高等真核生物细胞中监测自噬试验方法的解释与使用指南

#/9高等真核生物细胞中监测自噬试验方法的解释与使用指南高等真核生物细胞中监测自噬试验方法的解释与使用指南摘要目前有关细胞自噬的研究持续性地增加，不断的吸引许多新的科学家进入这一领域。因此，在不同的生物机体中建立一套标准的监测巨自噬的准则规定，就具有重要意义。最近的很多文献已经描述了已被使用于这一目的的检测范围。有许多有用并且简便的方法可用于监测酵母巨自噬，但在其他模型系统中相对较少；此外，用于测试高等真核生物的巨自噬，存在很多混淆的但看似可接受的方法。需要强调的一个关键问题在于：在测量监测的自噬体数目与测量那些流过自噬途径的自噬体数目之间，存在一定的差异；这样一来，巨自噬堆积，将导致自噬体的聚集作用，需要从完全功能性自嗜的分化作用，其包括输送和降解，以及溶酶体（在大多数高等真核生物中）或液泡（在植物和真菌中）。本文中，我们提出一套指南，用于对这些方法的选择和解释，可供那些试图检测巨自噬及其相关进程的研究人员使用，此外，那些需要对这些研究过程的文章提供实际与合理的批评意见的审稿者也可以使用。本套指南并不意味着是一种公式化的规则，因为适当的检测方法部分地取决于那些所需要解决的问题和正在使用的系统。此外，我们强调，没有任何的检测方法能保证在各种情况下都是最恰当的，我们强烈推荐使用多种检测方式来验证一种自噬反应。关键词自噬泡自噬体通量溶酶体吞噬泡压力液泡在第一次自噬与健康和疾病的Keystone研讨会上，一位坐在听众席的研究员在听了若干细节上不充分的与记录自噬相关的报告后，提出了这样一个问题“证明自噬的最关键的准则是什么？”这是一个理性的问题，特别是考虑到我们每个人对这一问题都有可能有自己的见解。不幸的是，对于那些认为自己可能找到了准则的研究人员来说，这些准则似乎是移动着的目标，他们悲哀的发现评论家们有着不同的观点。相反，作为一个评论家，他们反复的提出相同的反对理由，疑惑为什么研究人员没有达到证实自噬过程存在的基本要求。另外，潜在调控自噬的药物越来越多的应用到临床诊断中，而且用于治疗目的的可调控自噬的新药屏障已经建立起来。显而易见的，基于一套可被接受的准则要求下，确认这些药物是否能够真的影响自噬过程十分重要。因此，我们在此提出一套基本的指南，应用这套指南，研究人员可以计划和阐释他们的实验，临床医生可以决定采用那种方法是最合适的，作者和评论员可以支持或批判某一研究成果。在为调控自噬选择最合适的方法构建指南的过程中，有几个基本的要点需要谨记。十分重要的一点是对于监测自噬所处的状态没有绝对的准则适用于所有的情况。这是因为有些检验方式是不适宜的，自身存在缺陷的，或者在特定的细胞，组织或器官内根本不起作用。另外，这些指南也许会作为新的方法论而演变发展，取代现有的检测方法。虽然如此，建立一个可被接受的在多种实验系统下均能可靠调控自噬的方法指南十分有用。需要注意的是，在这套指南里，“autophagy”通常代表巨自噬；其他自噬相关过程会在使用时特殊表明。一个基本的要点是自噬是一个动态的多步骤过程，可以在许多步骤中积极的和消极的调控。从这点来看，自噬的途径和其他代谢途径不存在差别。例如，自噬体的积累（通过电子显微镜图像分析，GFP-LC3荧光亮点分析，或者LC3脂化的western印记分析）可以反映出由于自噬活性的增加引起的自噬体形成的加快或者自噬体消亡的减慢（见图1）。后者是通过抑制自噬体成熟成为自噬泡实现的，抑制是由于自噬体分别脱离了与胞内体或溶酶体的融合，或者是融合后的低效降解而产生的。为了进行综述，自噬过程划分为隔离吞噬泡，自噬体，amphisome（自噬体和胞内体融合的中间囊泡，也可认为是酸性晚期自噬体）和自噬泡（自噬体或amphisomes与溶酶体融合产生的，可以认为是自噬溶酶体）。在这篇评论文章中“phagophore”（吞噬泡）没有暗示自噬体膜的来源的意义。吞噬泡之一术语最初被创造出来是为了指示最初的隔离结构与其他细胞器在形态学上明显不同。其他研究表明自噬体隔离膜的特殊来源最明显的是内质网。实际上，最近的研究工作表明自噬体的形成需要内质网及其他普遍存在的膜结构流经分泌途径。自噬过程中膜的来源的完整理解仍需深入的研究，因此，在本篇文章中提到的吞噬泡仅仅代表一种特殊的结构。对自噬细胞死亡，或者更确切的说与自噬相关联的细胞死亡（因为鲜有例子表明自噬是导致细胞程序性死亡的机制）的相关研究表明，在另一个重要的情况下，就有必要区分是否出现由于抑制与诱导自噬引起的表型缺陷。在某些情况下，这种类型的死亡是由于自噬通量减少，由于抑制自噬体与溶酶体的融合或降解溶酶体功能的缺失。因此，使用自噬的标记分子，如LC3-II，需要补充对自噬通量的全面了解，以保证对结果有一个正确的解释。在这里，人们需要衡量一般自噬过程中蛋白质的分解率，或在一个给定的点阻止自噬通量，在这一被阻塞的时间点记录细胞器，细胞器的标记，底物（cargo）标志分子，或整个底物的时间依赖性积累。按照同样的思路，可以按照时间依赖性减少选择适当的标记。从理论上讲，这可以通过在途径中的特殊步骤中阻断自噬隔离来实现（例如：阻断新吞噬泡的进一步诱导或成核过程），测量在阻断位点之后的标记分子间少量。问题的关键是通过测量“稳定状态”的水平和自噬细胞成分的降解率来区分自噬的形成和积累。两个过程都曾被用来估计“自体吞噬”，但除非实验可以把自噬体数目的变化与直接或间接测量得到的自噬通量（例如，清算底物作为一种直接测量方法，或LC3-II的变化作为一个间接测量测量方法）相关联起来，否则他们可能很难解释清楚。在这里提醒一下要确保术语“稳态”的正确使用。不要认为一个自噬系统处于稳定状态,就意味着自噬体的水平不随时间改变，系统中的通量是不变的。相反,在本文中我们使用的术语稳态是指测量值在本质上是静态。自噬通量是指自噬的完整过程，包括底物向溶酶体的传送（通过后者与自噬体或amphisomes的融合）及其后续分解和回收利用。因此，增加磷脂酰乙醇胺修饰的LC3（即LC3-II）的含量，或者甚至自噬体的外表不是自噬通量本质上的测量手段，但是依然可以反映自噬的诱导和/或自噬体的抑制或amphisome的清算。此外，一个细胞的降解能力可能随着细胞类型，年龄，转化和/或疾病而变化，可能会决定诱导自噬的结果。最后，重要的是要注意，尽管LC3-II的形成与自噬的诱导相关，但是我们目前不知道，LC3-II的形成和自噬其余过程间的实际机制关系。因此，有必要区分自噬或LC3-II积累，自噬通量之间的关系。最后，我们强烈建议作者们在表述实验结果时避免使用“%自噬”的表达方式，例如“细胞显示同比增长25%的自噬”。相反，指出显示点状GFP-LC3的细胞百分比，或者一个长寿命蛋白质的降解率特定增加或减少，因为这些是能被量化的实际测量方法。总的来说，我们提出以下准则来在高等真核生物中衡量自噬的各个方面。A通过稳态的方法调控吞噬泡和自噬体的形成把指南分成稳态和通量两个方面的关键原因是前者虽然能表征自噬的诱导，但是不能确定自噬的整个过程是否完成。这一点十分重要，因为不完整的自噬过程将导致自噬体的积累，从而引起生理上的机能失调。相反，完整的自噬过程将产生细胞保护效应。1.电子显微镜自噬现象首先是通过电子显微镜发现的。细胞质中心区域的降解通过吞噬泡（一种特殊的光滑，无核糖体的双层膜）隔离开，吞噬泡成熟后成为前溶酶体自噬体是自噬的标志。因此，在分析自噬过程中多种结构的连续性变化时（吞噬泡、自噬体、amphisome和自噬泡），使用电子显微镜是一种即有效又重要的定性和定量分析方法。从吞噬泡经过自噬体的成熟是一个动态和连续过程，因而把这些结构分类成为形态学上不相关联的类别是存在问题的。幸运的是，在大多数生理和病理情况下，检测早期和晚期的自噬结构产生足够重要的数据来反映整个细胞中的自噬/溶酶体所处的状态。注意尽管电子显微镜是用于监测自噬的最广泛的方法之一，但是它同时也是最存在疑问的和易于误解结果的方法之一。由于人工加工样品的巨大潜力，谨慎选择适宜的无偏差的量化方法和形态特征/体视学分析十分重要。例如，计数自噬体的剖面是一种较好的办法，然后只计数细胞的一个区域内是否存在自噬体，但是首选的方法用形态测量学/立体测量学的方法确定自噬体体积占细胞质体积的百分比。在量化过程中，确保取样的随机均等性什么重要，这意味着薄层区域内每一个细胞具有相同的概率被计数。可靠的自噬体鉴别方法是有效分析的前提。另外一个难点是，在哺乳动物自噬体的成熟过程中包括一个从双层膜结构过渡到单层膜结构的过程（如amphisomes和自噬泡）。因此，双层膜在确定与自噬相关的结构中不是必要的超微结构证据，而且聘请专家来分析结果十分重要，以避免误解显微照片。即使是在专家中，对真正的自噬体的特征仍有很大分歧。例如，饥饿诱导产生的自噬体应包含细胞质（即细胞质和可能的细胞器），但自噬相关结构涉及特定类型的自噬，如选择性过氧化物酶，或线粒体的退化（分别为过氧化物酶体自噬或线粒体自噬）或有针对性的病原微生物的降解（xenophagy），可能相对缺乏细胞质。此外，一些致病性微生物在感染过程中表达破坏膜结构的因子，破坏自噬体正常的双层膜结构。我们甚至不清楚是该将特定细胞器降解时产生的隔离结构和xenophagy也定义为自噬体，还是应该将其另外分别定义为过氧化物酶体自噬和xenophagosome,尽管它们的膜结构和形成机制与饥饿诱导产生的自噬体相同。确定吞噬小体中原材料来源于自我吞食还是异源吞噬也十分困难；适当的时候，特殊的分析方法可以对吞噬原材料的来源进行评估。无论如何,证明被膜隔离起来的区域里的物质完全被降解十分必要。这是通过证明膜隔离结构（线粒体或粗面内质网潴泡）从完整到相继瓦解直到完全消失的现象完成的。在降解过程中仍保持不离散的事实说明吞噬小体在三维结构上被膜包被。利用传统的免疫细胞化学方法证明在融合后的细胞自噬体内存在溶酶体酶也是可行的。最后,由于内质网的池状结构,包围线粒体或其他细胞器的双层膜结构经常能在剖面观察到,这实际上与内质网潴泡结构出入横剖平面有关。膜上存在的核糖体有助于我们区分出自噬体的无核糖体双层膜结构。在潜在不确定的情况下,需要使用免疫金标签电子显微镜,使用底物蛋白（细胞质来源的；在这种情况下底物不能是大量存在的细胞质蛋白否则背景会很亮,细胞器标记很适用）和LC3的抗体来证实自噬的结构特性。这种方法的成功依赖于抗体的质量,电子显微镜的准备工作和样品的固定化程序。应用免疫电镜时,作者要控制标签是独特的,确保信号在背景下清晰可见。此外,我们建议提供统计信息,因为有必要显示一个选择的多个部分。再次,我们建议为定量数据首选适当的容量分析方法,而不仅仅是对选择的区段进行计数。我们必须牢记,即使是容量的形态测量学/立体测量学分析只显示稳态水平,其本身不能为自噬通量提供信息。另一方面,定量分析表明自噬体的体积在很多情况下与蛋白质的降解率有关。关于电子显微镜的一点附加说明,在一定程度上和共聚焦荧光显微镜一样,分析一个细胞的某一单一部分可能会产生误导并且可能引起自噬结构的识别困难。一个潜在的折中方法是利用荧光显微镜定量整个细胞中的自噬体,然后用电子显微镜来定性确认,显示荧光中亮点的变化反映自噬结构数量上的增加。共聚焦显微镜和荧光显微镜与层层分解分析软件（或者更多的工作,电子显微镜）可以用于产生同一细胞多重/连续的部位来降低这一顾虑,但是这一般不是必要的,因为分析多个细胞的单一部位更方便并且能够提供更多的信息。另外一个值得关注的方法将光学显微镜和电子显微镜联系起来，CLEM,有助于确定荧光标记的结构是自噬体结构。最后，即使是一种间接测量方法，根据自噬体数量与电镜下的自噬泡数量的比值，可以以此来改变其它程序中确认自噬的方法。在这种情况下，经常比较样品和同一细胞类型的控制组，自噬体和自噬泡的比率在一个细胞中的变化依赖于背景的样式，依赖于他们余下的活性。区别自噬体和末溶酶体/第二溶酶体（前者活跃的参与到降解中，而后者在腔内物质的降解过程中已经到达末期）也十分重要，因为当自噬被诱导时溶酶体的数量往往增加。2.Atg8/LC3western印迹和泛素蛋白结合系统Atg8/LC3是一种类似泛素蛋白的蛋白，可以与磷脂酰乙醇胺结合。在酵母中，结合形式为Atg8-磷脂酰乙醇胺。在哺乳动物中Atg8的同源物质组成了一个蛋白家族，其中微管相关蛋白1的轻链3（LC3）与我们的讨论关联最密切（在其它体系中，这个蛋白也被称作“Atg8”，但是为了简化，我们称它为LC3，以便其和酵母中的蛋白相区分）。LC3最初是以未加工的形式合成的，前LC3，经过解朊作用切除C端的氨基酸转化成为LC3-I，最终修饰成与磷脂酰乙醇胺结合的形式LC3-II（图2）。Atg8-磷脂酰乙醇胺/LC3-II是唯一一种可靠的与自噬体相关联的蛋白标记，但是也可以在吞噬泡中得到定位。在酵母中，当自噬被诱导时，Atg8的含量至少会增加十倍。然而在哺乳动物细胞中，LC3的总含量没有必然的变化，LC3-I向LC3-II的转化可能加快，或者是LC3-II通过溶酶体自溶而快速降解引起LC3-II含量相对于LC3-I含量的降低。更进一步说，即使LC3的总含量增加了，其增加的比率也要小于酵母中增加的比率。Western印迹可以十分简便的应用于LC3含量（图2）变化的检测过程。需要注意的是，LC3-II的Western印迹还没有在果蝇中得到成功。注意在使用LC3-II的自噬过程中有两个重要的注意事项。第一点，LC3-II含量的变化是依赖于组织和细胞环境而变化的。实际上，在某些情况下，运用电子显微镜检测自噬体积累时没有发现LC3-II含量的增加。相反，正常水平的LC3-II不能作为自噬的充分证据。例如，在胚胎干细胞中纯合缺失beclin1基因虽然会导致自噬的缺陷，但是不会阻碍LC3-II的形成，然而atg5基因的缺失会导致LC3-II的完全消失（见图2B和参考文献32中的补充数据）。因此，重要的是要记住，并不是所有的自噬相关蛋白都需要像Atg8/LC3—样的过程，包括脂化。检测手段和LC3-I与LC3-II相对含量的变化莫测暴露出了技术性问题。例如，LC3-I在脑组织中含量丰富，LC3-I键的强度可能会使LC3-II的检测结果模糊不清，除非所用的聚丙烯酰胺交联密度得到过优化。相反，在某一细胞系中LC3-1的含量比LC3-II的含量少得多。此外，组织中可能会含有异步和异质的细胞群体，这可能会给利用Western印迹的方法分析LC3带来挑战。第二点，在用Western印迹的方法分析LC3时要谨慎，适宜的标准化控制是必要的。例如，在用某一特定的LC3抗体检测时，LC3-I相对低活性，同时LC3-I没有LC3-II稳定。LC3-I对冻融和在SDS样品缓冲液中降解也更敏感，所以新鲜的样品必须煮沸并要求尽快检测，同时避免样品受到反复的冻融。关于用Western印迹的方法分析LC3的注意要点已经被囊括在最近的一篇评论文章中，另外一个重要的建议是研究人员在检测LC3-II的相对含量时应该和肌动蛋白的含量相关联，而不是LC3-1的含量。另外，TritonX-100可能不能有效的溶解LC3-II。相反，在1%的SDS中加热能够确保完全溶解，这对于正确解释Western印迹的结果十分重要。而且测量LC3-I的效用取决于被分析的细胞。例如，与外围组织的细胞相比，中枢神经组织细胞中的LC3-I含量丰富并且稳定，在这些细胞中LC3-II与LC3-I的相对比率和LC3-II的含量可以用于监测自噬体的形成。最后，LC3在哺乳动物细胞中存在三种亚型，LC3A,LC3B和LC3C，在不同的组织内有不等的分布，用不同的抗血清或抗体区分这些亚型可能很有必要。在这里提醒一点，LC3B-II含量的增加，而不是LC3A-II,与自噬囊泡数量的增加有关，这一结果可由电子显微镜或与反应自噬诱导压力的鼠GFP-LC3转染实验检测得到。这一结果支持了LC3的亚型显示不同功能的观点，我们建议在western印迹和免疫荧光实验中使用抗LC3B，而不是抗LC3A。补充一点关于监测共价结合的Atg12-Atg的关注，其已在一些研究中用来衡量自噬。在一些哺乳动物细胞中所有的Atg5蛋白和Atg12蛋白均以共价结合的形式存在并且表达水平不变，至少是在短期饥饿处理时不变。因而，监测共价结合的Atg12-Atg5来反映自噬的诱导在本质上可能是一个无效的方法。然而值得注意的是，在某些细胞系中检测到了游离的Atg5，意味着Atg5的含量可能依赖于细胞系本身。另外一个可能值得考虑的变量是共价结合的Atgl2-Atg5的含量可能会由于长时间处于饥饿状态而增加，这一现象由肝细胞和成纤维细胞中观察得到。最后，我想指出一个普遍存在的问题，即在检测过程中可能引入多种的压力，例如：由于细胞溶解而产生的机械压力，加热或冷却样品产生的温度压力，显微镜滑动产生的氧化压力，这些都可能引起一些认为变化。提出这一点不是为了有意限制使用任何特殊的方法，而是为了指出没有完美的检测方法。因而，证实在检测过程中正向调控（雷帕霉素处理）和负向调控（抑制剂处理）的方法按照预期的想法进行十分重要。3•荧光显微镜LC3B（从本文的此处后用LC3代替），或者N端标记了荧光蛋白（如GFP,GFP-LC3）的蛋白质，已经被应用于间接免疫荧光或直接荧光显微镜的方法监测自噬，衡量的方法是测定LC3或GFP-LC3亮点的增加量。GFP-LC3/Atg8的检测在用转基因生物，如：线虫、粘菌、果蝇、拟南芥和鼠中进行的体内研究也十分有用。也可以在免疫细胞化学或免疫组织化学的实验中使用抗LC3的抗体，具有检测内源性蛋白，省却转染和转基因的程序的优点，以及避免可能因过度表达而引起的潜在人工因素。检测内源性蛋白显然依赖于在感兴趣的系统中检测的能力。如果内源性蛋白的含量达不到检测的水平，那么必须确保使用内源性蛋白质的构建。在这种情况下，考虑使用比瞬时转染稳定的转化十分重要。稳定的转化因为蛋白表达低所以可以减少背景，同时也具有消除暴露于转染试剂的优点。更进一步说，利用转化更多的细胞可以便宜的分析，因为几乎100%的细胞将会表达被标记的LC3。另一方面，稳定的转染子有一个缺点，即整合位点不能完全被预测，表达水平也不是很合适。更进一步说，瞬时转染具有检测被转染蛋白对自噬的即时效应的优点。另外，用双重转染（用GFP-LC3和感兴趣的蛋白）来直观的标记可以表达待检测蛋白的细胞，这种方法可能和稳定的转化子间存在更多地问题。总之，在使用稳定转染和瞬时转