单基因遗传病的研究策略

如果一种遗传病的发病仅仅涉及到一个基因，这个基因称为主基因(majorgene)，其导致的疾病称为单基因病。单基因遗传病当前1页，总共79页。单基因遗传病发病的复杂性外显率：一定基因型个体表现出疾病表型的比例表现度：相同基因型不同个体在疾病表现程度的差异基因多效性：一个基因有多种生物学效应遗传异质性：表型相似而基因型不同的现象从性遗传和限性遗传：常染色体上的基因在不同的性别有不同的表达程度和表达方式，从而造成男女性状分布上的差异遗传早现现象：疾病在世代中存在发病年龄逐渐提前或病情逐代加重的情况当前2页，总共79页。研究策略与方法临床诊断、家系调查与材料收集侯选基因的确定已知致病基因突变位点的确定连锁分析与未知基因的基因定位基因型与表现型相关性研究发病机制的研究当前3页，总共79页。临床诊断、家系调查与材料收集当前4页，总共79页。临床诊断查阅相关资料，认识不同遗传病患者临床表现及其辅助诊断措施临床诊断：症状和体征常规辅助检测指标特殊诊断指标当前5页，总共79页。家系调查与系谱分析调查家系三代以上所有相关成员的信息根据调查资料，用系谱中常用的符号绘制成系谱系谱分析：区别遗传病与非遗传病区别单基因与多基因病判断遗传方式当前6页，总共79页。大家系当前7页，总共79页。散发病例当前8页，总共79页。临床遗传病家系特点散发病例：对于遗传病，包括单基因遗传病，多数病例表现为散发。小家系病例：在有家族史的病例中，多数也是小家系。大家系病例：极少数家系发病个体多，涉及3-4代都有患者。当前9页，总共79页。收集材料采集样品：

外周血，颊粘膜脱落细胞，毛囊,

病人组织（如可以取材），羊水（产前诊断）采集家系应做到尽可能完整患者、同一家系中有相同遗传背景的表型正常的其他个体、该家系中其他遗传背景的成员当前10页，总共79页。收集临床资料病人临床上一系列指标的检测保存相关信息和影象资料病人血清或组织的保存及其酶、病理或免疫学研究当前11页，总共79页。侯选基因的确定当前12页，总共79页。文献检索数据库中的OMIM（OnlineMendelianInheritanceinMan）数据库中整合了目前已定位的单基因病的信息确定自己所研究家系的可能已知候选基因或已定位的染色体候选区域当前13页，总共79页。根据疾病名称检索当前14页，总共79页。根据基因检索当前15页，总共79页。检索最新文献当前16页，总共79页。确定已知致病基因突变当前17页，总共79页。获得已知基因基因组序列设计引物或参考文献中引物根据文献，采用合适的技术方法进行基因突变分析（在后面课程中详细介绍）从数据库中查阅目的基因的相关信息当前18页，总共79页。

PCR-测序分析MFN2基因结果发现错义突变:c.281

G>A,其所在密码子由CGG变为CAG,导致其编码氨基酸由精氨酸变为谷氨酰胺.结论：经查阅文献资料，c.281

G>A为已知致病突变位点，可判断其为该患者的致病突变位点。

当前19页，总共79页。根据变异导致的结果判断根据突变数据库和文献资料排除已知SNP根据家系共分离与否判断在正常对照人群中分析保守性分析基因功能分析突变分析结果的判断当前20页，总共79页。连锁分析与未知基因的基因定位当前21页，总共79页。

利用被定位的基因与在同一染色体上另一遗传座位相连锁的特点，将该基因定位在某一染色体或染色体某一区带上。连锁分析注：适于分析较大的遗传病家系，不适于散发病例和小家系病例当前22页，总共79页。连锁

重组当前23页，总共79页。遗传标记进行连锁分析时需要的一些已知遗传位点，这些位点应按孟德尔方式遗传，且具有多态性以便显示连锁关系，这些标记位点称为遗传标记RFLP，STR,SNP当前24页，总共79页。连锁分析结果当前25页，总共79页。连锁分析结果当前26页，总共79页。基因定位：将致病基因确定到染色体的实际位置未知致病基因定位克隆研究基因克隆：确定致病基因当前27页，总共79页。定位克隆基本方法和步骤收集家系，选择遗传标记进行连锁分析，对目的基因作图定位确定候选位置，对目的基因进行精细定位从候选基因中确定正确的基因（二代测序技术）当前28页，总共79页。例：一个X连锁肌肉病家系致病基因的定位克隆研究

当前29页，总共79页。家系情况及前期研究基础先证者Ⅲ2临床表现近似DMD排除了DMD/EMD/FHL1基因突变当前30页，总共79页。研究策略全基因组90万个SNP位点；8例样本；商业公司完成选取数个SNP点；增加3个成员连锁区域内的基因：MapViewer；基因表达：UniGene数据库及HGNC网站；基因功能：OMIM数据库1例样本(I2)；商业公司完成当前31页，总共79页。SNP芯片数据分析

连锁分析提示X染色体有三段连锁区域：当前32页，总共79页。单体型分析当前33页，总共79页。

GenemaplocusGRCh37.p5PrimaryAssembly(STS)Physicaldistance(Mb)GeneticDistance(cM)GeneticMap(Marshfield)(cM)

Xp22.32-p22.25,761,897-12,538,7316.785.0715.42-20.49

Xp21.2-p21.131,289,217-32,011,2660.720.5733.05-33.62

Xq24-q27.2117,088,056-140,038,59422.9515.2670.80-86.06三段连锁区域当前34页，总共79页。精细定位分析将连锁区域由6.78Mb缩短为4.18Mb

当前35页，总共79页。排除连锁区域当前36页，总共79页。肯定Xq24-q27.2连锁区域当前37页，总共79页。最终确定两段连锁区域GenemaplocusGRCh37.p5PrimaryAssembly(STS)Physicaldistance(Mb)GeneticDistance(cM)Marshfield(cM)Xp22.32-p22.25,761,897-9,946,6564.182.1015.42-17.52Xq24-q27.2117,088,056-140,038,59422.9515.2670.80-86.06

当前38页，总共79页。连锁区域内包含的基因连锁区域共28个基因：14个已知基因,14个预测基因14个已知基因：6个基因在肌肉组织中表达（3个基因表型已知，均与肌肉病无关）7个基因不在肌肉组织表达1个基因表达情况未知

当前39页，总共79页。Xq24-q27.2连锁区域共272个基因：122个已知基因,150个未知基因122个已知基因：79个基因在肌肉组织中表达（18个基因表型已知，其中包括前期已经排除的FHL1基因）41个基因不在肌肉组织表达2个基因表达情况不清楚

当前40页，总共79页。外显子组测序平均覆盖度：23.8×；覆盖度大于>20×位点占53.7%在上述两个连锁区域测序深度均很低对测序深度>20的变异位点进行验证，结果均无变异当前41页，总共79页。存在的问题及解决办法本家系患者未进行肌肉活检将进行多个样本的外显子组测序当前42页，总共79页。Genotype和Phenotype相关性研究当前43页，总共79页。例：非综合征型先天缺牙的分子遗传学研究

JDentRes,2009;88:126-131EurJMedGenet,2008;51:536-546EurJMedGenet,2011;54:377-382当前44页，总共79页。单基因遗传病发病机制的研究当前45页，总共79页。——隐性突变往往导致失去功能（lossoffunction）——显性突变可导致获得功能（gainoffunction）和失去功能失去功能：单倍剂量不足（halpoinsufficency）获得功能：显性负效应（dominantnegtive）

隐性突变和显性突变的致病机制当前46页，总共79页。Gainoffunction：

Loricrin基因突变获得核转位的新功能

BrJDermatol,2008;159:714-719

当前47页，总共79页。Loricrin角皮病当前48页，总共79页。连锁分析与1q21区域连锁当前49页，总共79页。发现Loricrin基因新突变当前50页，总共79页。特殊的临床表现当前51页，总共79页。突变蛋白序列新功能的预测当前52页，总共79页。GFP表达载体的构建当前53页，总共79页。细胞亚定位分析当前54页，总共79页。动物模型过表达和基因敲除小鼠模型均表现正常表型转基因小鼠表现出与人类疾病相似的疾病表型，提示突变基因获得功能为其发病机制。当前55页，总共79页。基因敲除小鼠表型基本正常当前56页，总共79页。转基因小鼠表型与人类疾病相似当前57页，总共79页。结论

Loricrin基因突变可引起新的疾病表型Loricrin突变蛋白获得新功能，通过其核定位信号介导了突变蛋白的核转位当前58页，总共79页。Haploinsufficiency：

PAX6基因单倍剂量不足影响胰岛素成熟过程导致糖耐受异常

Diabetologia.2009;52:504-13当前59页，总共79页。先天性无虹膜家系当前60页，总共79页。在该家系发现

PAX6突变(c.1080C>T)导致单倍剂量不足

SSCPanalysis

DNAsequencing

当前61页，总共79页。Tonetal.Cell67,1991PAX6

基因及其cDNA当前62页，总共79页。Essentialforthedevelopmentoftheeye&brain

homozygous

mutants—noeyes,nobrain,die

heterozygousmutants—smalleyesinmiceaniridiainhumansEssentialforthedevelopmentofpancreas

homozygous

mutants—abnormalpancreaticstructurePAX6的功能Hilletal.Nature354,1991;St-Ongeetal.Nature387,1997;Sanderetal.GenesDev11,1997当前63页，总共79页。PAX6在胰腺发育中的功能Mansourietal.TEM10,1999Dohrmannetal.MechDev92,2000当前64页，总共79页。

PAX6在成体胰腺中的功能Homozygousmicewithconditionalk/oPAX6inthepancreascauseddiabetes

FouraniridiapatientswithPAX6mutationswerereportedtosufferfromglucoseintolerance

Ashery-Padanetal.DevBiol269,2004Yasudaetal.Diabetes51,2002

当前65页，总共79页。假说PAX6mutation?abnormalglucosehomeostasis当前66页，总共79页。OGTTAnalysisintheAniridiaPedigreeIDAgeBMI(kgm-2)Glucoselevels(mmolL-1)ClinicalstatusAniridiaGenotype0’120’

Ⅱ-6Ⅱ-7Ⅲ-2Ⅲ-3Ⅲ-5Ⅲ-6Ⅲ-8Ⅲ-9Ⅲ-10Ⅲ-11Ⅲ-13706850434133304038363217.5820.2217.8820.8621.1520.4220.9920.4320.9622.9320.834.554.084.865.253.694.274.916.055.277.744.668.0412.9911.418.657.806.625.8814.579.7815.617.31IGTDDIGTIGTNGTNGTDIGTDIGT+++++++++++m/Nm/Nm/Nm/Nm/Nm/Nm/Nm/Nm/Nm/Nm/NⅣ-1Ⅳ-2Ⅳ-5Ⅳ-7Ⅳ-9171811161419.4120.3315.2819.4116.194.173.984.725.144.587.956.855.666.217.07IGTNGTNGTNGTNGT+

++++m/Nm/Nm/Nm/Nm/NⅢ-15Ⅲ-16Ⅲ-17Ⅲ-18Ⅲ-19Ⅳ-3Ⅳ-4Ⅳ-6Ⅳ-84138343330151171219.9321.1922.3020.4322.8317.3115.4215.0616.544.414.894.254.014.384.155.244.814.716.765.335.036.006.635.485.086.186.23NGTNGTNGTNGTNGTNGTNGTNGTNGT---------N/NN/NN/NN/NN/NN/NN/NN/NN/N当前67页，总共79页。血糖和胰岛素水平当前68页，总共79页。总结1AniridiacausedbyPAX6genemutationPAX6mutationcausedimpairedglucosetolerance(IGT)PAX6-relatedIGTwasassociatedwithage当前69页，总共79页。问题DoesIGTcomefromdeficiencyofinsulin?Dothesepatientshaveinsulinresistance?Dopatientshave