实验五拟南芥插入突变纯合体的鉴定

关于实验五拟南芥插入突变纯合体的鉴定第一页，共二十页，编辑于2023年，星期一实验目的1．熟练掌握植物基因组DNA快速提取的方法；2．掌握利用PCR方法鉴定拟南芥T-DNA插入突变体的方法。

第二页，共二十页，编辑于2023年，星期一T-DNA插入鉴定的原理第三页，共二十页，编辑于2023年，星期一突变体鉴定的步骤T-DNA插入基因的基因组序列；T-DNA插入方向的确定；T-DNA插入位置的确定；引物设计；PCR扩增；电泳检测。第四页，共二十页，编辑于2023年，星期一T-DNA插入基因的基因组序列第五页，共二十页，编辑于2023年，星期一点击基因编号进入网页第六页，共二十页，编辑于2023年，星期一点击sequenceviewer进入第七页，共二十页，编辑于2023年，星期一点击nucleotideview进入

第八页，共二十页，编辑于2023年，星期一点击突变体编号后进入的网页第九页，共二十页，编辑于2023年，星期一进入网站/cgi-bin/tdnaexpress查找基因突变体及插入方向第十页，共二十页，编辑于2023年，星期一第十一页，共二十页，编辑于2023年，星期一基因方向T-DNA方向5’引物3’引物实验设计第十二页，共二十页，编辑于2023年，星期一引物设计基因上面引物的设计可以通过下面提供的拟南芥网站/tdnaprimers.html进行自动生成，也可以根据自己的需要进行设计。一般进行鉴定的引物距离T-DNA插入的位置300bp以上为宜，即300+Nbp。LBa1ofpBIN-pROK2forSALKlines：TGGTTCACGTAGTGGGCCATCG第十三页，共二十页，编辑于2023年，星期一植物基因组DNA的快速提取

（1）取植物叶片（拟南芥一片叶子），置于1.5ml离心管中，加入400ml提取缓冲液；（2）用研磨棒研磨植物材料，直至缓冲液变为绿色；（3）在台式离心机上13000rpm离心5分钟；（4）离心后将上清300ml转移至一个新的1.5ml离心管中；（5）在上清中加入300ml异丙醇，混匀后于室温下13000rpm条件下，离心5分钟；（6）弃上清后，用70%乙醇润洗沉淀，并在室温下干燥沉淀；（7）100mlTE溶解沉淀，将制备好的样品在4℃保存备用。（此方法提取的基因组DNA只适用于PCR的鉴定，不适合酶切和大片段基因的扩增）第十四页，共二十页，编辑于2023年，星期一PCR鉴定30ml反应体系：

2ml植物基因组DNA样品

3ml10×扩增缓冲液

0.5mlTaqase（5U/ml）

0.5mldNTP（10mmol/L）

1ml引物1（10mmol/L）

1ml引物2（10mmol/L）用无菌水补足体积。第十五页，共二十页，编辑于2023年，星期一PCR反应条件94℃3min30循环（94℃/1min，55℃/1min，72℃/1min）；

72℃延伸10min。注：反应条件需根据所要扩增产物的大小和引物的性质进行合适的调整。第十六页，共二十页，编辑于2023年，星期一PCR安排每小组四个PCR反应，引物和DNA模板分别如下：1.WT基因组模板2个PCR反应：引物分别为基因自身的5‘和3’端引物；5‘引物和LBa引物。2.突变体基因组为模板2个PCR反应：引物分别为基因自身的5‘和3’端引物；5‘引物和LBa引物。第十七页，共二十页，编辑于2023年，星期一046号突变体的鉴定（1-6组）

30ml反应体系1：

2ml植物基因组DNA样品（WT）

3ml10×扩增缓冲液

0.5mlTaqase（5U/ml）

0.5mldNTP（10mmol/L）

1ml0465’引物（10mmol/L）

1ml0463’引物（10mmol/L）30ml反应体系2：

2ml植物基因组DNA样品WT

3ml10×扩增缓冲液

0.5mlTaqase（5U/ml）

0.5mldNTP（10mmol/L）

1ml0465’引物（10mmol/L）

1mlLBa引物（10mmol/L）

30ml反应体系3：

2ml植物基因组DNA样品（111）

3ml10×扩增缓冲液

0.5mlTaqase（5U/ml）

0.5mldNTP（10mmol/L）

1ml0465’引物（10mmol/L）

1ml0463’引物（10mmol/L）30ml反应体系4：

2ml植物基因组DNA样品（111）

3ml10×扩增缓冲液

0.5mlTaqase（5U/ml）

0.5mldNTP（10mmol/L）

1ml0465’引物（10mmol/L）

1mlLBa引物（10mmol/L）第十八页，共二十页，编辑于2023年，星期一135号突变体的鉴定（7-11组）

30ml反应体系1：

2ml植物基因组DNA样品（WT）

3ml10×扩增缓冲液

0.5mlTaqase（5U/ml）

0.5mldNTP（10mmol/L）

1ml1355’引物（10mmol/L）

1ml1353’引物（10mmol/L）30ml反应体系2：

2ml植物基因组DNA样品（WT）

3ml10×扩增缓冲液

0.5mlTaqase（5U/ml）

0.5mldNTP（10mmol/L）

1ml1353’引物（10mmol/L）

1mlLBa引物（10mmol/L）

30ml反应体系3：

2ml植物基因组DNA样品（111）

3ml10×扩增缓冲液

0.5mlTaqase（5U/ml）

0.5mldNTP（10mmol/L）

1ml1355’引物（10mmol/L）

1ml1353’引物（10mmol/L）30ml反应体系4：

2ml植物基因组DNA样品（111）

3ml10×扩增缓冲液

0.5mlTaqas