七页，共七十页，编辑于2023年，星期三（3）沙门氏菌中的主要菌群及其群特异性抗原

A群----O2

B群----O4

C群----O6

C1群----O7、C2群----O6O8

、

C3群----O8、C4群----O6O7O14

D群----O9

F群----O11E群----O3E2群----O3、O10族

E3群----O3、O15E4群----O1、O3、O19第十八页，共七十页，编辑于2023年，星期三3、H抗原（鞭毛抗原）

耐热性差：60℃15′或酒精处理可破坏沙门氏H抗原有两种：第1相：特异相，用英文小写字母表示a、b、c……zz1~z55第2相：非特异相，用阿拉伯数字表示1、2、3……其中也有用小写字母a、n、x等表示。

第十九页，共七十页，编辑于2023年，星期三4、表面抗原：

沙门氏菌有三种：Vi、M、5抗原、K抗原Vi抗原位于菌体的最表层，包围了O抗原，可阻碍O抗原的血清学凝集试验。破坏Vi抗原：60℃30′，100℃5′含有Vi抗原的沙门氏菌：伤寒沙门氏菌、丙型副伤寒沙门氏菌、都柏林沙门氏菌

第二十页，共七十页，编辑于2023年，星期三三、沙门氏菌食物中毒

（一）、引起食物中毒最常见的沙门氏菌：鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌（二）、易引起沙门氏菌中毒的食品

肉、蛋、乳类食品行业关注：美国两种花生酱含沙门氏菌

第二十一页，共七十页，编辑于2023年，星期三(三)、中毒原因

1、食用病畜禽的肉制品食品

2、病畜禽、带菌人和动物使食品受污染

3、用不洁净水外理食品

第二十二页，共七十页，编辑于2023年，星期三（四）、临床病状（所致病菌）

1、肠热病：伤寒与副伤寒病，为慢性发热的菌血病。由伤寒与副伤寒菌引起，潜伏期7~20天2、急性肠胃类：主要症状：头痛、发热、恶心、呕吐、腹泻、出冷汗、及全身不适，病程2~3天3、败血病：高烧、寒战、厌食、局部发炎、由猪霍乱沙门氏菌等引起

第二十三页，共七十页，编辑于2023年，星期三四、微生物检验

（一）、基本步骤（程序）检样→增菌（前增菌）→分离培养→生化试验初步鉴定→血清学反应最后鉴定→报告

第二十四页，共七十页，编辑于2023年，星期三1、前增菌：用无选择性的培养基使处于濒死状态的M恢复活力;2、选择性增菌：使沙门氏菌优势繁殖，基它细菌变到抑制;3、选择性平板分离培养：分离出所需的细菌;4、生化试验：鉴定分离出来的细菌是否符合所检项目的细菌;5、血清学鉴定：进一步鉴定。第二十五页，共七十页，编辑于2023年，星期三（二）、检验操作关键点

1、增菌：使待检菌复壮，抑制杂菌生长，提高检出率。

前增菌：用于加工过的食品，37℃，4~8h或18~24h，长有杂菌。增菌培养基：增菌液一般用MM和SC两种，如可能是伤寒沙门氏菌用TTB，用42℃培养。第二十六页，共七十页，编辑于2023年，星期三2、平板分离

选择性培养基：BS、DHL、HE、WS、SSBS中最好，DHL、HE、WS很好，SS最差一般要用：BS和WS/SS两个平板，BS主要用于伤寒沙门氏菌的分离第二十七页，共七十页，编辑于2023年，星期三BS上的菌落DHL上的菌落SS上的菌落第二十八页，共七十页，编辑于2023年，星期三3、五项生化试验

H2S、靛基质、PH7.2尿素酶、KCN、赖氨酸脱羧酶

第二十九页，共七十页，编辑于2023年，星期三（1）三糖铁培养的培养典型沙门氏菌在三糖铁培养上的特征：表面（-）粉红色、底层（+）黄色、H2S（+）底层有黑色、有动力。在TSI培养基中：表面（+）黄色、H2S（-）的培养物可排除，其它培养物均有可能是沙门氏菌。第三十页，共七十页，编辑于2023年，星期三

（2）其余四项生化实验靛基质PH7.2尿素酶KCN赖氨酸脱羧酶

反应序号：A1、A2多见，B1少见

第三十一页，共七十页，编辑于2023年，星期三（3）、典型沙门氏菌的五项生化反应及其检验的利用A、典型五项生化反应：A1

H2S（+）靛基质（-）PH7.2尿素酶（-）KCN（-）赖氨酸脱羧E（+）第三十二页，共七十页，编辑于2023年，星期三B、利用五项生化反应鉴定沙门氏菌的最简单方案

a、对于H2S阳性菌，利用五项生化反应试验可判别沙门氏菌和柠檬酸杆菌。b、对于H2S阴性菌，查到B1时即：H2S（-）靛基质（-）PH7.2尿素酶（-）KCN（-）赖氨酸脱羧E（+），补做ONPE试验，可判定沙门氏菌属和埃希氏菌属（ONPE（-）为沙门氏菌，ONPE（+）大肠艾希氏菌第三十三页，共七十页，编辑于2023年，星期三5、血清学试验（最后鉴定）

（1）、沙门氏菌诊断血清的种类：

10种组合血清：主要用于伤寒和副伤寒沙门氏菌鉴定

26种组合血清：常见致病菌的定群与分型

57种组合血清：常见定型，初步鉴定A—F群以外的菌型144种组合血清：全套装

第三十四页，共七十页，编辑于2023年，星期三（2）、血清学检验步骤

抗原准备→→

A—F多价血清检验（判定是否是沙门氏菌）→→群特异性抗体血清（如O2、O4、O3、O7、O8、O9、O10、O11（判定O群别）→→O单因子血清检查→

→H因子血清检查（分型）→→报告

第三十五页，共七十页，编辑于2023年，星期三五、检验结果的报告1、凡血清学鉴定与生化反应均符合者，报告发现沙门氏菌。经检验，×××食品发现有沙门氏菌

2、凡血清学鉴定与生化反应均不符合者，报告未发现沙门氏菌。

第三十六页，共七十页，编辑于2023年，星期三思考题：1、典型沙门氏菌的五项生化试验结果如何？2、沙门氏菌的形态特征，培养特性是什么？3、沙门氏菌检验时为什么要进行前增菌和增菌？4、沙门氏菌有哪些抗原？各有何特点？O、H抗原如何表示，A—F群沙门氏菌中，代表每群O特异性抗原的独特因子是什么？第三十七页，共七十页，编辑于2023年，星期三5、沙门氏菌哪几个菌型具有Vi抗原，Vi抗原对O抗原血清涟试验有何影响，对含Vi抗原菌，如何做O抗原血清学试验。6、沙门氏菌在SS平板，TSI培养基上生长的现象如何，说明其原理。7、分离纯化后怎样选用最少的生化试验方法初步鉴定检验菌是否是沙门氏菌属的细菌。8、如何进行沙门氏菌的血清学试验。第三十八页，共七十页，编辑于2023年，星期三第三节、志贺氏菌的检验一、生物学特性（一）、形态与染色革兰氏阴性短杆菌、无荚膜，无芽胞，无鞭毛

2~3um*0.5~0.7um第三十九页，共七十页，编辑于2023年，星期三（二）、培养特性1、需氧或兼氧性厌氧，最适温度37℃，PH7.2~7.42、在普通琼脂和SS平板上，能形成圆形、微凸、光滑湿润、无色半透明、边缘整齐、在中等大小的菌落3、宋氏志贺氏菌菌落较大，较不透明，粗糙而扁平，在SS平板上可迟发酵乳糖，菌落呈玫瑰红色。4、在肉汤中呈均匀混浊生长，无菌膜。

第四十页，共七十页，编辑于2023年，星期三（三）、生化反应1、发酵葡萄糖，产酸不产气，除宋氏志贺氏菌外，均不发酵乳糖。2、不发酵侧金盏花醇、肌醇、水杨苷。3、不产生H2S，不分解尿素，V-P试验阴性，不能利用柠檬酸盐。4、甲基红阳性。第四十一页，共七十页，编辑于2023年，星期三（四）、抗原结构1、抗原构成：O抗原：群特异性抗原：A、B、C、DK抗原：除B群外，一般有K抗原第四十二页，共七十页，编辑于2023年，星期三2、志贺氏菌的分群与血清型志贺氏菌分为四群：A群（痢疾志贺氏菌）：1~10型

B群（福氏志贺氏菌）：1~6型+X、Y两个变种，C群（鲍氏志贺氏菌）：1~15型D群（宋内氏志贺氏菌）

：1个型第四十三页，共七十页，编辑于2023年，星期三志贺氏菌属抗原的分类菌名

血清分类生化特性群型亚型甘露醇鸟氨酸脱羧酶志贺氏菌A1～10

－-福氏菌B1～6x、y变种1a、1b、2a、2b、3a、3b3c、4a、4b+-鲍氏菌C1～15

+-宋内氏菌D1

+＋第四十四页，共七十页，编辑于2023年，星期三葡萄糖+乳糖-甘露醇-痢疾志贺氏菌1、3、4、5、6、9、10型痢疾志贺氏菌2、7、8型福氏6型，鲍氏1、2、3、4、5、6、8、10、12、14型福氏痢疾菌（1、2、3、4、5型）鲍氏5、7、9、11、13、15型靛基质-乳糖+宋氏志贺氏菌

靛基质-靛基质+靛基质-靛基质+甘露醇+第四十五页，共七十页，编辑于2023年，星期三3、属内外抗原关系（1）群内抗原关系：

A群：2与10型，具有密切关系

C群：1与4和11型，10与11相关

B群：群抗原是B群各型之间的共同抗原（2）群间抗原关系：

C群17型与A群3型相关

C群18型与A群11型相关第四十六页，共七十页，编辑于2023年，星期三（3）属外抗原关系：

志贺氏菌与艾希氏菌属的O抗原关系非常密切，除A群9型和D群宋氏菌与埃氏希菌的O抗原关系未见报道外，每一个型都与一定的艾希氏菌的O抗原有关。第四十七页，共七十页，编辑于2023年，星期三4、K抗原对O抗原血清学试验的影响

可阻碍O抗原的血清学凝集试验，煮沸处理即可。

第四十八页，共七十页，编辑于2023年，星期三（五）志贺氏菌的抵抗力志贺氏菌属在外界环境中的生存力，以宋内氏最强，福氏菌次之，志贺氏菌最弱。一般在潮湿土壤中能存活34天，37℃水中存活20天，在粪便内（室温）存活11天。日光直接照射30分钟，56-60℃10分即被杀死，对高温和化学消毒剂很敏感，1%石炭酸中15-30分钟即被杀死，对氯霉素、磺胺类、链霉素敏感，但易产生耐药性。

第四十九页，共七十页，编辑于2023年，星期三二、志贺氏菌的致病性与食物中毒（一）流行病学第五十页，共七十页，编辑于2023年，星期三传染源食物、病人、粪便、苍蝇等第五十一页，共七十页，编辑于2023年，星期三（二）志贺氏菌的致病性致病因素：侵袭力、菌体内毒素、外毒素第五十二页，共七十页，编辑于2023年，星期三（二）临床症状A、急性细菌性痢疾：急性典型、急性非典型、急性中毒性菌痢。

B、慢性细菌性痢疾：慢性迁延型、慢性隐伏型、慢性急性发作型。第五十三页，共七十页，编辑于2023年，星期三三、微生物检验

（一）检验步骤（程序）检样→样品处理→增菌培养→SS、EMB平板分离培养→初步生化鉴定→最后血清学鉴定→报告第五十四页，共七十页，编辑于2023年，星期三（二）检验操作要点志贺氏菌在常温中生存的时间较短，应尽快进行试验。如24h内不能检验，样品应在冰箱内长时间不能检验，放在低温冰箱内。

第五十五页，共七十页，编辑于2023年，星期三1、增菌培养培养基：GN增菌液在36±1℃6—8h，当培养液出现轻微混浊即中止培养。第五十六页，共七十页，编辑于2023年，星期三2、分离培养

强选择性平板：SS或HE、WS弱选择性平板：EMB或麦康数在工作中36±1℃培养18—24h，菌落特征：无色透明，中等大小，光滑圆形菌落。第五十七页，共七十页，编辑于2023年，星期三HE平板原理及反应

发酵乳糖的某种肠杆菌不发酵乳糖的某种肠道菌，而且产生硫化氢，可能是沙门氏菌不发酵乳糖的肠道菌，可能就是志贺氏菌第五十八页，共七十页，编辑于2023年，星期三SS平板原理及反应SSAgar(SalmonellaShigellaAgar)大肠杆菌或者别的发酵乳糖的肠杆菌是沙门氏菌。有黑色中心。如果没有黑色中心，就很可能是志贺氏菌了第五十九页，共七十页，编辑于2023年，星期三麦康凯琼脂平板

第六十页，共七十页，编辑于2023年，星期三EMB平板照片及原理

第六十一页，共七十页，编辑于2023年，星期三3、初步生化鉴定

从平板上挑取3—4个可疑菌落，接种于TSI和葡萄糖半固体培养基各一管，36℃，18—24h，第六十二页，共七十页，编辑于2023年，星期三三糖铁（TSI）琼脂试验的原理2－志贺氏菌3－沙门氏菌4－大肠杆菌

葡萄糖半固体原理及结果。OrganismTestResult

1.Pseudomonasaeruginosa（铜绿假单胞菌）：Motile

2.Staphylococcusaureus：Non-motile

3.Bacillussubtilis：Motile第六十三页，共七十页，编辑于2023年，星期三志贺氏菌在TSI生长的结果（现象）：（1）斜面产碱仍