南农生物分离工程修改生物分离6凝胶课件

第六章

凝胶层析凝胶层析的基本原理凝胶介质的基本性质凝胶层析的基本操作凝胶介质的选用原则分子筛色谱（凝胶过滤）Gelfiltrationchromatography对凝胶过滤介质的要求①亲水性高，表面惰性，即介质与溶质之间不发生任何化学或物理相互作用；②稳定性强，在较宽的pH和离子强度范围以及化学试剂中保持稳定，使用寿命长，③具有一定的孔径分布范围；④机械强度高，允许较高的操作压力（流速）。凝胶特性参数内水体积Vi：孔体积外水体积Vo：颗粒间体积柱床体积VtVt=Vo+Vi+VgVt′=Vi+Vo洗脱体积VeVe=Vo+KdViKd=(Ve-Vo)/ViA：“全排阻”，流经体积VoKd=0C：“全渗入”，流经体积Vo+ViKd=1B：“部分排阻”或Ve=Vo+KdVi0＜Kd＜1Kd=(Ve-Vo)/Vi“排阻系数”或“分配系数”一定规格凝胶，Kd特征常数凝胶特性参数①排阻极限（exclusionlimit）是指不能扩散到凝胶网络内部的最小分子的相对分子质量。例如SephadexG50的排阻极限是30kD。②分级范围（fractionationrange）能被凝胶阻滞并且相互之间可以得到分离的溶质的相对分子质量范围。SephadexG50的分级范围为1.5～30kD。③凝胶粒径凝胶一般为球形，其粒径大小对分离度有重要影响。粒径越小，分离效率越高。凝胶粒径多用筛目或微米表示。软凝胶粒径较大，一般为50～150µm（100～200目），例如，Sepharose和Sephadex凝胶粒径分布为45～165µm。硬凝胶粒径较小，一般为5～50µm。⑤床体积（bedvolume）即1g干燥凝胶溶胀后所占有的体积。SephadexG50的床体积为9～11cm3/g干胶。⑥空隙体积（voidvolume）即V0值。空隙体积可用相对分子质量大于排阻极限的溶质测定，一般使用平均相对分子质量为2000kD的水溶性蓝色葡聚糖（bluedextran）。对于商品化的凝胶过滤介质，厂商的产品目录中一般均给出其凝胶的各种性质，如分级范围、粒径、流速与压力的关系等，可参考使用。GFC的不足之处

①仅根据溶质之间分子量的差别进行分离，分离较慢、需严格控制流速；②经GFC洗脱展开后产品被稀释。因此需要在具有浓缩作用的单元操作（如超滤、离子交换和亲和色谱等）后使用。凝胶的结构和性质葡聚糖系其中SephadexG是最传统的软凝胶过滤介质之一，目前仍被广泛使用。SephadexG是利用葡聚糖（右旋糖酐）交联制备的，交联剂一般采用环氧氯丙烷。Sephadex凝胶按交联度大小，分G10～G200共八种型号。G-10G-15G-25G-50G-75G-100G-150G-200吸水量（g/g干凝胶）1.01.52.55.07.510.015.020.0工作范围（肽与蛋白）D<700<1500<50001500-200003000-700004000-1500005000-3000005000-500000规格编号

间接反映凝胶孔径、渗入限、排阻限

G-50分离限1500-30000G-150：5000-400000

对蛋白、多糖分离范围不同（多糖分子体积比相同M的蛋白大）粒度：直径100-300um粗粒20-80um细粒40-120um中粒保存

湿法：悬浮于水、缓冲液中，0.02%NaN3，0-5℃

干法：乙醇分步处理（20%，40%，60%，80%）脱水收缩，抽滤，60-80℃吹干，室温半缩法：60-70%乙醇悬液，封口，4℃

修饰葡聚糖凝胶亲脂性引入有机基团

SephadexLH-20（羟丙基）（原SephadexG-25）

流动相既可使用缓冲水溶液，也可使用极性有机溶剂氯仿、四氢呋喃，因此适用于非水溶性溶质的凝胶过滤

交联葡聚糖离子交换剂引入CM-，DEAE-，离子交换、分子筛

是由海藻多糖琼脂中分离出来的天然凝胶，常见的有Sepharose（Sepharose2B、4B、6B，数字代表干胶的百分比）

Bio-Gel-A（美国）等

（Bio-Gel-A0.5M、1.5M、5M、15M、50M、150M，数字X106代表排阻限度。骨架各线性分子间以氢键相连，孔径依赖于浓度琼脂糖凝胶

特点：1.化学稳定性差，pH4-92.脱水、干燥、冷冻、有机溶剂、温度高于40℃便融化3.与硼酸形成配合物，孔径变化，避免4.强度低，随凝胶浓度↑而↑，弹性小，调整柱压5.非特异性吸附力＜葡聚糖，I＞0.01mol/l无明显吸附6.分离的M范围大（108），随凝胶浓度↑而↓

架桥琼脂糖凝胶SepharoseCL

1，3-二溴丙醇交联，孔径均匀，孔径大小和分离范围与普通琼脂糖一样，但机械强度↑，热稳定性↑，化学稳定性↑（pH3-14）

多孔玻璃微珠

Bio-Glas500孔径500Å将多孔硅酸盐玻璃加工制得，粉末状，可粘合

特点：化学稳定性高，强度大，耐高压，对糖、蛋白有吸附，用聚乙烯二醇浸泡钝化实验操作凝胶介质的选择将样品中的大分子物质与小分子物质分开，其分离策略是使高分子物质完全被排阻，小分子物质完全渗入凝胶内。类分离一般选用SephadexG-25蛋白脱盐（分子量范围1000-5000）或选用G-50。对于小肽和低分子量的物质的脱盐可选用SephadexG-10、G-15（分子量范围-1500）、Bio-GelP-2或P-4类分离凝胶的预处理

将干胶颗粒悬浮于10倍以上吸液量的蒸馏水或洗脱液中充分溶胀。加热可使溶胀加速，即在沸水浴5小时即可达到凝胶的充分溶胀。加热法既可节省时间又可排气、消毒。商品悬浮液去除保存液、抽滤、洗涤、平衡不需溶胀层析柱的选择

柱比：长度/直径、体积类分离：柱床体积为样品体积5倍或略多柱比5:1-10:1分级分离：25-100倍柱比25-100大柱、长柱流速慢、稀释严重、分辨率高

实验室用的层析柱工业用的层析柱

装柱

1.装柱前，必须用真空干燥器抽尽凝胶中空气，并将凝胶上面过多的溶液倾出。

2.先关闭层析柱出水口，向柱管内加入约1/3柱容积的洗脱液，将凝胶液连续倾入柱中，使其自然沉降，等凝胶沉降约2-3cm后，打开柱的出口，使凝胶继续沉集，装柱完毕，关闭出水口。

不能出现分层、倾斜、气泡

凝胶柱的平衡

通过2-3倍柱床容积的洗脱液使柱床稳定，然后在凝胶表面上放一片滤纸或尼龙滤布，以防加样时凝胶被冲起，并始终保持凝胶上端有一段液体。

上柱样品溶液的体积根据分离要求来确定：进样体积进行组别分离时，样品溶液最大可为柱体积的10%进行分级分离时，样品溶液的体积要小，这样洗脱出的峰形好，蛋白类浓度＜4%洗脱

用水、缓冲液、水-甲醇、水-丙酮、氨水、醋酸温度、流速、柱压、阻力恒定防止非特异性吸附操作压↑流速快，峰宽相当大柱压范围内v=K△P/L相同操作压，编号小，交联度大，颗粒粗，流速大

部分收集器部分收集器返回自动馏分收集仪（进口）再生

重复使用流速下降、板结可反冲，取出漂洗凝胶床的检查和维护使用时间过长、流速过大、柱高过大，流速↓控制操作压：柱进出口液位差凝胶的保存：0.02%叠氮钠或0.002%洗必泰返回蠕动泵核酸蛋白检测仪返回记录仪返回国产柱层析系统伯乐公司（BIO-RAD）柱层析系统注意事项1）各接头不能漏气，连接用的小乳胶管不要有破损。2）装柱要均匀，既不过松，也不过紧，最好在要求的操作压下装柱，流速不宜过快，避免压紧凝胶。3）始终保持柱内液面高于凝胶表面，否则凝胶混入大量气泡，影响液体在柱内的流动。

应用生物大分子溶液的脱盐

用大粒度、高交联度凝胶

使蛋白Kd=0，盐类Kd=1

蛋白脱盐后溶解度降低，吸附或沉淀，用稀盐（易挥发盐）洗脱，真空干燥样品体积＜Vi/3

去热原

SephadexG-25氨基酸Kd=1

热原Kd=0

样品体积＜30%Vt分离纯化

GFC可用于相对分子质量从几百到106数量级的物质的分离纯化。

G-50除去结晶胰岛素中前胰岛素、大分子抗原

G-25除去青霉素中抗原性杂质、致敏、高分子杂质

右图是一例利用高效GFC分离骨髓血清蛋白质的结果。色谱柱：10×300，Superose6洗脱液：0.05mol／L磷酸盐＋0.15mol／LNaCl（pH7.0）流量：0.2ml／min1.IgA高聚体2.IgA二聚体

3.IgA单体4.IgG5.白蛋白相对分子质量的测定在凝胶过滤介质的分级范围内蛋白质的分配系数（或洗脱体积）与相对分子质量的对数成正比，所以GFC可用于未知物质相对分子质量的测定。GFC仅对球形分子的测量精度较高，对分子形状为棒状的物质，测量值将小于实际值。理化性质鉴定已知分子量的标准品

测未知分子量：将样品在同一凝胶柱上，同一条件下层析、洗脱、测保留体积，并查出分子量。此法简便、样品用量少，有一定的实用价值。凝胶柱洗脱体积分子量的对数2.理化性质鉴定绘制标准曲线①凝胶层析技术进行测定主要参数测算

Vo通常占柱床30%Vo、Vi1.重量法

Vt=Vo+Vi+Vg=πd2h/4Vi=gWrg-干胶重量Wr-吸液量/g干胶

Vo=Vt-(Vi+Vg)Vg估算为1㎝3/g干胶2.过柱法

Ve=Vo+KdVi2×106蓝色葡聚糖Kd=0重铬酸钾Kd=1Kd、Kav

Kd=(Ve-Vo)/ViKav=(Ve-V