蛋白质分分离纯化和表征3

等电点（pI）:在特定pH条件下，某种蛋白质分子所带正负电荷相等，静电荷为零，这一pH称为该蛋白质的等电点（pI）。几种蛋白质等电点当前1页，总共36页。等电pH并不是一个恒定的值，它会因溶液中盐的种类和离子强度的影响而有所不同。

等离子点(isoionicpiont):

蛋白质在纯水溶液中的带电状态则没有其他离子干扰，完全由H+的解离和结合来决定，这种条件下的等电点称为等离子点。等离子点是蛋白质的特征性常数。当前2页，总共36页。二、蛋白质的分子大小与分子量的测定蛋白质的分子量的范围：6×103～1×106Da。当前3页，总共36页。（一）根据化学组成测定最低相对分子量用化学分析方法测出蛋白质中某一微量元素的含量。并假设蛋白质分子中含有一个被测元素的原子，则可由此计算出蛋白质的最低分子量。

例：肌红蛋白和血红蛋白含铁量均为0.335%,计算二者的相对分子质量。

最低相对分子量＝x100=铁的百分含量铁的原子量0.33555.8x100=16700测定蛋白质相对分子量的原理和方法也可以利用蛋白质中含量特少的aa，用同样的原理计算蛋白质的最低分子量。当前4页，总共36页。（二）渗透压法测定相对分子量渗透压法测定Mr操作简单，Mr在10-100kDa时较准，但不能区别蛋白质分子是否均一。渗透压公式：Mr

=RTlimc→0πc(c=质量浓度，g/mol)当前5页，总共36页。（三）沉降分析测定Mr在强大的离心场中，如果蛋白质溶液的密度大于溶液密度，溶液中的蛋白质会发生沉降。沉降速度决定于蛋白质的分子量、分子密度、分子形状和溶剂的密度、粘度。

沉降系数（Ｓ20,w）：单位离心场强度时的沉降速度。定义1Ｓ＝10-13秒（斯维得贝格单位）沉降速度法沉降平衡法当前6页，总共36页。（四）凝胶过滤法测定Mr凝胶过滤（层析）可按照蛋白质分子量大小进行分离的技术，同时可以测定蛋白质分子量。蛋白质通过凝胶柱的速度即洗脱体积与其分子量有关:先测得几种标准蛋白质的Ve（Ve为洗脱体积），并以其分子量对数对Ve作图得一直线，再测出待测样品的Ve，查标准曲线即可确定分子量，并以其分子量对数对Ve作图得一直线，再测出待测样品的Ve，查标准曲线即可确定分子量。LogMABCLogM测V测当前7页，总共36页。（五）SDS法测定Mr聚丙烯酰胺凝胶电泳具有较高分辨率，用它分离、检测蛋白质混合样品，主要是根据各蛋白质各组分的电泳迁移率的不同。这种差异就蛋白质分子本身而言，主要与其所带净电荷以及分子量和形状有关。当电泳体系中含有一定浓度的十二烷基硫酸钠（SDS）时，则得电泳迁移率的大小只取决于蛋白质的分子量，从而可直接由电泳迁移率推算出蛋白质的分子量。

当前8页，总共36页。聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS）0.51.0kD33022067603618.5kD9467433020.114.4MolmasskD30020010080605040302010Migration(Rf)Pharmacia:MolecularMarkersforelectrophoresis当前9页，总共36页。1．蛋白质胶体溶液的稳定性蛋白质颗粒大小属于胶体粒子的范围(1-100nm)。又由于其分子表面有许多极性基团，亲水性极强，易溶于水成为稳定的亲水胶体溶液。蛋白质亲水胶体的稳定性主要取决于两个因素：双电层水化层a.丁达尔效应

b.布朗运动

c.不能透过半透膜三、胶体性质与蛋白质的沉淀当前10页，总共36页。2．蛋白质的沉淀蛋白质胶体溶液的稳定性是有条件的，相对的。假若改变环境条件，破坏其水化膜和双电层，蛋白质亲水胶体便失去稳定性，发生絮结沉淀现象，这既是所谓的蛋白质沉淀作用。①盐析法（saltingout）：中性盐（NH4SO4，NaSO4，NaCl等）→蛋白质脱去水化层。

优点：不引起蛋白质变性。盐溶（saltingin）：稀盐溶液中蛋白质溶解度增加的现象。当前11页，总共36页。②有机溶剂沉淀法：极性有机溶剂（甲醇，乙醇，丙酮）→脱去水化层以及降低介电常数而增加带电质点间的相互作用。

条件：低温操作，缩短时间。

③重金属盐沉淀法：

当溶液pH>pI,蛋白质颗粒带负电荷,易与重金属离子(Hg2+,Pb2+,Cu2+,Ag+等)→生成沉淀。

④生物碱试剂和某些酸类沉淀法：

生物碱试剂—能引起生物碱沉淀的一类试剂。当溶液pH<pI时,蛋白质颗粒带正电荷→易与生物碱试剂,酸根负离子反应→沉淀

用途：临床除去体液中干扰测定的蛋白质当前12页，总共36页。⑤加热变性测定法原因：加热变性使蛋白质天然结构解体，疏水基外露，损坏了水化层

用途：制豆腐（加热+少量盐卤）当前13页，总共36页。1.定义：在某些物理或化学因素作用下，天然蛋白质严密的空间结构被破坏，从而导致理化性质改变和生物学活性的丧失（如酶失去催化活力，激素丧失活性），则称之为蛋白质变性作用(denaturation)

。

有些蛋白质的变性是可逆的，通过适当的方法（如透析）将变性剂除去后，蛋白质可以恢复其天然立体结构，这个过程称为复性（renaturation）。

一般认为蛋白质变性本质是次级键的破坏，只有空间构象的改变，并不涉及一级结构（共价键）的变化。四、蛋白质的变性与复性当前14页，总共36页。当前15页，总共36页。

化学因素：强酸、强碱、有机溶剂、重金属盐、生物碱试剂、尿素等

物理因素：加热、射线、超声波、剧烈震荡等2.变性因素当前16页，总共36页。旋光值改变特性粘度增加溶解度降低扩散系数降低结晶能力丧失易于沉淀，若加热还会凝固。但若远离等电点则不一定沉淀变性后蛋白质肽键暴露而更加易于消化3.变性后蛋白质的表现当前17页，总共36页。变性蛋白质为什么能复性？

在一定的环境条件下，蛋白质的一级结构能够决定二、三、四级结构。变性蛋白质的二、三、四级结构虽然遭到破坏，但是一级结构仍然保持不变，因此除去变性剂后，在适当的环境条件下，蛋白质能卷曲折叠成为能量最低的构象，一般天然蛋白质正是具有这种能量最低的构象。当前18页，总共36页。五、蛋白质分离纯化的一般原则根据分子量：如沉降速度法离心根据密度：沉降平衡法离心根据电荷和分子量：聚丙烯酰胺凝胶电泳根据分子量和分子形状：凝胶过滤根据溶解度：硫酸铵分级沉淀、有机溶剂分级沉淀根据电荷：等电点沉淀当前19页，总共36页。六、蛋白质的分离纯化方法

透析：利用半透膜的选择通透性来纯化象蛋白质这样的大分子物质的过程叫透析。超过滤：是利用压力或离心力，强行使水和其他小分子溶质通过半透膜，而蛋白质分子被截留在膜上，以达到浓缩和脱盐的目的，有时要用切向流过滤法。（一）根据分子大小不同的分离纯化方法当前20页，总共36页。凝胶过滤法

凝胶过滤（层析）是按照蛋白质分子量大小进行分离的技术，又称之凝胶过滤，分子筛层析或排阻层析。凝胶颗粒内部具有多孔网状结构，被分离的混合物流过层析柱时，比凝胶孔径大的分子不能进入凝胶孔内，在凝胶颗粒之间的空隙向下移动，并最先被洗脱出来；比网孔小的分子能不同程度的自由出入凝胶孔内外，在柱内经过的路程较长移动速度较慢，最后被洗脱出来。当前21页，总共36页。当前22页，总共36页。（二）利用溶解度差别的纯化方法影响蛋白质溶解度的外部因素很多，其中主要有：溶液的pH、离子强度、介电常数和温度。溶解度归根结底取决于他们本身的分子结构。等电点沉淀技术：在等电点pH条件下，蛋白质为电中性，其物理性质如导电性、溶解度、黏度、渗透压等都表现为最低值，易发生絮结沉淀。因此，等电点性质常被用于蛋白质的分离制备，被称为等电点沉淀技术。当前23页，总共36页。

盐析：当离子强度增加到足够高时，例如饱和或半饱和的程度，很多蛋白质可以从水溶液中沉淀出来，这种现象称为盐析。有机溶剂分级分离法：引起蛋白质沉淀的主要原因是改变了介质的介电常数。

温度对蛋白质溶解度的影响：0-40℃之间，大部分球状蛋白质的溶解度随温度的升高而增加。当前24页，总共36页。（三）根据电荷不同的纯化方法

电泳：在外电场的作用下，带电颗粒向着与其电性相反的电极移动，这种现象称为电泳。原则上按电泳的原理来分，可分为：自由界面电区带电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）三种物理效应：样品的浓缩效应、分子筛效应和电荷效应。当前25页，总共36页。CH2=CHC=ONH2丙烯酰胺N,N’-甲叉双丙烯酰胺CH2=CHC=ONHCH2NHC=O

CH2=CH聚丙烯酰胺CH2-CHC=ONH2CH2-CHC=ONHCH2NHC=O

CH2-CHCH2¯

CHC=ONH2CH2-CHC=ONH2CH2-CHCH2-CHCH2-CHC=ONH2CH2-CHCH2-CH()n()n()m()m当前26页，总共36页。Tris-GlypH=8.3Tris-GlypH=8.3Tris-HClpH=6.8T=3%Tris-HClpH=8.9T=7.5%当前27页，总共36页。聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS）0.51.0kD33022067603618.5kD9467433020.114.4MolmasskD30020010080605040302010Migration(Rf)Pharmacia:MolecularMarkersforelectrophoresis当前28页，总共36页。当前29页，总共36页。此法是利用离子交换树脂作为柱层析支持物，将带有不同电荷的蛋白质进行分离的方法。若选择阳离子交换树脂，则带正电荷的物质与H+发生交换而结合在树脂上。若选择阴离子交换树脂，则带负电荷的物质可与OH-发生交换而结合在树脂上。物质在树脂上结合的牢固程度即亲和力大小有差异，因此选用适当的洗脱液便可将混合物中的组分逐个洗脱下来，达到分离纯化的目的。离子交换：当前30页，总共36页。当前31页，总共36页。（六）亲和层析

亲和层析法就是利用化学方法将可与待分离物质可逆性特异结合的化合物（称配体）连接到某种固相载体上，并将载有配体的固相载体装柱，当待提纯的生物大分子通过此层析柱时，此生物大分子便与载体上的配体特异的结合而留在柱上，其他物质则被冲洗出去。然后再用适当方法使这种生物大分子从配体上分离并洗脱下来，从而达到分离提纯的目的。抗原和抗体激素和受体蛋白凝集素和糖蛋白当前32页，总共36页。配体蛋白质蛋白质和配体复合物交联试剂载体配体载体与配体交联体杂质杂质游离配体当前33页，总共36页。七、蛋白质的含量测定与纯度测定蛋白质的量是研究蛋白质的最基本的一步。溶液中蛋白质的浓度测定方法很多，最早的经典方法是凯氏定氮法，稍后应用较广泛的方法是双缩脲法、福林－酚法和紫外吸收法，近年来大多数人用考马斯亮蓝法。（一）蛋白质的含量测