抗原抗体知识

抗原(antigen,Ag)■-抗原的概念：凡是在机体内引起体液免疫和(或)细胞免疫反应的物质，称为抗原。抗原具有两个方面的特性：-免疫原性：引起机体产生抗体和(或)致敏淋细胞的特性；-免疫反应性:抗原能与相应的抗体及致敏淋巴细胞发生特异的结合或反应的特性。■-根据抗原是否显示免疫原性分为：-完全抗原：分子量较大，一般在10kDa以上，并具有较复杂的化学组成。•免疫原性最强的是蛋白质抗原，多糖次之；脂类和核酸必需和蛋白质及多糖形成复合物才具有良好的免疫原性。-半抗原：又称为不完全抗原，分子量较小。例如：某些短肽、多糖、类脂和药物等。•半抗原必需与载体结合，才能获得免疫原性。载体■-通常是具有高度免疫原性的大分子物质，具有将免疫原性传递给偶联的半抗原能力。-常用的载体有钥孔血蓝蛋白(keyholelimpethemocyanin，KLH)、牛血清白蛋白(bovineserumalbumin,BSA)、卵白蛋白(Ovalbumin，OVA)等。-用戊二醛或碳化二亚胺作为交联剂通过功能基团-NH2、-COOH等将半抗原结合到载体上。结合比例为5kDa结合5〜25个分子的小肽。(三)抗体(antibody,Ab)1、抗体的概念：■-机体受到抗原刺激后，由浆细胞合成并分泌出一类具有与抗原发生特异性结合的球蛋白，被称为抗体。-抗体主要存在于血清内；-抗体都是免疫球蛋白，但免疫球蛋白并不一定都是抗体。-免疫球蛋白根据重链的结构及抗原特异性不同分为五种，既IgG、IgD、IgE、IgA、IgM。2、免疫组化实验中常用的抗体：单克隆抗体和多克隆抗体。■-单克隆抗体：是一个B淋巴细胞克隆分泌的抗体，是应用细胞融合杂交瘤技术免疫动物制备的。-特异性强、抗体产量高。■-多克隆抗体：是将纯化后的抗原直接免疫动物后，从动物血中所获得的免疫血清，是多个B淋巴细胞克隆所产生的抗体混合物。-特异性低，会产生抗体的交叉反应。-多克隆抗体广泛应用于石蜡包埋组织切片，可减少假阴性染色机会。-抗原与抗体的结合，要求量保持一定比例，当抗原或抗体过量时，是不能聚合成大颗粒。3、抗体的制备——多克隆抗体的制备■-动物的选择..佐剂(adjuvant)■-免疫方法"免疫剂量■-抗体效价的测定■-放血或定期抽血(1)动物的选择选择什么动物来免疫取决于：■-所需抗血清的量-小鼠只能提供1.0〜1.5ml的血液，而山羊能提供几升。.•能供免疫用的抗原量-小鼠50mg足够，而山羊需要几毫克。动物的选择(续)■-动物的品系：免疫动物与提供抗原的动物之间的种系差异越大越好。-例如哺乳动物的抗原可选择非哺乳动物来制备抗体。-常用的动物有兔、羊、马、猪等，以兔新西兰兔，年轻，健壮，体重在2.5kg左右，雄性)为最常用。佐剂(adjuvant)"一般可溶性抗原注射后，迅速从注射部位扩散、吸收代谢。佐剂可延长潴留时间，且延长免疫刺激作用。因此在制备抗体的过程中，常将抗原和佐剂一起注射。■-最常用的佐剂是弗氏佐剂，又分为：-弗氏不完全佐剂(Freund'sincompleteadjuvant)-弗氏完全佐剂(Freund'scompleteadjuvant)弗氏不完全佐剂(Freund'sincompleteadjuvant,FIA)■-是由油剂(石蜡油或植物油)与乳化剂(羊毛脂或Tween80)混合而成，比例为1:1、2:1、3:1或5:1，可根据需要而定，通常2:1。..使用时与水溶性抗原按1:1比例充分混合，使抗原分散在佐剂中形成油包水乳剂。弗氏完全佐剂(Freund'scompleteadjuvant,FCA)■-在弗氏不完全佐剂中加入活卡介苗或死的结核分枝杆菌(终浓度为2〜20mg/ml)，即成为FCA。■-免疫动物时，将弗氏佐剂与抗原按体积1:1混合乳化后(油包水)注入动物。-一般首次注射时用完全佐剂乳化，第二次或第三次注射时用不完全佐剂或不用佐剂。佐剂与抗原乳化的方法■-研磨法：适于制备大量的佐剂抗原-先将不完全佐剂加热，取1.73ml放人无菌玻璃研钵内；缓缓滴入0.23ml活卡介苗，边滴边按同一方向研磨，使菌体完全分散。-按同样方法滴人抗原，每加一滴应研磨至小滴消失。滴加抗原的速度要慢，待抗原全部加人后，应成为乳白色粘稠的油包水乳剂。■-缺点：研钵壁上粘附大量乳剂，抗原损失较大，对微量或难得抗原不宜采用。佐剂与抗原乳化的方法(续).•注射器混合法-将等量的完全佐剂和抗原分别吸人两个5ml注射器内，然后插入三通管内，交替推动针管混匀，往复操作直至形成粘稠的乳剂为止。..优点：无菌操作，节省抗原或佐剂。■-缺点：不易乳化，时间长。佐剂与抗原乳化的方法（续）.•快速乳化法：利用超声波粉碎器可快速乳化抗原和佐剂混合物。-将抗原和佐剂按所需量加入一离心管中，置于超声波粉碎器上，粉碎头浸入液面下0.5cm，离瓶底0.5cm左右，以免打碎离心管。-每次乳化10〜15s，然后置冰箱lmin左右。反复乳化3〜4次即可完全乳化。管内残余量800r/min离心5〜10min收集。.•优点：简单、快速、节省材料。乳化剂的鉴定■-判断乳化是否充分，可将一滴乳化好的液体滴在水面上（冷水中），如能长时间保持圆珠形而不散开，表示乳化达到要求。（3）免疫方法一一免疫途径■-常有静脉、腹腔、肌肉、皮下、皮内、淋巴结、脚掌等注射。■一般采用多点注射方法-常在足、掌、腋窝淋巴结周围、背部两侧、颌下、耳后等处的皮内或皮下。-皮内易引起细胞免疫反应，有利于提高抗体的效价。（3）免疫方法一一免疫途径（续）■-几点说明：-大动物一般不用腹腔注射-颗粒抗原和使用佐剂时不能静脉注射-抗原宝贵可采用淋巴结内微量注射法，只需10〜100mg抗原即可获得较好的免疫效果。-皮内注射较困难，特别是天冷时更难注入。（3）免疫方法一一次数及间隔时间"次数一般为2〜3次（初次免疫和加强免疫）-首次注射后，10〜15天再加强注射；-剂量同首次或为首次的一半，用不全佐剂或不用佐剂。■间隔时间，一般而言，动物越大，间隔越长-豚鼠、大鼠为7〜8天，兔子为10〜15天，羊为14〜28天；-第三次注射的间隔时间更长些，效果更好。举例1：家兔的免疫"初次免疫-用50〜200mgAg加入FCA，在背部皮下注射6〜8点，每点0.1〜0.2ml，也可肌肉内或皮内注射；■-两周后，加强免疫-将50〜200mgAg于PBS或FIA中，在肌肉、皮下、静脉或腹腔内注射；■-抗体效价的检测：加强免疫一周后，耳缘静脉采血-抗体效价测定可用环状沉淀试验、琼脂双向扩散法等方法。前者抗体效价在1:4000以上，后者在1:16以上，即可采血，取血清进一步提纯。举例2：微量抗原淋巴结内注射免疫家兔■-一般选择2.5〜3.0kg的新西兰种公兔-先在其两脚垫注射完全福氏佐剂0.2ml（卡介苗每兔合5mg）；-10天后，见胭窝淋巴结肿大，然后将抗原注射全肿大的淋巴结内，第一次注射抗原用完全福氏佐剂混合乳化；-以后每隔20天用不完全福氏佐剂乳化抗原，以同样方法加强2次，各次注射的抗原均为25〜50mg；-末次注射两周后兔耳放血测价(可达1:128)。举例3：豚鼠和大鼠的免疫"初次免疫-用10〜100mgAg加入FCA,在背部皮内注射4〜6点，每点0.lml,也可肌肉内或皮下注射；"加强免疫-每隔7〜8天，将10〜50mgAg于PBS或FIA中。在肌肉、皮下或静脉注射;■-抗体效价的检测(4)免疫剂量■-抗原性强的抗原量应小，过大反会引起免疫抑制；■-免疫周期长的动物可少