共聚焦激光扫描荧光显微镜

共聚焦激光扫描荧光显微镜

—基本原理、应用及样本制备原则宋健武汉大学医学院结构生物学研究中心CentreforStructuralBiologyWuhanUniversitySchoolofMedicine什么是共聚焦激光扫描荧光显微镜？

共聚焦激光扫描荧光显微镜（Confocal

LaserScanningFluorescenceMicroscope；LSFM）

以激光作为激发光源，采用光源针孔与检测针孔共轭聚焦技术，对样本进行断层扫描，以获得高分辨率光学切片的荧光显微镜系统共聚焦系统细胞CT

荧光和荧光显微镜一、荧光的基础术语荧光物质：某些物质在特定波长范围内的光线照射下，可发出波长比照射光长的光线—荧光。受激发后能产生荧光的物质称荧光物质或荧光素激发光(EXCITATION)：

能特异性地激发某种荧光素的一定波长范围内的光线称为该荧光素的激发光。激发/吸收光谱；吸收波峰(最大吸收波长)488nm520nm异硫氰酸荧光素(FITC)发射光(EMISSION):

发射光谱；发射波峰(最大发射波长)荧光探针：能产生荧光的特异性生物染料（PI,Dapi)、标有荧光素的特异性蛋白结合物（荧光抗体）自发荧光(AUTOFLUORESCENCE):

组织或细胞中的某些成份受激发时可发出荧光—自发荧光。伊文斯蓝、硼化氢钠处理漂白(BLEACH)：

荧光物质受激发时，其发射荧光的能力逐渐下降并最终丧失—漂白。二、荧光显微镜术的基本原理荧光显微镜激发滤镜：从光源中分滤出一定波长范围的激发光。

带通滤色镜(BP)：有宽、窄带之分。如：BP450-490

长、短通滤色镜组合（LP+KP）：LP450+KP490

双色镜：双色分光镜；反射短波长，透过长波长。阻断滤镜：多为长通滤色镜；LP490紫外蓝绿高压汞灯被荧光探针染色的生物样本激发被标记结构的荧光光学图像光学成像滤镜分光488nm520nmFITC450nm490nm共聚焦激光扫描荧光显微镜基本配置LaserandelectronicControlUnit激光光源及控制装置Computer计算机Confocalscananddetectorunit共聚焦扫描及检测装置Microscope荧光显微镜Anti-vibrationtable防震台LeicaTCSSP-2MPAOBSConfocalSystem共聚焦装置光源针孔检测针孔荧光显微镜光电倍增管步进聚焦电机物镜Bio-Rad

LaserSharp

系统操作，图像处理3-D重建X/Y扫描装置光电倍增管检测针孔光源针孔光源分色镜物镜样本聚集平面共聚焦扫描显微镜光学原理

检测针孔和光源针孔始终聚焦于同一点，使聚焦平面以外被激发的荧光不能进入检测针孔高分辨率的光学切片

激光穿透性强，可对样本进行一定深度光学断层，获得高标准的连续光学切片实现三维重建三维胶原基质培养的血管平滑肌细胞共聚焦激光扫描荧光显微镜应用领域

只要目的结构是用荧光探针标记的，都可用共聚焦激光扫描荧光显微镜观察。

形态学研究：细胞凋亡、中枢神经系的F联系、肿瘤细胞分类……

分子生物学：原位杂交，DNA、RNA定量，DNA损伤修复、外源性基因在真核细胞的表达、定位，荧光能量共振转移大分子构象的改变、受体与配体相互作用……

活细胞动态荧光测量：细胞内Ca++、K+、H+等离子的动态分布及动态定量、荧光漂白恢复细胞连接间的信息沟通……

直接对活组织或整体胚胎观察：单光子共聚焦激光扫描系统的局限性：荧光漂白IntensityBeforebleachAfterbleach90minafterbleach1.荧光漂白恢复(FluorescenceRecoverafterphotobleaching;FRAP)

检测细胞连接间的信息传递2.荧光能量共振转移(FluorescenceResonanceEnergyTransfer)I.荧光能量共振转移:受激态荧光素将其能量向另一个荧光素传递，使后者被激发，这一过程称荧光能量共振转移。能量的提供者叫供体荧光素，能量的接受者叫受体荧光素。供体荧光素受体荧光素1.供体与受体间的距离<10nm或=1-7nm2.供体的发射光谱与受体的吸收光谱有实质性的重叠II.荧光能量共振转移的条件488nm520nm650nm540nm650nm488nm520nm供体荧光素(Cy2)受体荧光素(Cy3)供体荧光素(Cy2)受体荧光素(Cy3)FITC/TRITC,Cy3/Cy5,

BFP/GFPFluorescenceIntensityTime

检测以供体的激发波长的光照射样品,没有共振转移时，只检测到供体的荧光，发生共振转移时，供体的荧光减弱，受体被激发出现荧光。应用

受体与配体的相互作用：亚基的结合与分离

大分子构象的改变LigandCy3Cy5III.常用荧光共振转移探针对3.

绿色荧光蛋白（GFP）

GFP的发现：60年代，Shimomura等首先从水母中分离出一种水母发光蛋白(aequoren)，该蛋白与钙和肠腔素结合后可产生蓝色荧光。然而水母整体提取的颗粒都呈绿色，后经证实在水母体内还存在另外一种发光蛋白即绿色荧光蛋白（greenfluorescentprotein

GFP）。GFP,CFP,BFP,YFP商品化质粒转基因动物:Greenmouse外源基因的报告基因:将外源基因与GFPDNA

相连,可实时监测外源基因的表达.检测细胞能否表达某一基因:将待测基因的启动子与GFPDNA

相连,可实时监测细胞能否表达兴趣基因.GFP-蛋白融合技术:将结构蛋白基因与GFPDNA

相连可实时监测结构蛋白的表达亚细胞结构的形成蓝色荧光

GFP

绿色荧光Ca2+

肠腔素Aequoren+原理:检测游离Ca2+变化的荧光探针多为Ca2+螯合剂，通常不能透过细胞膜，只有与乙酰甲酯(AM)相连方可进入细胞内,被细胞内酯酶水解后方能与胞内游离钙结合后发出荧光。

Kd值：为Ca2+解离常数，指示检测Ca2+浓度的范围:0.1xKd-10xkd

—和很多因素有关（pH、Mg2+、温度、与蛋白的结合、等）细胞内生理Ca2+浓度值：10-100nM

细胞内Ca2+超载浓度值：基础Ca2+浓度的10倍左右

4.活细胞内离子动态变化测量细胞内游离Ca2+测量荧光探针激发波长 发射波长Kd

CalciumGreen-1507nm 530nm190nMCalciumGreen-2507nm 535nm550nMOregonGreen488494nm 520nm20,000nMFLuo3-AM,464nm 526nm390nMFurared 420/480nm

637nm140nMKCL诱导的细胞外Ca++内流测量培养/分离的细胞20MFluo3-AM负载液30-60min清洗、换液扫描KCL若须快速测量1.改变扫描速度2.采用双向扫描3.减少采样点数(牺牲空间分辨率）4.采用线扫描(xt)KCL双光子激光扫描荧光显微系统

照射光波长大于荧光染料吸收峰波长2倍高能量(2KW)、超短脉冲(兆分之一秒)聚焦,使聚焦点瞬间产生高密度光子,出现双光子吸收激发荧光双光子吸收仅发生在聚焦点,避免了焦点外激发而产生的漂白现象高能量、超短脉冲聚焦、穿透性更强50m500m488nm520nmFITC976nm共聚焦激光扫描荧光显微镜术样本制备的基本原则400450500550600650700750800EXCITATIONandEMISSIONSPECTRAEXCITATIONEMISSION

Cy2

Cy3

TexasRed

Cy5

Cy5.5INTENSITY[arb.units]WAVELENGTH[nm]FITCRhodamine1.常用荧光素的特性2.荧光探针的选择原则：尽量减小不同荧光物质间激发/发射光谱的重叠。标记要求荧光素选择/组合核复染单标无特殊限制。FITC,Cy2最佳；尽量不选择Cy5,Cy5.5（红外)与自发荧光冲突时，采用TexasRed。PropediumIodide(PI)/DAPI双标FITC/Cy2+TEXASREDFITC/Cy2+RHODAMINE/Cy3(必须顺序扫描)DAPI(必须顺序扫描)三标FITC/Cy2+TEXASRED+Cy5.5FITC/Cy2+RHODAMINE/Cy3+Cy5.5(必须顺序扫描)活细胞追踪△

能被细胞主动摄取、对细胞无毒性作用、能在活细胞内长时间存在、随细胞分裂进入子细胞

()△

显微注射；转基因技术（GFP；GFP-ACTIN）3.3-D样本制备的基本原则1.固定2.是否需要切片？

△激发光的穿透力：50um

(单光子)-500um(双光子)

△荧光探针对组织的渗透能力

用震荡切片机切40-100m厚片3.透明酒精脱水二甲苯透明二甲苯+少量中性树胶湿封4.封片：