全合成虾青素的工业生产

全合成虾青素的工业生产新技术的研究可行性研究报告二○一二年二月一、立项的背景和意义类胡萝卜素是具有多个共轭双键的萜烯基团类化合物，迄今发现了600多种类胡萝卜素。虾青素就是一种重要的类胡萝卜素，它广泛存在于生物界，特别是鱼、虾、蟹等水生生物之中。虾青素早在20世纪30年代已从虾蟹壳中分离出来，直到2O世纪8O年代中期才对其生物学功能进行广泛研究。由于虾青素重要的生理功能及经济价值，近年来受到国内外的广泛研究。虾青素属于类胡萝卜素，主要用于高档水产养殖业，合成难度较大，但市场潜力也相当广阔。研究表明，虾青素在促进抗体的产生、增强宿主的免疫功能，用硫代巴比妥酸法检测各受试类胡萝卜素、α-生育酚等的抗氧化性，结果表明虾青素抗脂氧化的能力比β-胡萝卜素高10倍，比维生素E高100倍。虾青素对鱼类的生长繁殖有很重要的作用，虾青素可作为激素促进鱼卵受精，减少胚胎的死亡率，促进个体生长，增加成熟速度和生殖力。在欧美国家鲑鱼和鲟鱼的养殖发展很快，红鲑鱼的虾青素含量通常为5-20mg/kg鲜重，而其虾青素的喂养浓度为40-150mg/kg饵料，以此来计算，每年虾青素的产量需求既可达数十万吨，总价值达数亿美元。目前，我国的水产养殖发展很快，添加虾青素，生产高档水产品，前景十分广阔。由于虾青素的生理功能强大，应用也广泛，近年来国内外对虾青素的需求量也越来越大，目前虾青素在国际上主要由BASF、DSM所垄断。美国，加拿大，欧盟等国的许多生物技术公司致力于开发生产这类产品，但还远远不能满足市场需求，故价格较高。研发该产品对于增强国内类胡萝卜素色素类的国际竞争力，增加出口创汇，必将得到巨大的经济效益和社会效益，有着十分重要的意义。二、国内外研究现状和发展趋势（一）虾青素的国外研究现状：1、化学合成法生产虾青素。据文献报道，虾青素的化学合成有以下几条路线：（1）帝斯曼公司采用的合成工艺路线：C9+C6→C15，C15+2C10→C40路线图如下：（2）巴斯夫公司采用的合成工艺路线：C9+C6→C15，C15+2C10→C40与帝斯曼公司采用的合成工艺路线大同小异，主要不同在C15合成单元部分，其路线图如下：（3）2C10+C20→虾青素路线在Lewis酸催化下C10烯醇醚与C20双缩醛缩合反应得到C40骨架，再经碱处理得到虾青素，路线图如下：（4）以角黄素为原料的路线2、生物提取和微生物发酵生产：从生物体内提取的虾青素大多为反式结构，使用安全并具有环境友好性，有广阔的发展前景，当前虾青素的生物来源主要是：从水产品加工工业的废弃物中提取以及用微生物发酵生产。(1)从水产加工废弃物中提取虾青素。当前国外蟹虾加工工业每年有1000万吨的甲壳纲水产品废弃物，用聚合剂提取系统可从中提取虾青．虾青素酯和虾红素，其产率可达153rag／g废弃物。应当指出，废弃物中的石灰质会影响虾青素的产量，因此在提取时应尽量将其除去。近年来，挪威等国采用青贮技术处理水产废弃物，使回收率提高了18％，且纯度大大提高。实践证明，在青贮过程中加入无机酸或有机酸，会破坏虾青素与蛋白质或骨骼部分的结合，从而增加虾青素的释放量。从水产加工废弃物中提取虾青素的主要生产工艺如下：首先，在生产虾青素时，将贮存于双层乙烯袋中，在一70℃保存的废弃物，粉碎成膏状物：按重量比1：l加人大豆油，搅拌均匀后，用铅或铂把容器围起来避光，缓缓加热到90℃停止，利用低温离心技术，收集油溶液，使之分层，虾青素存在于上层色素液中，用分液装置分离，提纯，即得虾青素，此法生产条件要求苛刻，生产成本高，产量较低，产品纯度不高，因此，目前仅有少数国家应用这种技术生产虾青索。(2)利用藻类生产虾青素。在许多能产虾青素的藻类中，雨生红球藻(HaematoCOCCUS．Pluvialis)是很重要的虾青素产生菌。曾被认为是一种很有虾青素商业生产前景的微藻。该藻类既能进行自养，也能够进行异养生活在培养过程中，若氮源缺乏，则在藻体内积累虾青素。目前，国外优良的雨生红球藻体中虾青素含量高达0．2％-2％，一般约占类胡萝卜素总量的90％以上。另外，Chlorocccum．SP．具有耐高温，极端pH值，较快的生长速率和易在户外培养等优点，被认为是一种极具潜力的用于虾青素大规模生产的藻类，但藻类的自养周期长，由于需要光明，生产场所在一定程度上受到限制，并且藻类破壁释放虾青素困难。因此进行大规模生产也比较困难。(3)利用细菌生产虾青素。已知有2株能产生虾青素的细菌：乳酸分支杆菌(Mycobacterinm，l~cticola)，只在烃类培养基上产生虾青素，而在营养琼脂上不产虾青素；另一菌株短杆菌103(Bev．hactedI1rII)在石油里生长．发酵终了时生物量为3g／L，色素量仅有0．03mg／g。考虑到烃类发酵的不利之处和其较低的产量以及发夫酵母的可用性，未来上述2种细菌在生物技术上的应用看来是不可能的。(4)利用发夫酵母生产虾青素。1976年，Andrewes和Phaff等人在发夫酵母中发现了青素，这引起了人们的极大的关注。之后许多生物技术公司在对发夫酵母的研究上作了相当的努力，并取得了一定的进展。发夫酵母中发现虾青素不久，人们开始研究其应用的可行性及其对生物体色素形成的影响，在其后20余年的研究中，人们的研究精力主要放在了如下3个方面：①菌种的改良；②发酵工艺的优化；③细胞内虾青素的提取。总体来说，单从发酵培养基的优化来提高虾青素的含量，直到目前还未有突破性进展。除了虾青素的低产量，另一个影响发夫酵母商业应用的不利因素就是发夫酵母所需的培养基成本相对偏高。目前，由于生物来源的虾青素含量还不够高，且这种方式的生产条件要求苛刻，生产成本高，产量低，市场占有量小。目前90％以上的虾青素都是通过化学合成法得到，而且主要由巴斯夫和帝斯曼公司生产。（二）虾青素的国内研究现状：国内也在开展虾青素的研制，但主要集中在发酵或提取的路线，且多数仍然处在实验室的水平和规模。三、项目研究开发内容和技术关键及主要创新点通过对现有的虾青素的工艺路线、技术难度等的综合分析后决定采用化学合成法研究工业化合成虾青素的路线和工艺。以角黄素为原料合成虾青素的路线由于角黄素的价格高，中间体不稳定，使虾青素的成本大幅提高，其质量也不容易控制。2C10+C20→C40合成虾青素路线特征是在Lewis酸催化下C10烯醇醚与C20双缩醛缩合反应得到C40骨架。该路线创新性强，但C20双缩醛的制备工艺复杂，并且收率底，应用工业化有待进一步研究。以Witting反应为特征的C15+2C10→C40路线具有工艺简单，成本较低，而且是已工业化路线的优点。这条路线的关键是C15单元的合成，特别是C15双羟基化合物的制备工艺路线。我们的工作是对现有的帝斯曼和巴斯夫公司的工艺路线进行突破性改进和创新，从而形成具有我国自己知识产权并具有国际领先水平的虾青素生产技术。在参考大量文献的基础上，我们设计了以下路线：1、主环C9的合成：以氧代异佛尔酮为起始原料，双键在碱性条件下环氧化，碱性水解，氢化还原，羟基和羰基的双保护，得到重要中间体C9合成单元。2、C6合成单元的合成：丙酮和甲醛水溶液在微碱性条件下发生羟醛反应得到羟基丁酮，草酸脱水得到丁烯酮，同乙炔加成，硫酸重排得到重要的中间体六碳醇，此化合物是合成维生素A的重要中间体，将其羟基保护后得到此路线合成虾青素的C6合成单元。3、C15合成单元的合成：C6合成单元的炔基用二异丙氨基锂处理后与C9合成单元的羰基加成，在酸催化下水解脱保护和叔醇脱水，再选择性炔键还原成双键，与三苯基膦溴化氢反应得到C15三苯基盐。4、2,7-二甲基-2,4,6-辛三烯-1,8-二醛的合成：（1）乙醛二乙基乙缩醛（简称乙缩醛）与乙基（1-丙烯基）醚（简称丙烯基乙醚）在催化剂的作用下在-10℃~0℃温度下加成反应得到1,1,3-三乙氧基-2-甲基-丁烷；其中，所述催化剂为三氯化铁或三氯化铝；其中，乙醛二乙基乙缩醛是根据霍夫曼-拉罗奇有限公司的专利ZL97115390.6制备而得；（2）1,1,3-三乙氧基-2-甲基-丁烷在异喹啉和对甲苯磺酸催化作用下在180-200℃温度下裂解合成得到1-甲氧基-2-甲基-1,3-丁二烯；而在霍夫曼-拉罗奇有限公司的专利发明（ZL97115390.6）中采用硅酸铝小球催化剂，在高温下实现裂解合成1-甲氧基-2-甲基-1,3-丁二烯，其转化率只有41%，选择性为90%；（3）1-甲氧基-2-甲基-1,3-丁二烯溶在无水乙醇溶剂中与相转移催化剂十六烷基三甲基溴化铵和氯化试剂三氯异氰尿酸在-5~0℃温度下合成生成4,4-二乙氧基-3-甲基-1-氯丁烯；和（4）4,4-二乙氧基-3-甲基-1-氯丁烯与三苯基膦在60~65℃温度下成盐合成得到膦盐；和（5）膦盐在双氧水作用下在0~5℃温度下缩合，并用碳酸钠溶液维持体系pH=8～10生成1,1,8,8-四甲基-2,7-二甲基-2,4,6-辛三烯；再在5、虾青素的合成：与C15三苯基盐在碱存在下发生Wittig反应得到C40化合物虾青素。通过对现有的虾青素的工艺路线、技术难度等的综合分析后决定采用化学合成法研究工业化合成虾青素的路线和工艺。（一）．项目研究内容包括以下几个方面：1、研究主环C9的合成工艺；2、研究合成C6单元的工业化；3、研究高含量C15膦盐制备；4、优化全合成虾青素的工业化生产工艺。（二）．本项目的技术关键主要包括：1、提出了一条全新的十碳双醛的合成方法2、研究高纯度虾青素的工艺；3、研究各工艺过程的分析检测方法；4、研究九步反应每步的质量控制以及虾青素的质量控制标准等。（三）．主要创新点及技术路线：1、以氧代异佛尔酮为起始原料，双键在碱性条件下环氧化，碱性水解，氢化还原，羟基和羰基的双保护，得到中间体C9合成单元。2、丙酮和甲醛水溶液在微碱性条件下发生羟醛反应得到羟基丁酮，草酸脱水得到丁烯酮，同乙炔加成得到重要的中间体六碳醇。3、C6合成单元的炔基用二异丙氨基锂处理后与C9合成单元的羰基加成，在酸催化下水解脱保护和叔醇脱水，再选择性炔键还原成双键，与三苯基膦溴化氢反应得到C15三苯基盐。4、全新的2,7-二甲基-2,4,6-辛三烯-1,8-二醛（十碳双醛）的合成。5、与C15三苯基盐在碱存在下发生Wittig反应得到C40化合物虾青素。四、预期目标（主要技术经济指标、应用或产业化前景）由于我们已经进行了大量的前期研究工作并已经取得了突破性的进展，因此，再通过2年左右的技术攻关，争取达到以下主要技术经济指标：技术指标由于我们已经进行了大量的前期研究工作并已经取得了突破性的进展，因此，再通过2年左右的技术攻关，争取达到以下主要技术指标：1、从得到的重要中间体出发，探索出合理的路线及条件，力求路线简便，收率高，三废少。共计九步反应，优化每步合成收率，总收率从文献报道的35%提高到50%。2、研究各步反应物质的检测方法和控制指标，全面确定中间产物和最终产物的化学结构。3、产品质量标准、稳定性等各项研究，质量达到欧盟认证。4、研究确定中试放大工艺路线并实现产业化。经济指标：虾青素的开发成功，将形成年产虾青素原料15吨，虾青素10％微粒100吨，可以年增产值1亿元；年增税金1000万元；年增利润2000万元。应用及产业化前景：虾青素在国际市场上需求量很大，本产品的开发成功，不但可以大量出口创汇，还可以满足国内日益增长的市场需求。目前，由于生物来源的虾青素含量还不够高，且这种方式的生产条件要求苛刻，生产成本高，产量低，市场占有量小。目前90％以上的虾青素都是通过化学合成法得到，而且主要由巴斯夫和帝斯曼公司生产。国内也在开展虾青素的研制，但主要集中在发酵或提取的路线，且多数仍然处在实验室的水平和规模。由于虾青素的全合成工作非常难，国际上除了巴斯夫和帝斯曼公司实现工业化生产外，还未见有其他企业工业化的报道。由于虾青素在饲料行业的需求非常大，所以，国内有关虾青素的开发研究非常迅速。它的尽早研究开发成功，必将具有很大竞争力，产生巨大的经济效益和社会效益。五、研究方案和技术路线、组织方式与课题分解起始原料分离纯化工艺的研究分析检测的研究结构鉴定的研究关键中间体结构鉴定的研究化学合成研究分析检测的研究虾青素结构鉴定的研究化学合成研究分析检测的研究质量、质量标准和质量控制的研究虾青素成品本项目由项目承担单位负责研究开发，由我省大型制药企业负责有关的中试放大以及产业化。六、计划进度安排2012年1月~2012年12月1.打通并完善实验室工艺路线；2.建立反应过程中的中间体控制指标和检测方法；3.全面研究虾青素及其中间体的结构确证及质量控制和质量标准等工作。2013年1月~2013年11月1.优化工艺的各项参数，提高产品质量，降低产品成本；2.研究工艺的实验室放大实验、破坏实验，为生产做准备。3，设计并组织生产实施。2013年12月总结，项目验收七、现有工作基础和条件课题负责人简介：课题负责人多年来从事类胡萝卜素等多个系列项目的研发，曾获国家技术发明二等奖，浙江省有突出贡献中青年专家、省“新世纪人才151”第一层次培养人才、市拔尖人才、学科带头人、市领军人才，首届绍兴市企业创新之星，其带领的研发团队从事一系列新药的研究开发。近五年作为第一发明人已申请27项中国发明专利（其中10项已授权），二十多篇论文在中外核心期刊发表。项目组成员有相当的理论研究和实践工作经验，除承担单位的科研人员外，还有企业的生产研究骨干，项目管理员，能够承担中试放大研究工作，并且具有较好的团队协作精神。项目单位简介：1，项目承担单位是一所普通全日制综合性本科院校，化学化工学院是本单位在化学系和应用化学研究所合并基础上建成的二级学院。学院现设有化学（师范）、应用化学、药学和轻化工程4个本科专业，本单位与本项目相关的一些研究仪器已具备，已有核磁，GC、HPLC、傅立叶红外光谱仪、GC-MASS等等，具备合成、分析产物的顺利进行客观条件。2，合作单位一省内某大型制药企业的全资子公司，按照“高科技含量、高附加值、高市场占有率，低污染、低消耗，优势原料药上规模，特色制剂创品牌”的发展战略。主要规划生产生物医药类产品，分为药物制剂及原料药。生产具有自主知识产权的自主研发或从国外引进的抗肿瘤、抗感染等创新药物。按国际规范生产生命营养类产品，建成全球著名的生命营养类产品（维生素及类维生素）出口基地，是现代化高科技大型生物医药企业。已建标准化生产车间20个，占地140亩。为项目的实施创造了必要的条件。3，合作单位二项目合作单位系“全国医药大型综合性化学制药企业”，是上市公司的控股核心企业。为国家重点支持的高新技术企业，国家级创新型企业，国家级博士后科研工作站，国家级企业技术中心，被商务部授予重点培育和发展的出口名牌企业。企业综合经济指标列全国医药行业二十强，是集科研、生产、销售为一体的高新技术企业。具有50多年的专业制药经验，拥有一流的符合GMP要求的化学制药、微生物制药和制剂生产设施，兼产天然药物、食品添加剂和饲料添加剂。已通过了中国CCEMS、英国UKAS的ISO14001认证（环境管理体系）。具有完善的质量保证体系，原料药生产设施已通过欧盟、澳大利亚TGA和美国FDA的GMP检查，人类营养产品通过HACCP和ISO220001认证，源于天然的产品通过了IP认证，动物营养产品通过了FAMI-QS的认证。系中国氟喹诺酮类、维生素类和抗生素类药物的重要生产基地。自2001年始，有4个项目获国家科技进步二等奖及国家技术发明二等奖，1个国际合作奖，6个省科技进步一等奖。至2011年底,累计申请发明专利278项，授权发明专利86项；其中申请国际发明专利72项，授权国际发明专利11项。下属的国家级企业技术中心，技术力量雄厚，具有独立承担重大科研项目的开发能力。企业每年的研发投入占销售收入的6%左右，增强了企业的产品开发能力。在科研设施方面，不惜重金，建立研发平台，为科研、生产创造优越条件。不仅配有一批国际先进的科研设施而且在全厂形成计算机网络系统，已接入国际互联网，为国家数字图书馆核心会员单位，可方便地查询CA及各种信息、专利，从而为技术创新创造条件。在国内各大中城市建立了完整的药品销售网络，在美国和欧洲建有销售公司。同时，与国际相关大公司建立了长期紧密的合作关系。为虾青素产品日后的销售打下了基础。4、产学研结合情况从事虾青素研究开发的科研小组，通过该研究项目的实施，可以培养承担与合作单位的研究生；4~6名本科大学生；撰写学术论文2~3篇；以及申请3~6件中国或国际发明专利。项目承担单位研制的虾青素工业化生产新工艺具有创新性。虾青素项目已经进行了多年的探索性工作。配备了较先进的各种分析仪器，积累了大量的实验数据。因此，具有良好的硬件和软件条件，具备开发虾青素的实力。八、经费预