DB15-T 2905-2023羊副流感病毒3型检测技术规范

ICS11.220CCSICS11.220CCSB41内蒙古自治区地方标准DB15/T2905—2023羊副流感病毒3型检测技术规范Technicalspecificationfordiagnosticofcapineparainfluenzavirustype32023-03-102023-03-102023-04-10内蒙古自治区市场监督管理局发布前 言本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。本文件由内蒙古自治区畜牧业标准化技术委员会（SAM/TC19）归口。羊副流感病毒3型检测技术规范范围本文件规定了绵羊、山羊副流感3型的临床诊断、病原分离、RT-PCR、ELISA方法的诊断技术要求。本文件适用羊饲养场（户）和动物疫病检疫、诊疗单位对羊副流感病毒3型的检测。（GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范下列术语和定义适用于本文件。下列术语和定义适用于本文件。羊副流感病毒3型caprineParainfluenzavirustype3，CPIV3属于副黏病毒科，呼吸道病毒属成员，为有囊膜的单股负链RNA病毒（见附录A中图A.1）。4临床诊断感染羊主要临床症状表现为发热（体温≥40℃）、呼吸困难、流浆液性或黏脓性鼻液和咳嗽等呼吸道症状。病理剖检可见肺部实变。5实验室诊断牛肾细胞系（MDBK细胞系）、棉签、FBS、DMEM培养基、青霉素、链霉素、细胞培养板。仪器电子天平、研磨仪、台式冷冻离心机、生物安全柜、CO2培养箱、倒置显微镜、冰箱。鼻拭子用无菌棉签刮取鼻道分泌物，然后放入3mL～5mL含1000IU/mL青霉素1000µg/mL链霉素的DMEM培养基的冻存管中，编号，记录，于2℃～8℃条件下保存并尽快送往实验室。血清2mL～52℃～8℃条件下保肺组织疑似因CPIV3感染死亡的羊，按照NY/T541采集肺组织样品，放入离心管，编号，记录，于2℃～8℃条件下保存并尽快送往实验室。拭子将鼻拭子样品液冻融两次，然后以6000r/min离心10min，再使用一次性注射器吸取上清经0.22μm滤膜过滤除菌，-20℃以下保存备用。血清将静置分层的血清转移到灭菌离心管，-20℃以下保存备用。肺组织2×2×3cm1:3～1:57.4）6000r/min离心10min0.22μm-20℃下保存备用。取处理过的样品接种到长满80%的24孔板MDBK细胞，每孔200μL，置于37℃，含5%CO2的培养箱中吸附30min后，加入含2%FBS或NBS的细胞培养液1mL，同时设对照组，置于37℃，5%CO2培养箱，培养3d～5d，逐日观察，记录细胞病变。按上述方法盲传3～5代。（A.2）；当70%～803000r/min105.2RT-PCR移液器、无菌无酶离心管、PCR管、病毒RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、PCR试剂盒、TAE缓冲液、琼脂糖、核酸染料、阳性质粒（阳性对照）、灭菌超纯水（阴性对照）、引物。仪器PCR仪、台式冷冻离心机、微波炉、电泳仪、水平电泳槽、凝胶成像仪。处理后的样品或细胞培养物。RNARNARNART-PCRRT引物CPIV3-F/CPIV3-R按照附录A.3DEPC10µmol/L。20μL1μL，dNTPMixture1μL，模板RNA2μL，RNaseFreedH2O6μL。655min后，转至冰上迅速冷却。在上述Microtube管加5×PrimeScriptIIBuffer4μL，RNaseInhibitor(40U/μL)0.5μL(20U)，PrimeScriptIIRTase(200U/μL)1μL，RNaseFreedH2O4.5μL4245min，955minPCRPremix溶液12.5µL，上下游引物各0.5µL，cDNA模板2µL，RNaseFreedH2O9.5µL。5.2.5.2.2反应条件5.2.5.2.2反应条件95℃预变性5min,95℃30s，50℃30s，72℃60s，进行35个循环，72℃延伸10min。PCR取PCR产物10µL，在1.5%琼脂糖凝胶中电泳，电压100V，时间30min，电泳结束后，在凝胶成像系统中观察结果。当阳性对照样品出现400bp扩增带、阴性对照样品无扩增带出现时，试验结果成立。被检样品出现400bp扩增带为羊副流感病毒阳性，否则为阴性（见附录A中图A.2）。ELISACPIV3重组NTMBBGB/T6682仪器水浴锅、温箱、洗板机、微量振荡器、酶标仪、移液器。将CPIV3N0.05100μL96℃包被16h。洗板甩掉孔内的包被液，以洗涤液洗涤三次，用量为200µL/孔。封闭每孔加封闭液，用量为200µL/孔，置37℃封闭1h,洗涤三次。加样200100371h每孔加入用封闭液稀释至工作浓度的酶标记抗体100µL，置37℃再孵育1h，洗涤三次。加入显色底物（TMB）溶液100µL/孔，置37℃避光反应15min。加入终止液50µL/孔,混匀后即刻测量OD加入终止液50µL/孔,混匀后即刻测量OD450值。5.3.4结果判定P/N比法：被检样品(P)的吸光度值和阴性对照样品(N)值之比。P/N≤1.50 2.0＞P/N＞1.50 P/N≥2.0 6综合判定4CPIV35.15.2CPIV33型感染。5.3CPIV33附录A（）3型（Caprineparainfluenzavirustype3，CPIV3）RNACPIV3340℃）CPIV3CPIV3病变示意图见图A.1。注：图A：正常MDBKB：CPIV3感染MDBK图A.1CPIV3PCRPCR引物序列见表A.1表A.1PCR引物序列(5’-3’)位置目的片段参考毒株CPIV3-FCATTGAATTCATACTCAGCAC1-400400bpAF035681.1CPIV3-RAGATTGTCGCATTTRCCTC上下游引物用无菌的DEPC处理水配制成10µmol/L。CPCRCATTGAATTCATACTCAGCACAGATACCCAAGAAAGTCCAATCAACGATGACGGAATCACAGCCGGAGAAACAAAACTTAGCTCAACAATCTTCCAAACAGAGTCCCAAGCAGCCAAAATATACAGGGAAAATAGTGGATCAATTGACCAAGATAGATGGGCTAGGCCATCATACAAATATACCACAAAAACAGAAAATAGAGATGTTGATCAAGAGGTTATACAGAGAGGAGATAGGCGAAGAAGCAGCGCAAGTGGTGGAACTAAGATTATGGGCGATGGAAGGGTCTCCAGAAGCAGCACGGATCCTAGCCATGGATCCCAAGTCCAGGAGGGTACTGATAACAATGAAATTGGAGAGATGGATACGAACTCTCCTCAGAGGTAAATGCGACAATCT电泳结果见图A.2。注：M：DL2000；1：阴性对照；2：阳性对照。图A.2PCR附录B（规范性）试剂的配制（0.05mol/LpH9.6）碳酸钠 0.318g碳酸钠 0.588