微生物培养与检验-微生物菌种保藏

微生物菌种保藏获得微生物的纯培养后，该如何保存呢？微生物菌种保藏P92内容二、菌种保藏的目的三、菌种保藏的原理四、菌种保藏的方法一、为什么要进行菌种保藏一、为什么要进行菌种保藏请大家回顾微生物的特点：体积小，面积大吸收多，转化快生长旺，繁殖快适应强，易变异分布广，种类多吸收多，转化快积极活动的大肠杆菌，每小时能消耗它体重2000倍的乳糖；人呢？500年（400斤/年）繁殖速、转化快： 大肠杆菌重量10-12g，一般每20分钟即可分裂一次；加入给予充足的食物，那么长多久能达到1mg？24h以后能达到多重？

适应强，易变异

菌种衰退（degeneration）：指由于自发突变的结果，使某物种原有的一系列生物学性状发生量变或质变的现象。

纯菌种自发突变突变个体传代增殖原始个体不纯菌种衰退菌种微生物个体微小，代谢活跃，生长繁殖快，如果保存不妥容易发生变异，或被其他微生物污染，甚至导致细胞死亡。二、菌种保藏的目的1.节约试剂与时间2.在一定时间内不死3.不被其他微生物污染4.不会因发生变异而丢失重要的生物学特性三、菌种保藏的原理因此在保藏过程中，必须使微生物的代谢处于最不活跃或相对静止的状态，才能在一定的时间内使其不发生变异而又保持生活能力。菌种保藏要求各保藏管理中心所保藏的菌种，必须具有该菌种的详细历史及有关实验资料。并对其所负责保藏的菌种均应采取妥善、可靠的方法保藏，避免菌种的污染或死亡。

《中国微生物菌种保藏管理条例》

1986年菌种保藏的原理首先应该挑选典型菌种的优良纯种来进行保藏，最好保藏它们的休眠体，如分生孢子、芽孢等。其次应人为地创造环境条件（如：干燥、低温、缺氧、避光、缺乏营养），使微生物长期处于代谢不活泼、生长繁殖受抑制的休眠状态。尽可能多的采用不同的手段保藏一些比较重要的微生物菌株

斜面低温保藏法石蜡油封藏法甘油悬液保藏法液氮超低温保藏法冷冻真空干燥保藏法砂土管保藏法麸皮保藏法宿主保藏法低温定期移植法冷冻保藏法干燥保藏法（一）低温定期移植法将菌种定期在新鲜琼脂培养基上传代，然后在一定的温度下生长和保存的传代保存方法简单、经济，无需任何特殊设备；但易发生培养基干枯、菌体自溶和基因突变等1、斜面低温保藏法－－常用保藏法

将菌种接种在适宜的斜面培养基上，待菌种生长完全后，置于4℃左右的冰箱中保藏，每隔一定时间（保藏期）再转接至新的斜面培养基上，生长后继续保藏，如此连续不断。适用于各大类微生物菌种的短期保藏;此法的主要保藏措施是低温。一般可保存1～6个月左右。优点是简便易行，容易推广，存活率高；缺点是菌株仍有一定程度的代谢活动能力，保藏期短，传代次数多，菌种较易发生变异和被污染。2、石蜡油封藏法

无菌条件下将灭过菌并已蒸发掉水分的液体石蜡倒入培养成熟的菌种斜面（或半固体穿刺培养物）上，石蜡油层高出斜面顶端1cm，使培养物与空气隔绝，加胶塞并用固体石蜡封口后，垂直放在室温或4℃冰箱内保藏此法广泛适用于各大类微生物菌种的中期保藏，不适用于保藏某些能分解烃类的菌种。此法的主要保藏措施是低温、阻氧。一般可保存1～2年左右。（二）冷冻保藏法冷冻时微生物代谢活动停止，一般来说，冷冻温度越低，效果越好。通常加入一定的冷冻保护剂3、甘油悬液保藏法此法是将菌种悬浮在甘油蒸馏水中，置于低温下保藏，本法较简便，但需置备低温冰箱。保藏温度若采用－20℃，保藏期约为0.5～1年，而采用－70℃，保藏期可达10年。将拟保藏菌种对数期的培养液直接与经121℃蒸汽灭菌20min的甘油混合，并使甘油的终浓度在10％～15％，再分装于小离心管中，置低温冰箱中保藏。基因工程菌常采用本法保藏。4、液氮超低温保藏法以甘油、二甲基亚砜等作为保护剂，在液氮超低温（－196℃）下保藏的方法。适用于各种微生物菌种的保藏。此法的主要保藏措施是超低温、有保护剂，保藏期一般可达到15年以上，是目前公认的最有效的菌种长期保藏技术之一。此法的优点是操作简便、高效，且可使用各种培养形式的微生物进行保藏。其缺点是需购置超低温液氮设备，且液氮消耗较多，操作费用较高。（三）干燥保藏法使生长合适的微生物吸附在一定的载体上进行干燥常用的载体有砂土、麸皮、滤纸等5、冷冻真空干燥保藏法基本方法：减压条件下使冻结的细胞悬液中的水分升华，使培养物干燥。冷冻干燥过程中必须使用冷冻保护剂，国内常用脱脂乳和蔗糖是菌种长期保藏的最为有效的方法之一，大部分微生物菌种可保藏10年；且经冻干后的菌株无需进行冷冻保藏，便于运输此法适用于各大类微生物。该法操作比较烦琐，技术要求较高，且需要冻干机等设备。6、砂土管保藏法

该法是将砂与土分别洗净、烘干、过筛，按一定比例分装于小试管中，砂土的高度约1cm，121℃蒸汽灭菌1～1.5h，间歇灭菌3次。50℃烘干后经检查无误后备用。将待保藏的菌株制成菌悬液或孢子悬液滴入砂土管中，放线菌和霉菌也可直接刮下孢子与载体混匀，而后置于干燥器中抽真空约2～4h，用火焰熔封管口(或用石蜡封口)，置于干燥器中，在室温或4℃冰箱内保藏。一种常用的长期保藏菌种的方法，适用于产孢子的微生物及形成芽孢的细菌，对于一些对干燥敏感的细菌及酵母则不适用。

砂土管法兼具低温、干燥、隔氧和无营养物等条件，故保藏期较长、效果较好，且微生物移接方便，经济简便。它的保藏期约1～10年。7、宿主保藏法此法适用于专性活细胞寄生微生物（如病毒、立克次氏体等）。植物病毒可用植物幼叶的汁液与病毒混合，冷冻或干燥保存。噬菌体可以经过细菌培养扩大后，与培养基混合直接保存。动物病毒可直接用病毒感染适宜的脏器或体液，然后分装于试管中密封，低温保存。在上述的菌种保藏方法中，以斜面低温保藏法、石蜡油封藏法、宿主保藏法最为简便；砂土管保藏法、麸皮保藏法和甘油悬液保藏法次之；以冷冻真空干燥保藏法和液氮超低温保藏法最为复杂，但其保藏效果最好。应用时，可根据实际需要选用。国际著名微生物菌种保藏机构ATCC：美国典型培养物保藏中心NRRL：美国农业部北方地区研究实验室NCTC：英国国家典型培养物保藏所CBS：荷兰真菌中心保藏所IFO：日本大阪发酵研究所

中国微生物菌种保藏机构CGMCC：中国普通微生物菌种保藏管理中心ACCC：中国农业微生物菌种保藏管理中心CICC：中国工业微生物菌种保藏管理中心CCTCC：中国典型培养物保藏中心菌种的复壮

一、菌种的复壮

狭义的复壮－－消极的措施指在菌种已经发生衰退的情况下，通过纯种分离和测定典型性状、生产性能等指标，从已衰退的群体中筛选出少数尚未退化的个体，以达到恢复原菌株固有性状的相应措施。

广义的复壮－－积极的措施指在菌种的典型特征或生产性状尚未衰退前，就经常有意识地采取纯种分离和生产性状测定工作，以期从中选择到自发的正突变个体。菌种复壮的主要方法1、纯种分离法

菌落纯（“菌种纯”）细胞纯（“菌株纯”）

通过纯种分离,可将衰退菌种细胞群体中一部分仍保持原有典型性状的单细胞分离出来,经扩大培养,就可恢复原菌株的典型性状。平板表面涂布法平板划线分离法琼脂培养基浇注法用分离小室进行单细胞分离用显微操作器进行单细胞分离菌丝尖端切割进行单细胞分离2、宿主体内复壮法