理论3聚合酶链式反应(PCR)及引物设计

聚合酶链式反应（PCR）的技术原理及实验操作PCR引物设计软件的使用（PrimerPremier5.0）Contents当前1页，总共58页。聚合酶链式反应（PCR）实验目的1实验原理（PCR及引物设计）2实验仪器、试剂及耗材3实验步骤4实验结果及讨论5当前2页，总共58页。实验目的了解PCR的基本原理掌握PCR的基本操作技术学习引物设计的原则及引物设计软件Primer5的使用当前3页，总共58页。聚合酶链式反应（PCR）实验目的1

实验原理（PCR及引物设计）2实验仪器、试剂及耗材3实验步骤4实验结果及讨论5当前4页，总共58页。实验原理PCR技术原理引物设计的原则PCR的成分和作用PCR反应体系PCR反应条件优化PCR的应用当前5页，总共58页。PCR技术原理聚合酶链式反应(polymerasechainreaction,PCR)，是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，故又称为基因的体外扩增法。PCR不仅可以用于基因的分离、克隆和核苷酸序列分析，还可以用于突变体和重组体的构建，基因表达调控的研究，基因多态性的分析，遗传病和传染病的诊断，肿瘤机制的探索，法医鉴定等诸多方面。当前6页，总共58页。PCR技术原理

以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板5′末端和3′末端互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成，重复这一过程，即可使目的DNA片段得到扩增。当前7页，总共58页。PCR技术原理模板与引物的复性,引物是与模板某区序列互补的一小段DNA片段。Tm-5˚C在加热或碱性条件下可使DNA双螺旋的氢键断裂，形成单链DNA94˚C从结合在特定DNA模板上的引物为出发点，按5’→3’的方向沿着模板顺序合成新的DNA链72˚C变性退火延伸当前8页，总共58页。PCR技术原理当前9页，总共58页。

PCR出现的问题：

PCR扩增未得到目的条带？扩增出目的条带之外的多条带（非特异性）？扩增的目的条带很弱？引物是否合适?引物设计是PCR技术中至关重要的一环当前10页，总共58页。实验原理PCR技术原理引物设计的原则PCR的成分和作用PCR反应体系PCR反应条件优化PCR的应用当前11页，总共58页。引物设计的原则引物与模板的序列要紧密互补引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应(即错配)。基本原则：当前12页，总共58页。引物设计的原则一般原则：1.引物的长度：配对引物的长度一般在15-30bp之间比较合适。尽可能使用两条引物的Tm值相同（最好相差不要超过5℃）Tm值的计算：一般的公式：Tm=4(G+C)+2(A+T)

2.引物的GC%含量：一般为40%-60%。上下游引物的GC含量不能相差太大。当前13页，总共58页。引物设计的原则3.引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错配。4.引物3’端的末位碱基避开密码子的第3位，且最好不选择A5.引物的5′端可以修饰，而3′端不可修饰。当前14页，总共58页。引物设计的原则6.引物无回文对称结构，否则会形成发夹结构；引物自身不能配对，否则易形成约两个引物长度的引物二聚体；当前15页，总共58页。实验原理PCR技术原理引物设计的原则PCR的成分和作用PCR反应体系PCR反应条件优化PCR的应用当前16页，总共58页。1.缓冲液：

10～50mMTris-Cl(pH8.4)维持Taq酶作用环境25～50mMKCl促进引物退火

100μg/ml牛血清白蛋白(BSA)

对酶有一定的保护性

0.5～2.5mMMgCl2

Taq酶具有Mg2+依赖性2.dNTPs:dATP、dGTP、dCTP、dTTP——底物

0.5～2.5μMPCR的成分和作用当前17页，总共58页。

3.引物(Primer-P)：预扩增核酸片段两端的已知序列，决定特异性。

0.1～1μM4.模板DNA(Template):

最低102

～105DNA片段，实际用量远远超过此量，用量需在实验中摸索。1～5μlPCR的成分和作用当前18页，总共58页。5.TaqDNA聚合酶耐高热

0.5～5U/100μl1U/25～50μl6.水：去离子水，补足整个反应体积。PCR的成分和作用当前19页，总共58页。实验原理PCR技术原理引物设计的原则PCR的成分和作用PCR反应体系PCR反应条件优化PCR的应用当前20页，总共58页。常用30μl

各种成分的实际用量应根据实验者选用的该成分的终浓度及所拥有的储备液浓度进行核算。PCR反应体系当前21页，总共58页。操作：

5份标本总体积30μl×6=180μl1.取一0.5mlEp管，加入下列试剂：

10×buffer：3μl×6=18μldNTPs:1.0μl×6=6.0μl

引物P1：1.0μl×6=6.0μl

引物P2：1.0μl×6=6.0μlTaq酶(5U/μl)：0.2μl×6=1.2μl

水：22.8μl×6=136.8μl

共174μl，先用移液器/指弹混匀，后用离心机瞬时混匀（管壁上液体沉至管底）。PCR反应体系冰上操作！当前22页，总共58页。2.另取5支0.2mlPCR管，分别加入上述液体29μl。3.分别取标本模板各1μl，加入上述5支PCR管中，混匀，离心机瞬时离心，备用。4.反应条件：PCR扩增仪PCR反应体系

94℃5′

94℃30″55℃30″72℃45″30个循环

72℃5′当前23页，总共58页。实验原理PCR技术原理引物设计的原则PCR的成分和作用PCR反应体系PCR反应条件优化PCR的应用当前24页，总共58页。⑴变性温度和时间：

保证模板DNA解链完全是保证整个PCR扩增成功的关键。加热90～95℃，30～60s，再复杂的DNA分子也可变性为单链。根据模板DNA复杂程度，可以调整变性温度和时间。一般情况下选择94℃30″，可使各种复杂的DNA分子完全变性。PCR反应条件优化当前25页，总共58页。⑵退火温度和时间：

PCR扩增特异性取决于复性过程中引物与模板的结合。退火温度的选择，可根据引物的长度和G+C含量确定，一般位于40～60℃，30～60s。

退火温度越高，产物特异性越高。退火温度越低，产物特异性越低。

设置退火温度梯度，摸索最佳退火温度！

PCR反应条件优化当前26页，总共58页。

⑶延伸温度和时间：延伸温度一般位于Taq酶最适作用温度70～75℃之间，常用72℃

延伸时间，可根据待扩增片段的长度和使用的Taq酶而定，一般taq酶的扩增效率是1kb/1min

延伸时间过长可出现非特异扩增。

PCR反应条件优化当前27页，总共58页。⑷循环数：其他参数选定后，PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。理论上说20～25次循环后，PCR产物的积累即可达到最大值，实际操作中由于每步反应的产率不可能达到100%，因此不管模板浓度是多少，20～30次是比较合理的循环次数。循环次数越多，非特异扩增增加。PCR反应条件优化当前28页，总共58页。实验原理PCR技术原理引物设计的原则PCR的成分和作用PCR反应体系PCR反应条件优化PCR的应用当前29页，总共58页。1、目的基因的克隆：

PCR技术为在重组DNA过程中获得目的基因片段提供了简便快速的方法。

2、基因的体外突变：可以随意设计引物在体外对目的基因片段进行嵌和、缺失、点突变等改造。PCR的应用当前30页，总共58页。3、DNA和RNA的微量分析：

PCR技术高度敏感，对模板ＤＮＡ的含量要求很低，是DNA和ＲNA微量分析的最好方法。实际工作中，一滴血液、一根毛发或一个细胞已足以满足PCR的检测需要，因此在基因诊断方面具有极广阔的应用前景。4、基因转录水平检测

RT-PCR可检测不同组织或细胞中基因的转录水平5、基因突变分析：利用PCR与一些技术的结合可以大大提高基因突变检测的敏感性。PCR的应用当前31页，总共58页。聚合酶链式反应（PCR）实验目的1实验原理（PCR及引物设计）2

实验仪器、试剂及耗材3实验步骤4实验结果及讨论5当前32页，总共58页。实验仪器、试剂及耗材实验仪器及耗材

PCR仪、移液器、0.2mLPCR管、各种规格的吸头。当前33页，总共58页。实验仪器、试剂及耗材实验试剂

10×PCRbuffer(Mg2+Plus)（YRBIO）；

dNTPmix(2.5mMeach)（YRBIO）；

TaqDNAPolymerase(2U/μL)（YRBIO）；引物：Tpm4-F/Tpm4-R，引物溶液浓度为10μM；

Tpm4基因模板质粒:

（购自YRBIO基因库）；无菌超纯水；琼脂糖。当前34页，总共58页。聚合酶链式反应（PCR）实验目的1实验原理（PCR及引物设计）2实验仪器、试剂及耗材3

实验步骤4实验结果及讨论5当前35页，总共58页。实验步骤准备PCR反应溶液，取0.2mLPCR管，按以下顺序加入各试剂：

PCR反应体系无菌超纯水

38μL10×buffer5.0μLdNTPmix2.5μL

引物Tpm4-F1μL

引物Tpm4-R1μL模板（TS-Tpm4）2μLTaq酶0.5μL

合计50μL当前36页，总共58页。实验步骤调整好反应程序，将上述混合液稍加离心，立即置PCR仪上，执行扩增。反应程序：94℃5min；94℃30sec；55℃30sec；72℃45sec；30个循环，最后72℃延伸10min。每人做一管，反应完毕后，各取3-5μL进行琼脂糖凝胶（1.0%）电泳检测。当前37页，总共58页。聚合酶链式反应（PCR）实验目的1实验原理（PCR及引物设计）2实验仪器、试剂及耗材3实验步骤4

实验结果及讨论5当前38页，总共58页。实验结果及讨论PCR产物琼脂糖检测结果1、PCR产物（5ul样品）当前39页，总共58页。PCR常见问题1.无扩增产物模板:含有抑制物，含量低Buffer对样品不合适引物设计不当或者发生降解退火温度太高当前40页，总共58页。2.非特异性扩增

PCR常见问题引物特异性差模板或引物浓度过高酶量过多退火温度偏低循环次数过多当前41页，总共58页。PCR常见问题3.拖尾产物在凝胶上呈Smear状态

M12模板不纯或降解Buffer不合适退火温度偏低酶量过多dNTP、Mg2+浓度偏高循环次数过多当前42页，总共58页。4.假阳性（筛选转基因、检测基因表达情况)交叉污染PCR常见问题对策操作时防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；除不能耐高温的物质外，所有试剂器材均高压消毒。离心管及枪头等一次性使用。各种试剂先进行分装，低温贮存。设置阳性和阴性对照，重复实验当前43页，总共58页。Content聚合酶链式反应（PCR）的技术原理及实验操作PCR引物设计软件的使用（PrimerPremier5.0）当前44页，总共58页。常用的引物设计软件PrimerPremier5.0（自动搜索）*Oligo6（引物评价）*VectorNTISuitDnasisOmigaDnastar当前45页，总共58页。PrimerPremier5.0简介主要功能:1、引物设计2、限制性内切酶位点分析3、DNA基元(motif)查找4、同源性分析当前46页，总共58页。PrimerPremier5.0使用介绍PreimerPremier启动界面Loadsequence当前47页，总共58页。SequencenameOriginalsequenceUsethesetwobuttontotranslatethe