发酵工程发酵动力学

发酵工程发酵动力学第1页/共114页什么是发酵动力学？发酵动力学：是对微生物生长和产物形成过程的定量描述，研究微生物生长、产物合成、底物消耗之间动态定量关系，定量描述微生物生长

和产物形成

过程。主要研究：1、发酵动力学参数特征：微生物生长速率、发酵产物合成速率、底物消耗速率及其转化率、效率等；2、影响发酵动力学参数的各种理化因子；3、发酵动力学的数学模型。

第2页/共114页认识发酵过程的规律优化发酵工艺条件，确定最优发酵过程参数，如：基质浓度、温度、pH、溶氧，等等提高发酵产量、效率和转化率等研究发酵动力学的目的第3页/共114页发酵动力学研究的基本过程

首先研究微生物生长和产物合成限制因子；建立细胞生长、基质消耗、产物生成模型；确定模型参数；实验验证模型的可行性与适用范围；根据模型实施最优控制。第4页/共114页本章主要内容分批发酵动力学连续发酵动力学补料分批发酵动力学第5页/共114页6.1分批发酵动力学分批发酵动力学主要研究微生物在分批发酵过程中生长动力学、基质消耗动力学和代谢产物生产动力学。第6页/共114页什么是分批发酵？分批发酵：准封闭培养，指一次性投料、接种直到发酵结束，属典型的非稳态过程。第7页/共114页典型的分批发酵工艺流程图分批发酵过程第8页/共114页

分批发酵动力学细胞生长动力学底物消耗动力学产物形成动力学第9页/共114页微生物细胞倍增时间与群体生长动力学细菌：典型倍增时间1hr酵母：典型倍增时间2hr放线菌和丝状真菌：典型倍增时间4－8hr

微生物细胞群体生长动力学是反映整个群体的生长特征，而不是单个微生物生长倍增的特征。因此，菌龄是指一个群体的表观状态。关于菌龄的描述第10页/共114页所谓细胞生长动力学是以研究菌体浓度、限制性基质（培养基中含量最少的基质，其他组分都是过量的）浓度、抑制剂浓度、温度和pH等对菌体生长速率的影响为内容的。在分批发酵中，菌体浓度X,产物浓度P和限制性基质浓度S均随时间t变化三、微生物生长速率与底物浓度的关系第11页/共114页第12页/共114页分批发酵过程中，微生物生长通常要经历：延滞期、对数生长期、衰减期、稳定期（静止期）和衰亡期五个时期。第13页/共114页t1t2t3t4t5

分批发酵时典型的微生物生长动力学曲线菌体浓度X时间t分批发酵动力学-细胞生长动力学第14页/共114页AboutLagPhase（延迟期）在发酵工业生产中，为了提高生产效率，希望延迟期缩短，要达到该目的，应一般遵循下列规则：(1).接种的微生物应尽可能是高活力的。

要用处于对数期的微生物作种子.(2)种子培养基和条件应尽可能接近生产上使用的发酵液组成和培养条件。(3)建议采用大接种量。因细胞内部的某些维生素和辅酶等生长素，向周围培养液扩散，从而降低细胞的活性，延长延迟期。第15页/共114页AboutExponentialPhase：对数生长期的微生物生长速率正比于原有的微生物数，微生物生长特性通常以细胞浓度或细胞数量倍增所需的时间来表示，因此可以直接得出微生物的基本生长动力学方程：

μx=

，

μ=

。第16页/共114页指数生长期第17页/共114页微生物生长特性通常以单位细胞浓度或细胞数量倍增所需要的时间来表示（μ、μn）：或或X—细胞浓度（g/L）；N—细胞个数；t—生长时间；X0、Xt—初始微生物浓度和t时细胞浓度；N0、Nt—初始细胞个数和t时细胞个数；

—以细胞浓度表示的比生长速率；

—以细胞数量表示的比生长速率。

分批发酵动力学-细胞生长动力学第18页/共114页经过一段时间的培养后，由于营养的限制，微生物生长速率逐渐衰减，即进入生长衰减期，最终出现微生物净生长速率为零，微生物进入静止期。稳定期细胞生长和死亡处于动态平衡，净生长速率为0.衰亡期，比死亡速率大于比生长速率。第19页/共114页μ在对数期是常数，取得最大值，在其它生长期不是常数。分析各生长不同时期的μ数值。LagPhase：x无净生长，μ＝0；加速生长期：x增加，μ2＞μ1；ExponentialPhase：x对数增加，μ＝常数；减速生长期：x增加缓慢，μ4＜μ3；StationaryPhase：x无净生长，μ＝0；DeathPhase：x减少，μ＜0。第20页/共114页在分批发酵体系中，可以通过探究在一定底物浓度范围内的微生物生长情况，来了解微生物生长受底物浓度限值的特性。第21页/共114页分批发酵中初始底物浓度对稳定期菌体浓度的影响

A～B区：菌体浓度与初始底物浓度成正比，有：

X为菌体浓度，为针对底物的细胞得率，初始X0为零；S0为底物初始浓度；St为底物残留浓度。

B～C区：随S0增加，菌体浓度达最高水平，再增加S0

，菌体不再增加。C区：菌体活性受初始高浓度底物及高渗作用抑制，菌体浓度与初始底物浓度成反比。

高浓度底物抑制的情形第22页/共114页Decline（开始出现一种底物不足的限制）:(1)若不存在抑制物时

Monod模型:

分批发酵动力学-细胞生长动力学第23页/共114页式中:S—限制性基质浓度，mol/m3Ks—底物亲和常数(也称半饱和速度常数），表示微生物对底物的亲和力

,mol/m3

；Ks越大，亲和力越小，

µ越小。①当S较高时，(对数期满足S>>10Ks)，此时，µ=µm②当S较低时，(减速期，S<<10Ks)，此时S↓，µ↓∴减速期，

µ↓分批发酵动力学-细胞生长动力学第24页/共114页1949年Monod发现，细菌的比生长速率与单一限制性底物之间存在这样的关系：第25页/共114页比生长素率μ限制性底物残留浓度St

残留的限制性底物浓度对微生物比生长率的影响

表征μ与培养基中残留的生长限制性底物St的关系

Monod方程：Ks—底物亲和常数，等于处于1/2μm时的底物浓度，表征微生物对底物的亲和力，两者成反比。第26页/共114页μ：菌体的生长比速S：限制性基质浓度Ks：底物亲和常数μmax:最大比生长速度单一限制性基质：就是指在培养微生物的营养物中，对微生物的生长起到限制作用的营养物。μKsμ第27页/共114页限制性底物是培养基中任何一种与微生物生长有关的营养物，只要该营养物相对贫乏时，就可能成为限制微生物生长的因子，可以是C源、N源、无机或有机因子。第28页/共114页Monod方程是典型的均衡生长模型，其基本假设如下：•（1）描述细胞生长的唯一变量是细胞浓度X，•（2）培养基中只有一种基质是生长限制性基质，其它组分均过量，•（3）细胞的生长视为单一反应，细胞得率为常数，当S﹤﹤Ks时，μ=μmS/Ks，μ与S是一级动力学关系，（4）S﹥﹥Ks，μ=μm，μ与S是零级动力学关系。第29页/共114页Monod研究了基质浓度与生长速度的关系———Monod方程(1949)米氏方程:μKsμ第30页/共114页莫诺方程表面上与米氏方程同型。但是Monod方程来自于对实验现象的总结，而米氏方程是根据酶促反应机理推导出的。前者是经验方程，后者是机理方程。第31页/共114页Monod方程的参数求解(双倒数法)：将Monod方程取倒数可得：或：

这样通过测定不同限制性基质浓度下，微生物的比生长速度，就可以通过回归分析计算出Monod方程的两个参数。但在低S值时，μ的偏差较大，影响Ks值的精度。第二方程好用一些，在低S值时精度高，也可用回归方法。第32页/共114页Monod方程的意义当S«

Ks,μ-S是线性关系，μ与S成正比。当S»

Ks，μ≈μmax，此时微生物的生长不受限制基质的影响。第33页/共114页对某一钟微生物在某种基质条件下，μmax和Ks是一定值。不同的微生物有不同的μmax和Ks。即使同一种微生物在不同的基质种也有不同的μmax和Ks。Ks越大，表示菌体对基质的亲和力越小。第34页/共114页Monod方程应用：测定微生物对不同底物的亲和力大小（Ks值）实验确定适于微生物生长的最佳底物（？）比较不同底物发酵最终残留的大小（？）比较不同微生物对同一底物的竞争优势，确定连续培养的稀释率第35页/共114页

KS越大，表示微生物对营养物质的吸引亲和力越小，反之越大。对于许多微生物来说，KS值是很小的，一般为0.1~120mg/l或0.01~3.0mmol/l，这表示微生物对营养物质有较高的吸收亲和力。第36页/共114页基质消耗动力学基质包括细胞生长与代谢所需的各种营养成分，其消耗分为三个方面：细胞生长，合成新细胞；细胞维持生命所消耗能量的需求；合成代谢产物。第37页/共114页

发酵动力学发酵动力学涉及的常规参数第38页/共114页2、得率(或产率，转化率，Y)：是指被消耗的物质和所合成产物之间的量的关系。包括生长得率(Yx/s)和产物得率(Yp/s)。生长得率：是指每消耗1g(或mo1)基质(一般指碳源)所产生的菌体重量(g)，即Yx/s=ΔX/ΔS产物得率：是指每消耗1g(或mo1)基质所合成的产物的克数(或mol数)。这里消耗的基质是指被微生物实际利用掉的基质数量。第39页/共114页菌体生长速率为∶底物消耗速率为∶

产物生成速率为:3、有关速率的概念第40页/共114页4、有关比速率的概念基质比消耗速率[qs,g(或mo1)／g菌体·h]：系指每克菌体在一小时内消耗营养物质的量。它表示细胞对营养物质利用的速率或效率。产物比生产速率[qp，g(或mo1)／g菌体·h]：系指每克菌体在一小时内合成产物的量，它表示细胞合成产物的速率或能力，可以作为判断微生物合成代谢产物的效率。

第41页/共114页细胞生长的比速率为：

底物消耗的比速率为qs∶

产物形成的比速率为qp：第42页/共114页

根据发酵时间过程分析，微生物生长与产物合成存在以下三种关系：与生长相关→生长偶联型与生长部分相关→生长部分偶联型与生长不相关→无关联分批发酵动力学-产物形成动力学第43页/共114页相关型部分相关型非相关型产物合成相关、部分相关、非相关模型动力学示意图第44页/共114页与生长相关→生长偶联型：乙醇发酵

产物的生成是微生物细胞主要能量代谢的直接结果，菌体生长速率的变化与产物生成速率的变化相平行。分批发酵动力学-产物形成动力学第45页/共114页

与生长部分相关→生长部分偶联型：

柠檬酸、氨基酸发酵

产物间接由能量代谢生成，不是底物的直接氧化产物，而是菌体内生物氧化过程的主流产物（与初生代谢紧密关联）。分批发酵动力学-产物形成动力学第46页/共114页与生长不相关→无关联：抗生素发酵若考虑到产物可能存在分解时，则

产物生成与能量代谢不直接相关，通过细胞进行的独特的生物合成反应而生成。分批发酵动力学-产物形成动力学第47页/共114页

习惯上把与生长无关联的产物称为次级代谢产物，他们的合成发生在生长停止之后。次级代谢作用的一个重要特征是，产物的生成只有在生产菌处于低的生长速率条件下才能发生。所以生长速率有可能是分解代谢产物的阻抑作用因子，而与营养限制无关。

第48页/共114页杀假丝菌素分批发酵动力学分析

杀假丝菌素分批发酵中的葡萄糖消耗、DNA含量和杀假丝菌素合成的变化。

应用举例第49页/共114页分批发酵的优缺点优点：操作简单、投资少运行周期短染菌机会减少生产过程、产品质量较易控制缺点：不利于测定过程动力学，存在底物限制或抑制问题，会出现底物分解阻遏效应?及二次生长?现象。对底物类型及初始高浓度敏感的次级代谢物如一些抗生素等就不适合用分批发酵（生长与合成条件差别大）养分会耗竭快，无法维持微生物继续生长和生产非生产时间长，生产率较低

第50页/共114页连续发酵动力学第51页/共114页什么是连续发酵？连续发酵概念：在发酵过程中，连续向发酵罐流加培养基，同时以相同流量从发酵罐中取出培养液。连续发酵特点：

添加培养基的同时，放出等体积发酵液，形成连续生产过程，获得相对稳定的连续发酵状态。连续发酵类型：

单级多级连续发酵第52页/共114页（一）连续发酵类型及装置（二）连续发酵动力学模型1.单级恒化器连续发酵2.多级恒化器连续发酵（三）连续发酵动力学理论的应用及存在问题

主要内容第53页/共114页连续发酵类型及装置

罐式连续发酵单级多级串联细胞回流式

塞流式连续发酵连续发酵动力学-发酵装置第54页/共114页单级连续发酵示意图连续发酵动力学-发酵装置-单级第55页/共114页

两个及以上的发酵罐串联起来，前一级发酵罐的出料作为下一级发酵罐的进料。

连续发酵动力学-发酵装置-多级串联两级连续发酵示意图第56页/共114页罐式连续发酵实现方法恒浊法：通过调节营养物的流加速度，利用浊度计检测细胞浓度，使之恒定。恒化法：保持某一限制性基质在一恒定浓度水平，使菌的比生长速率µ保持一定。培养基输入培养基进入下一级发酵罐培养基进入后处理或到下一级发酵罐

多级罐式连续发酵装置示意图

连续发酵动力学-发酵装置-多级串联第57页/共114页

a:再循环比率（回流比）

c:浓缩因子细胞回流的单级连续发酵示意图连续发酵动力学-发酵装置-细胞回流式第58页/共114页发酵罐培养物流出无菌培养基流入供给连续接种再循环d连续发酵动力学-发酵装置-塞流式第59页/共114页

定义：

①稀释率D=F/V(h-1)

F—流量（m3/h）V—原有培养液体积（m3）

②理论停留时间

连续发酵动力学-理论-单级恒化器连续发酵第60页/共114页

细胞的物料衡算（µ和D的关系）对于单级恒化器：X0=0且通常有：

连续发酵动力学-理论-单级恒化器连续发酵积累的细胞（净增量）=流入的细胞-流出的细胞+生长的细

胞-死亡的细胞第61页/共114页连续发酵动力学-理论-单级恒化器连续发酵A.稳定状态时(恒浊培养）此时µ=D（单级连续发酵重要特征）B.不稳定时，当µ<D，当µ>D，第62页/共114页积累的营养组分=流入量-流出量-生长消耗量-

维持生命需要量-形成产物消耗量稳态时（恒化培养），=0,一般条件下,mx<<产物相对菌体生长量较少,

限制性基质的物料衡算连续发酵动力学-理论-单级恒化器连续发酵第63页/共114页

稳态时,

单级连续培养两个稳态方程是：

限制性基质的物料衡算连续发酵动力学-理论-单级恒化器连续发酵第64页/共114页

两个稳态方程隐含了几点假设：Yx/s

对于一个特定微生物及具体操作参数(D)

来讲是常数Yx/s只受一种限制性营养基质S的影响：S一定，µ一定，则Yx/s一定

连续发酵动力学-理论-单级恒化器连续发酵第65页/共114页恒化器

是一种使培养液流速保持不变，并使微生物始终在低于其最高生长速率条件下进行生长繁殖的一种连续培养装置。称为外控制式的连续培养装置，通过控制某一种营养物的浓度，使其始终成为生长限制因子的条件下达到的稳态连续培养。这样，既可获得一定生长速率的均一菌体，又可获得虽低于最高菌体产量，却保持稳定菌体密度的菌体。在恒化器中，一方面菌体密度会随时间增长而增高，另一方面，限制生长因子的浓度又会随时间的增长而降低，两者互相作用的结果，出现微生物的生长速率正好与恒速流入的新鲜培养基流速相平衡。第66页/共114页第67页/共114页(2)恒浊器

是根据培养器内微生物的生长密度，并借光电控制系统来控制培养液流速，以取得菌体密度高、生长速度恒定的微生物细胞的连续培养器。可称为内控制式的连续培养装置，当培养基的流速低于微生物生长速度时，菌体密度增高，这时通过光电控制系统的调节，可促使培养液流速加快，反之亦然，并以此来达到恒密度的目的。因此，这类培养器的工作精度是由光电控制系统的灵敏度来决定的。在恒浊器中的微生物，始终能以最高生长速率进行生长，并可在允许范围内控制不同的菌体密度。在生产实践上，为了获得大量菌体或与菌体生长相平行的某些代谢产物如乳酸、乙醇时，都可以利用恒浊器。第68页/共114页恒浊器第69页/共114页恒浊器与恒化器的比较装置控制对象培养基培养基流速恒浊器菌体密度（内控制）无限制生长因子不恒定恒化器培养基流速（外控制）有限制生长因子恒定第70页/共114页细胞浓度与稀释率的关系（x与D的关系）临界稀释率Dc导致菌体开始从系统中洗出时的稀释率，当流入底物浓度为S0时，临界稀释率Dc为：稀释率D的大小不能超过连续发酵系统的临界稀释率第71页/共114页

如果取

D>DC

，则会出现：D>DC>µ由

可知

负增长，x↓，进入非稳态，菌体最终被洗出，即x=0时，达到“清洗点”，此时，

连续发酵动力学-理论-单级恒化器连续发酵第72页/共114页

细胞浓度与稀释率的关联（X与D的关系）

应用Monod方程，此时，

连续发酵动力学-理论-单级恒化器连续发酵第73页/共114页

生长模型

由两个稳态方程可以推出D与X关联的生长模型当D<DC时，

细胞衡算

底物衡算

连续发酵动力学-理论-单级恒化器连续发酵第74页/共114页

细胞生产率细胞生产率

当

即

时可获得最大的细胞生产率，为连续发酵动力学-理论-单级恒化器连续发酵第75页/共114页

细胞生产率

若S0>>Ks

（S0>10Ks）,底物供给浓度很大，为非限制性则

此时，最大临界稀释率

∴当D>Dc=时，连续发酵动力学-理论-单级恒化器连续发酵第76页/共114页x,s,Dx与D关系总结：连续发酵动力学-理论-单级恒化器连续发酵第77页/共114页

产物的物料衡算产物变化率=细胞合成产物速率+流入-流出-分解项

当连续发酵处于稳态，，

且加料中不含产物，即，P分解速率可忽略。

得连续发酵动力学-理论-单级恒化器连续发酵第78页/共114页图6-9、6-10Ks值与细菌连续培养特征的关系第79页/共114页多级连续发酵第80页/共114页多级恒化器的优点：在不同级的罐内可以预先设定不同的培养条件，这将有利于多种碳源的利用和次级代谢产物的生产。例如：产气雷白菌，第一级：葡萄糖；第二级：麦芽糖第81页/共114页连续培养在工业中的应用连续发酵中，可采用能达到最大菌体产率DX的稀释速率。图6-13.分批发酵时，最大菌体生产能力出现于发酵终点；连续培养时，以最适稀释速率使培养处于稳定条件下，细胞的生产能力成为一个常数。第82页/共114页连续培养过程中的主要问题

连续发酵过程具有许多优点：在连续发酵达到稳定状态之后，①其非生产时间几乎等于0，因此设备利用率高；②操作比较简单；③产品质量比较稳定；④对发酵设备以外的外围设备（如蒸汽锅炉、泵）的利用率高；⑤可以及时排出在发酵过程中产生的、对发酵过程有害的物质等。

第83页/共114页

连续发酵技术也存在一些问题，其中最主要的是菌种的稳定性问题：杂菌污染生产菌株突变

第84页/共114页杂菌污染问题在连续发酵过程中，需要长时间连续不断地向发酵系统供给无菌的新鲜空气和培养基，这就不可避免地发生杂菌污染问题。杂菌污染问题是连续培养中难以解决的问题。要了解污染的杂菌在什么样的条件下会在系统中发展成为主要的微生物群体。

第85页/共114页

假设连续培养系统被外来的生物Y、Z和W污染，这些污染菌的积累速率可用以下物料平衡式表示：

污染菌积累的速率＝污染菌进入的速率－污染菌流出的速率＋污染菌生长速率

式中X’是污染菌Y、Z和W的浓度，在稀释率为D时的残留限制性基质浓度为S。

第86页/共114页

将污染的生物Y、Z和W的生长速率－基质浓度曲线与连续培养系统中作为生产菌的生物X的曲线作比较，分别示于图（a）、(b)、(c)。第87页/共114页由于限制性养分浓度是S，生物Y的生长速率比系统的稀释率D要小（图a）。因此Y的积累由下式表示：结果是负值，污染物Y不能在系统中存留。这是一次性污染，没有造成持续污染。

第88页/共114页污染物Z的生长速率与基质浓度的关系则与图a中的有显著不同。在基质浓度为S的情况下，生物Z能以比D大的比生长速率生长。生物Z的物料平衡为：第89页/共114页

生物W侵入的成功与失败决定于系统的稀释速率。在稀释率为0.25Dc下(式中Dc是临界稀释速率)，W竞争不过X，W被冲走；如果稀释率增加到0.75Dc，污染物W将和Z一样有竞争力，而原来的菌被冲走。

第90页/共114页在培养基浓度高时，造成杂菌积累，X被洗出，W成为杂菌污染。在培养基浓度低，D也较小情况下，可以淘汰W。所以在了解杂菌性能后，既要控制稀释率D，又要控制培养基浓度来排除杂菌污染。第91页/共114页在分批培养中，任何能在发酵培养液中生长的污染物将存活和开始积累，但在连续培养中污染物能否生长取决于它在培养环境中的竞争能力。因此用连续培养技术可选择性地积累一种能有效使用限制性养分的菌种。第92页/共114页

2.生产菌株突变问题

微生物在复制过程中难免会出现差错引起突变，一旦在连续培养系统中的生产菌细胞群体中的某一个细胞发生了突变，而且突变的结果使这一细胞获得在给定条件下高速生长的能力，那么它就有可能像杂菌Z一样，取代系统中原来的生产菌株，而使连续发酵过程失败。

第93页/共114页

应用有助于了解和研究细胞生长、基质消耗和产物生成的动力学规律，从而优化发酵工艺。便于研究细胞在不同比生长速率下的特征。连续发酵动力学-理论第94页/共114页利用细胞再循环连续发酵技术进行废水的生化处理、发酵与产物分离耦合。利用连续培养的选择性进行富集培养菌种选择及防污染处理。

应用连续发酵动力学-理论第95页/共114页实验数据如下：t24h(生长罐）48h（生产罐）60hP1=0.07g/LP2=0.4g/LP3=0.62g/LX1=7g/L

求操作参数D？并比较连续发酵与分批发酵的生产率。

应用-青霉素连续发酵与分批发酵对比

第96页/共114页计算：采用连续发酵时第一罐：第二罐：由第97页/共114页

为了保证串联稳定，两罐稀释率差异用体积差异进行调节。∵F相同

产物在串联系统停留时间产物形成速率

第98页/共114页而分批发酵时，tn=48h,P=0.4g/L故产物形成速率DP=0.4/48=0.0083g/L·h

（比连续发酵低）为充分利用基质，再加一罐(第三罐)(相当于60h)第99页/共114页tn=1/D1+1/D2+1/D3=53.7h产物形成速率P3/tn=0.0115g/L·h分批发酵P3/t3=0.62/60=0.0103g/L·h第100页/共114页什么是补料分批发酵？补料分批培养（Fed-batchculture）：

分批发酵过程中补充培养基，不从发酵体系中排出发酵液，使发酵液的体积随着发酵时间逐渐增加。第101页/共114页概念：在发酵过程中，不连续地向发酵罐内加入培养基，但不取出发酵液的发酵方式。特点：由于培养基的加入，发酵液体积不断增加。补料分批发酵动力学第102页/共114页半连续发酵概念：在发酵过程中，每隔一定时间，取出一定体积的发酵液，同时在同一时间间隔内加入相等体积的培养基，如此反复进行的发酵方式。特点：稀释率、比生长速率以及其它与代谢有关的参数都将发生周期性的变化。补料分批发酵动力学第103页/共114页

类型

连续流加补料方式不连续流加多周期流加

快速流加恒速流加变速流加单一组分补料多组分补料

流加方式补料分批发酵动力学以补加的培养基成分来区分

第104页/共114页整个发酵罐中细胞、限制性基质和产物总量的变化速率可用下式表示：

①