微生物的遗传育种

第七章

微生物的遗传变异与育种当前1页，总共183页。亲代与子代相似遗传：变异：亲代与子代、子代间不同个体不完全相同遗传（inheritance）和变异（variation）是生命的最本质特性之一当前2页，总共183页。一、几个基本概念遗传(heredity)：生物的上一代将自己的一整套遗传因子传递给下一代的行为或功能，具有极其稳定（保守）的特性。遗传型（或基因型）(genotype)：某一生物个体所含有的全部遗传因子即基因组所携带的遗传信息。生物所携带的全部遗传因子或者基因的总称当前3页，总共183页。表型(phenotype)：某一生物体所具有的一切外表特征及内在特性的总和，是遗传型在合适环境下通过代谢和发育而得到的具体表现。遗传型（可能性）+环境条件→表型（现实性）表型是由遗传型所决定，但也和环境有关当前4页，总共183页。变异(variation)：生物体在某种外因或内因的作用下所引起的遗传物质结构或数量的改变，即遗传型的改变饰变(modification)：外表的修饰性改变，不涉及遗传物质结构改变，而只发生在转录、转译水平上的表型变化。饰变是不遗传的当前5页，总共183页。表型饰变：表型的差异，只与环境有关Productionofaredpigment(prodigiosin)bySerratiamarcescens（粘质沙雷氏菌菌落）特点：表现为全部个体的行为，变化幅度小；暂时性、不可遗传性。当前6页，总共183页。微生物是遗传学研究中的明星

微生物细胞结构简单，营养体一般为单倍体，方便建立纯系；很多常见微生物都易于人工培养，快速、大量生长繁殖，易于积累不同的代谢产物和中间代谢物，菌落形态具有可见性与多样性；物种和代谢类型多样；对环境因素的作用敏感，易于获得各类突变株，操作性强。当前7页，总共183页。二、遗传变异的物质基础三个经典实验肺炎链球菌的转化实验噬菌体的感染实验植物病毒的重建实验当前8页，总共183页。1、Discoveryofbacterialtransformation（转化）1928，FredGriffith，（格里菲斯)discoveredthephenomenonoftransformationinStreptococcuspneumoniae（肺炎链球菌）当前9页，总共183页。实验材料：肺炎链球菌光滑型（S）粗糙型（R）有荚膜菌落光滑分泌毒素致病无荚膜菌落粗糙无毒不致病SⅠSⅡSⅢ三个血清型RⅠRⅡRⅢ三个血清型当前10页，总共183页。R型活菌S型活菌加热杀死S型菌动物实验当前11页，总共183页。R型活菌+加热杀死S型+？活的无毒（R）型细菌受到了死的有毒（S）型细菌的影响，转化为有毒（S）型当前12页，总共183页。DiscoveryofDNAasgeneticmaterial

细菌培养试验热死S菌培养皿培养不生长活R菌培养皿培养长出R菌热死S菌+活R菌培养皿培养长出大量R菌及10-6S菌S型菌的无细胞抽提液试验活R菌+S菌无细胞抽提液培养皿培养长出大量R菌和少量S菌当前13页，总共183页。以上实验说明：加热杀死的SIII型细菌细胞内可能存在一种转化物质，它能通过某种方式进入RII型细胞并使RII型细胞获得稳定的遗传性状，转变为SIII型细胞。当前14页，总共183页。1944年，Avery精确重复了转化实验，确定了转化因子当前15页，总共183页。实验证明，将R菌转化为S菌的转化因子是DNA当前16页，总共183页。2、T2噬菌体感染实验1952年Hershey和Chase用32P标记DNA，用35S标记蛋白。实验证明，进入细菌细胞内部的物质是DNA。DNA包含有产生完整噬菌体的全部信息。当前17页，总共183页。植物病毒蛋白质和RNA可以人为地分开,同时又可把它们重新组合成具感染性的病毒3、植物病毒的重建实验当前18页，总共183页。TMVHRVHRVTMV原始株拆开重建感染分离纯化植物病毒的重建实验TMV:烟草花叶病毒;HRV:霍氏车前花叶病毒12当前19页，总共183页。二、遗传物质在微生物细胞内存在方式(189)1、细胞水平2、细胞核水平3、染色体水平4、核酸水平5、基因水平6、密码子水平7、核苷酸水平当前20页，总共183页。1、细胞水平真核微生物：细胞核原核微生物：核区细胞核或核区的数目在不同的微生物中是不同的当前21页，总共183页。2、细胞核水平真核与原核，被称为核基因组、核染色体或基因组。多数存在核外DNA含量少、能自主复制的核外染色体——质粒。当前22页，总共183页。3、染色体水平（1）染色体是由组蛋白与DNA构成的线状结构（2）染色体的数目在不同的生物中是不同的（3）染色体的倍数在同一生物的不同生活时期是不同的，染色体倍数：指同一细胞中相同染色体的套数。当前23页，总共183页。4、核酸水平核酸种类：DNA，RNA核酸结构：双链、单链；环状，线状，超螺旋状DNA长度：因种而异（bp、kb、Mb)微生物基因组测序工作是在人类基因组计划的促进下开始的，最开始是作为模式生物，后来不断发展，已成为研究微生物学的最有力的手段。当前24页，总共183页。5、基因水平1、基因概念

基因是一个含有特定遗传信息的核苷酸序列，是遗传物质的最小功能单位。2、种类

(1)结构基因和调节基因：编码蛋白质的基因结构基因→各种结构蛋白和催化各种生化反应的酶；调节基因→阻遏蛋白或激活蛋白。

(2)核糖体RNA基因(rDNA)与转译RNA基因(tDNA)：无翻译产物的基因(3)启动子与操纵基因：不转录的DNA区段当前25页，总共183页。6、密码子水平遗传密码是指DNA链上决定各具体氨基酸的特定核苷酸排列顺序。遗传密码的信息单位是密码子。每一密码子由3个核苷酸序列，即1个三联体组成。当前26页，总共183页。7、核苷酸水平核苷酸是最小突变单位和交换单位当前27页，总共183页。细胞核、染色体、染色质、DNA、碱基对28当前28页，总共183页。三、基因突变

（Genemutation）基因突变（突变）：细胞内（或病毒体内）遗传物质的分子结构或数量突然发生的可遗传的变化。狭义的突变：专指基因突变（点突变）。广义的突变：包括基因突变和染色体突变。突变概率一般为10-9~10-6野生型菌株（wildtypestrain，野生型）：从自然界分离到的、没有发生过突变的菌株。

突变株（mutant，突变体、突变型）：野生型经突变后形成的带有新性状的菌株。当前29页，总共183页。突变率：某一细胞（或病毒体）在每一世代中发生某一性状突变的几率

如突变率为10-8，即该细胞发生1亿次分裂，发生1次突变

某一单位群体在每一世代（分裂一次）中产生的突变株的数目1x108----2x108当前30页，总共183页。1、基因突变的特点(P200)自发性：突变可以在没有人为的诱变因素处理下自发产生。稀有性：突变率极低。诱变性：通过诱变剂的作用提高自发突变几率。独立性：突变的发生一般是独立的。当前31页，总共183页。稳定性：新的诱变性状是稳定的、可遗传的。可逆性：野生型基因

突变型基因不对称性：突变性状与引起突变的原因间无直接的对应关系。正向突变回复突变当前32页，总共183页。2、基因突变的自发性与不对称性的证明突变是通过适应而发生的，即各种抗性是由其环境（指其中所含的抵抗对象）诱发出来的，突变的原因和突变的性状间是相对应的，并认为这就是“定向变异”，也有人称它为“驯化”或“驯养”。基因突变是自发的，且与环境是不相对称的。当前33页，总共183页。变量试验（fluctuationtest）1943年，S.E.Luria和M.Delbrück涂布试验（newcombeexperiment）1949年，Newcombe平板影印培养试验（replicaplating）1952年，J.Lederberg当前34页，总共183页。变量实验（fluctuationanalysis）SalvadorLuriaandMaxDelbruck（1943）SalvadorLuriaMaxDelbruckTheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine1969当前35页，总共183页。当前36页，总共183页。Newcombe的涂布实验（1949）6皿共353个6皿共28个当前37页，总共183页。影印实验（replicaplating）JoshuaLederbergandEstherLederberg（1952）JoshuaLederbergJ.LederbergisawardedtheNoblePrizeinMedicineandPhysiologyin1958当前38页，总共183页。营养缺陷型（auxotroph）当前39页，总共183页。

影印平板培养法：一种通过盖章的方式，使在一系列培养皿的相同位置能出现相同菌落的接种培养方法。当前40页，总共183页。实验原理：通过盖印章的方式，在未接触抗性因素的条件下筛选出的抗性突变株。由于实验过程中没有接触过抗性因素，所以直接证明了基因突变的自发性。结果：得到越来越多的抗性菌落，最终甚至可以得到纯的抗性菌株细胞群。。结论：基因突变的自发性。当前41页，总共183页。3、突变类型选择性突变株:具有选择性标记，可通过某种环境条件使它们得到优势生长，从而取代原始菌株条件致死突变型(conditionallethalmutant)抗性突变型(resistantmutant)营养缺陷型(auxotroph)非选择性突变株:无选择性标记，而只有一些性状的数量差别，如菌落大小、颜色深浅、代谢物产量等形态突变型(morphologicalmutant)抗原突变型(antigenicmutant)产量突变型(producingmutant)当前42页，总共183页。●

营养缺陷型（auxotroph）表型判断的标准：在基本培养基上能否生长常见的微生物突变类型一种缺乏合成其生存所必须的营养物(包括氨基酸、维生素、碱基等)的突变型,只有从周围环境或培养基中获得这些营养或其前体物(precursor)才能生长.当前43页，总共183页。在选择性培养基（一般为基本培养基）上不生长负选择标记突变株不能通过选择平板直接获得营养缺陷型特点：营养缺陷型的表示方法：基因型：用hisC-和hisC+，分别表示缺陷型和野生型。表型：第一个字母大写，且不用斜体：HisC当前44页，总共183页。抗药性突变型基因突变使菌株对某种或某几种药物，特别是抗生素，产生抗性。表示方法：所抗药物的前三个小写斜体英文字母加上“r”表示strr和strs分别表示对链霉素的抗性和敏感性正选择标记突变株可直接从抗性平板上获得在加有相应抗生素的平板上,只有抗性突变能生长.所以很容易分离得到.当前45页，总共183页。条件致死突变型特点：负选择标记这类突变型常被用来分离生长繁殖必需的突变基因

常用的条件致死突变是温度敏感突变，用ts表示，这类突变在高温下（如42℃）是致死的，但可以在低温（如25-30℃）下得到这种突变。在某一条件下具有致死效应，而在另一条件下没有致死效应的突变型。当前46页，总共183页。基因突变：一个基因内部遗传结构或DNA序列的任何改变基因突变是重要的生物学现象，它是一切生物变化的根源，连同基因转移、重组一起提供了推动生物进化的遗传多变性。四、基因突变及其机制当前47页，总共183页。环境因素的影响，DNA复制过程的偶然错误等而导致，一般频率较低，通常为10-6~10-9。某些物理、化学因素或生物因素对生物体的DNA进行直接作用，突变以较高的频率产生。突变自发突变诱发突变当前48页，总共183页。1.自发突变

指生物体在无人工干预下自然发生的低频率突变。引起自发突变的原因：（1）由背景辐射和环境因素引起；（2）由微生物自身有害代谢产物引起；（3）由DNA复制过程中碱基配对错误引起。

★自发突变频率约为10-6。对细菌作一般液体培养，因细胞浓度可达108/mL，常会在其中产生自发突变菌株。

当前49页，总共183页。2、诱发突变（诱变）指通过人为的方法，利用物理、化学或生物因素显著提高基因自发突变频率的手段诱变剂：凡具有诱变效应的任何因素。诱变剂的种类很多，有物理因素（UV、激光、离子束、X射线、γ射线、快中子）和化学因素（亚硝酸、氮芥、烷化剂、碱基类似物、吖啶类化合物）当前50页，总共183页。当前51页，总共183页。（1）碱基的置换——点突变一对碱基被另一对碱基置换。1）转换

DNA链中的一个嘌呤被另一个嘌呤（一个嘧啶被另一个嘧啶）所置换。2）颠换DNA链中的一个嘌呤被另一个嘧啶（一个嘧啶被另一个嘌呤）所置换。碱基置换的两种类型——转换（实线，对角线）和颠换（虚线，纵横线）当前52页，总共183页。（2）移码突变

造成突变点以后全部遗传密码转录与转释发生错误ABCABCABCABCABCABCABCABCAB+ABCABCCBACBACBACBACBAABCBCABCABCABCABCABCABCA增添一个碱基缺少一个碱基DNA序列中的一个或少数几个核苷酸发生增添（插入）或缺失，而使其后面的全部遗传密码发生改变，而引起转录和转译错误。当前53页，总共183页。

某些理化因子，如Ｘ射线，紫外线，亚硝酸等，除引起点突变外，还会引起DNA分子大损伤，包括染色体缺失，重复，易位，倒位等，即为染色体畸变。

（3）染色体畸变当前54页，总共183页。（四）紫外线对DNA的损伤及其修复

DNA中嘧啶对UV的敏感性较强，经UV照射后相邻嘧啶会形成嘧啶二聚体（TT，TC，CC）和水合物。形成二聚体后，造成局部DNA分子无法配对，从而引起微生物的死亡或突变。当前55页，总共183页。微生物修复受损DNA的作用

（1）光复活作用

把经UV照射后的微生物立即暴露于可见光下，就可出现明显降低其死亡率的现象。对照：8×106个/cfuE.coli100cfu/mlE.coli实验：8×106个/cfuE.coli

2×106个/cfuE.coliUVUV

360~490nm可见光，30min当前56页，总共183页。光复活作用机制：经UV照射后带有嘧啶二聚体的DNA分子，在黑暗下会被一种光激活酶（光解酶、光裂合酶）结合。这种复合物在300~500nm可见光下时，此酶会因获得光能而激活，并使二聚体分解成单体。当前57页，总共183页。光复活作用：把经UV照射后的微生物立即暴露于可见光下时，可明显降低其死亡率的现象。所以在进行紫外线诱变育种时，只能在红光下进行照射和后续操作，并在黑暗条件下培养。当前58页，总共183页。（2）、暗修复作用1、由核酸内切酶切开二聚体的5’末端，形成3’-OH和5’-P的单链缺口2、核酸外切酶从5’-P到3’-OH方向切除二聚体，并扩大缺口。3、DNA聚合酶以另一条互补链为模板，从原有链上暴露的3’-OH端起合成缺失片段。4、连接酶将新合成的3’-OH与原有的5’-P相连接。当前59页，总共183页。五、突变与育种选种从自然界中选种样品采集增殖培养（富集培养）分离纯化：平板划线分离法、平板表面涂布法、琼脂培养基浇注法。当前60页，总共183页。TheclassicalapproachforisolatingenzymesfromenvironmentalsamplesEnzymes(overlook)---(novelgenes(encodecomercialenzymesbutproperiesoftherequirmentforapplication))当前61页，总共183页。1、定向培育优良菌株一种利用微生物的自发突变，并采用特定的选择条件，通过对微生物群体不断移植以选育出较优良菌株的古老方法。卡介苗从生产中选种当前62页，总共183页。2、诱变育种利用物理、化学等诱变剂处理均匀而分散的微生物细胞群，促进其突变率显著提高，然后采用简便、快速和高效的筛选方法，从中挑选少数符合目的的突变株。包括诱变和筛选两个环节，其中筛选更重要。当前63页，总共183页。诱变育种

（breedingbyinducedmutation）诱变育种：通过诱发基因突变，获得具有更优生产属性或科学研究的新突变菌株诱变剂：物理、化学、生物诱变方法筛选方法发酵生产属性评价当前64页，总共183页。青霉素：一个时代的传奇PenicilliumchrysogenumNRRL1951,120

mg/mlCultivationofspontaneousmutantsandsingle-sporeisolations:NRRL1951–1325,produced

250

mg/ml.X-raytreatment:500mg/mlultraviolet-inducedmutants:Wis.Q-176,whichproduced900

mg/ml,“WisconsinFamily”ofsuperiorstrainsfromQ-176ledtostrainsproducing

over1800mg/ml.当前65页，总共183页。菌种选育目的工业生产提高产量简化生产工艺缩短生产周期提升质量适应原材料获得新的产品科学研究阐明遗传背景增加遗传标识分析生物合成机制提供遗传学研究材料当前66页，总共183页。1）.诱变育种的基本环节当前67页，总共183页。

2）.诱变育种中的原则（1）选择简便有效的诱变剂突变的频率诱变剂物理因素化学诱变剂生物诱变剂当前68页，总共183页。出发菌株（originalstrain）用于育种的原始菌株选用合适的出发菌株有利于提高育种的效率（2）挑选优良的出发菌株当前69页，总共183页。自然界直接分离获得的野生型菌株在生产中经历生产条件考验的菌株已经过诱变甚至多次改造的菌株选用对诱变剂敏感性较高增变变异株合适的出发菌株来源当前70页，总共183页。（3）处理单细胞或单孢子悬液诱变剂一般只作用于DNA双链中的某一条单链，故某一突变无法反映在当代的表型上经过DNA的复制和细胞分裂后，这一变异才会在表型上表达出来，出现了不纯菌落，这就叫表型延迟（phenotypiclag）当前71页，总共183页。表型延迟（phenotypiclag）A═TGTG≡C当前72页，总共183页。用于诱变育种的细胞应尽量选用：单核单细胞、悬液状态培养几代再筛选霉菌或放线菌的分生孢子当前73页，总共183页。诱变剂的作用：提高诱变的频率扩大变异的幅度使变异向正变的方向移动（产量提高）（4）选用最适的诱变剂量当前74页，总共183页。当前75页，总共183页。两条重要的实验曲线横坐标纵坐标①剂量-存活率曲线诱变剂的剂量细胞存活数的对数值②剂量-诱变率曲线诱变剂的剂量诱变后获得的突变细胞数通过比较上述两曲线，可找到某诱变剂的：

剂量－存活率－诱变率三者的最佳结合点当前76页，总共183页。(5)充分利用复合处理的协同效应

当前77页，总共183页。①两种或多种诱变剂的先后使用②同一种诱变剂的重复使用③两种或多种诱变剂的同时使用复合处理有几类当前78页，总共183页。（6）设计高效筛选方案筛选工作初筛以量为主--选留较多有生产潜力的菌株复筛以质为主--对少量潜力大的菌株的代谢产物量作精确测定当前79页，总共183页。常用的筛选方案第一轮：第二轮：第三轮： 同第二轮第四轮： 同上.

. 直至获得较满意的结果为止当前80页，总共183页。为了大大提高育种时初筛的效率，必须进行大量的分析测定和统计工作，并找到形态变异与产量变异两者间的相关性。（7）利用和创造形态、生理与产量间的相关指标，简化筛选过程，提高正突变菌株获得机率Genotypephenotype当前81页，总共183页。

利用鉴别性培养基的原理或其他途径，就可有效地把原先肉眼无法观察的生理性状或产量性状转化为可见的“形态”性状。当前82页，总共183页。当前83页，总共183页。（8）创造新型筛选方法初筛复筛对产量突变株培养皿上摇瓶中粗测为主快速平板检出法当前84页，总共183页。

（1）产量突变株的筛选

1971年，国外有人报道了筛选春日霉素（kasugamycin，即“春雷霉素”）生产菌时所采用的一种琼脂块培养法，一年内曾使该抗生素产量提高10倍3）.三类突变株的筛选方法当前85页，总共183页。琼脂快培养法当前86页，总共183页。诱变春日霉素产生菌的孢子悬液

琼脂块培养法筛选春日霉素高产菌种培养2d培养4-5d

此法的关键是用打孔器取出含有一个小菌落的琼脂块作分别培养。这样，各琼脂块所含养料和接触空气面积基本相同，且产生的抗生素等代谢产物不致扩散出琼脂块外。数据精确，效率高生物鉴定平板当前87页，总共183页。（2）抗药性突变株的筛选基因突变使菌株对某种或某几种药物，特别是抗生素，产生抗性。特点：正选择标记突变株可直接从抗性平板上获得-----在加有相应抗生素的平板上，只有抗性突变能生长。所以很容易分离得到当前88页，总共183页。

定向筛选抗药性突变株的一种有效方法，通过制备琼脂表面存在药物浓度梯度的平板、在其上涂布诱变处理后的细胞悬液、经培养后再从其上选取抗药性菌落等步骤，就可定向筛选到相应抗药性突变株。梯度平板法当前89页，总共183页。梯度平板法（gradientplate）----定向筛选抗药性突变株的一种有效方法当前90页，总共183页。表示方法所抗药物的前三个英文字母小写斜体加上“r”strrstrs对链霉素的抗性敏感性当前91页，总共183页。（3）营养缺陷型突变株的筛选某一野生型菌株因发生基因突变而丧失合成一种或几种生长因子、碱基或氨基酸的能力，只有从周围环境或培养基中获得这些营养或其前体物才能正常生长繁殖的变异类型当前92页，总共183页。营养缺陷型突变株在生物学基础研究和应用研究、生产实践等研究中十分重要表型判断的标准在基本培养基上能否生长当前93页，总共183页。1)与营养缺陷型突变有关的3类遗传型个体原养型（prototroph）野生型（wildtype，wildstrain）营养缺陷型（auxotroph）从自然界分离到的原始菌株（a＋b＋）经诱变剂处理后的突变株（a+b-）或（a-b+）经回复突变或重组后产生的菌株（a＋b＋）当前94页，总共183页。a.基本培养基（MM，符号为［－］）2)与筛选营养缺陷型突变株有关的3类培养基仅能满足某微生物的野生型菌株生长所需的最低成分的组合培养基，称MMMM=MinimumMedium当前95页，总共183页。b.完全培养基（CM,符号为［＋］）一般可在基本培养基中加入一些富含氨基酸、维生素、核苷酸和碱基之类的天然物质，如蛋白胨或酵母膏等配制而成凡可满足一切营养缺陷型菌株营养需要的天然或半组合培养基，称为CMCM=CompleteMedium当前96页，总共183页。c.补充培养基（supplementalmedium，SM，符号为［A］或［B］等）在基本培养基上再添加对某一营养缺陷型突变株所不能合成的某营养物所组成，可专门选择相应的突变株。凡只能满足相应的营养缺陷型突变株生长需要的培养基，称为SMSM=SupplementalMedium当前97页，总共183页。3）营养缺陷型的筛选方法第一步，诱变剂处理第二步，淘汰野生型第三步，检出缺陷型第四步，鉴定缺陷型当前98页，总共183页。第二步，淘汰野生型选择培养基：野生型不生长，缺陷型生长？MM:野生型生长，缺陷型不长当前99页，总共183页。菌丝过滤法当前100页，总共183页。抗生素法青霉素（细菌）干扰细胞壁的合成当前101页，总共183页。青霉素法（细菌）诱变后菌悬液MM+青霉素野生型缺陷型死亡

幸存CM结果：不长死亡青霉素当前102页，总共183页。诱变后菌悬液洗涤饥饿高渗透压MM+青霉素洗涤CM生长当前103页，总共183页。夹层培养法限量补充培养法逐个检出法影印平板法第三步，检出缺陷型当前104页，总共183页。夹层培养法当前105页，总共183页。逐个检出法当前106页，总共183页。影印平板法当前107页，总共183页。CompletemediumMinimalmedium当前108页，总共183页。第四步，鉴定缺陷型当前109页，总共183页。Ames试验“生物化学统一性”法则：人和细菌在DNA的结构及特性方面是一致的，能使微生物发生突变的诱变剂必然也会作用于人的DNA，使其发生突变，最后造成癌变或其他不良的后果。诱变剂的共性原则：

化学药剂对细菌的诱变率与其对动物的致癌性成正比超过95%的致癌物质对微生物有诱变作用90%以上的非致癌物质对微生物没有诱变作用当前110页，总共183页。当前111页，总共183页。当前112页，总共183页。当前113页，总共183页。六、基因重组

（Generecombination）基因重组（或遗传重组）：两个独立基因组内的遗传基因，通过一定的途径转移到一起，形成新的稳定基因组的过程。原核微生物的基因重组：转化、转导、接合、原生质体融合等。真核微生物的基因重组：有性杂交、准性杂交、转化、原生质体融合等。当前114页，总共183页。1、Transformation（转化）转化：受体菌（recipientcell）直接吸收供体菌（donorcell）的DNA片段，通过交换，把它整合到自己的基因组中，而获得部分新的遗传性状的现象。转化子（transformant）：通过转化方式而形成的杂种后代。感受态：受体细胞最易接受外源DNA片段并能实现转化的一种生理状态。当前115页，总共183页。转化不是两个细胞的直接接触，而是供体细胞的离体DNA与受体细胞直接接触而转移遗传物质转化包括两个基本过程（1）从供体菌中提取遗传物质DNA并转移到受体中；（2）供体的遗传物质在受体中的作用。当前116页，总共183页。当前117页，总共183页。当前118页，总共183页。当前119页，总共183页。当前120页，总共183页。人工转化用CaCl2处理细胞，电穿孔等是常用的人工转化手段。在自然转化的基础上发展和建立的一项细菌基因重组手段，是基因工程的奠基石和基础技术。用多种不同的技术处理受体细胞，使其人为地处于一种可以摄取外源DNA的“人工感受态”。当前121页，总共183页。噬菌体DNA被感受态细胞摄取并产生有活性的病毒颗粒转染(transfection)提纯的噬菌体DNA以转化的（而非感染）途径进入细胞并表达后产生完整的病毒颗粒。特点：当前122页，总共183页。2、接合(conjugation)定义：供体菌通过性菌毛与受体菌直接接触，把F质粒或其携带的不同长度的核基因组片段传递给后者，使后者获得若干新遗传性状的现象，称为接合。通过接合而获得新遗传性状的受体细胞，称为接合子。1946年，JoshuaLederberg和EdwardL.Taturm建立的细菌的多重营养缺陷型杂交实验发现了细菌的接合现象。当前123页，总共183页。细菌的多重营养缺陷型杂交实验1）、接合的发现当前124页，总共183页。证实接合过程需要细胞间的直接接触的“U”型管实验（BernardDavis，1950）当前125页，总共183页。BernardDavisUtubeexpreiment，1950当前126页，总共183页。2）、接合机制接合作用是由一种被称为F因子的质粒介导。F因子的分子量通常为5×107

，上面有编码细菌产生性菌毛及控制接合过程进行的20多个基因。当前127页，总共183页。F因子为附加体质粒既可以脱离染色体在细胞内独立存在，也可插入（整合）到染色体上当前128页，总共183页。3）、F因子的四种细胞形式a）F-菌株(“雌性”)，不含F因子，没有性菌毛，但可以通过接合作用接收F因子而变成F+菌株b）F+菌株(“雄性”)，

F因子独立存在，细胞表面有性菌毛c）Hfr菌株，F因子插入到染色体DNA上，细胞表面有性菌毛。d）F′菌株，Hfr菌株内的F因子因不正常切割而脱离染色体时，形成游离的但携带一小段染色体基因的F因子，特称为F′因子。细胞表面同样有性菌毛。当前129页，总共183页。

①F+×F-杂交F+菌株的F因子向F-细胞转移，但含F因子的宿主细胞的染色体DNA一般不被转移。当前130页，总共183页。杂交的结果供体细胞和受体细胞均成为F+细胞当前131页，总共183页。F+×F-杂交F+菌株的F因子向F-细胞转移，但含F因子的宿主细胞的染色体DNA一般不被转移。①F+细菌通过性毛与F-细菌接触并发生相互作用；②F+细菌的F因子出现缺口，双链之一被切断，从断端以“滚环模型”转移F因子的一条链到F-细菌中。③F因子的一条链一进入F-细菌中，就在F-细菌中合成互补双链，经环化后形成新的F质粒。④复制完成后，F-细菌变成F+，同时原有F+细胞也完成F因子另一条链的复制，所以转移是F+的拷贝。所以最终杂交的结果是F-细菌变成F+细菌，而原有的F+细菌则不变。当前132页，总共183页。Hfr菌株的F因子插入到染色体DNA上，因此只要发生接合转移过程，就可以把部分甚至全部细菌染色体传递给F-细胞并发生重组，由此而得名为高频重组菌株。②Hfr×F-杂交当前133页，总共183页。Hfr菌株仍然保持着F+细胞的特征，具有F性菌毛，并象F+一样与F-细胞进行接合。所不同的是，当OriT序列被缺刻螺旋酶识别而产生缺口后，F因子的先导区(leadingregion)结合着染色体DNA向受体细胞转移。F因子除先导区以外，其余绝大部分是处于转移染色体的末端，由于转移过程常被中断，因此F因子不易转入受体细胞中。Hfr×F-杂交后的受体细胞(或接合子)大多数仍然是F-当前134页，总共183页。中断杂交（interruptedmating）技术利用Hfr×F-的接合过程，在不同时间取样，并把样品猛烈搅拌以分散接合中的细菌，然后分析受体细菌基因型，以时间(分钟)为单位绘制遗传图谱，该图谱是细菌染色体上基因顺序的直接反映。当前135页，总共183页。当前136页，总共183页。3、Transduction（转导）转导：通过完全缺陷或部分缺陷噬菌体的媒介，把供体细胞的小片段DNA携带到受体细胞中，通过交换和整合，使后者获得前者部分遗传性状的现象。当前137页，总共183页。转导的种类

完全普遍转导低频转导转导普遍转导局限转导流产普遍转导高频转导当前138页，总共183页。1、普遍性转导（generalizedtransduction）噬菌体可以转导供体染色体的任何部分到受体细胞中的转导过程(1)意外的发现1951年，JoshuaLederberg和NortonZinder为了证实大肠杆菌以外的其它菌种是否也存在接合作用，用二株具不同的多重营养缺陷型的鼠伤寒沙门氏菌进行类似的实验：用“U”型管进行同样的实验时，在供体和受体细胞不接触的情况下，同样出现原养型细菌！当前139页，总共183页。当前140页，总共183页。当前141页，总共183页。沙门氏菌LT22A是携带P22噬菌体的溶源性细菌另一株是非溶源性细菌一个表面看起来的常规研究却导致一个惊奇和十分重要发现的重要例证！基因的传递很可能是由可透过“U”型管滤板的P22噬菌体介导的（普遍性转导这一重要的基因转移途径的发现）当前142页，总共183页。1）、普遍转导（generalizedtransduction）通过完全缺陷噬菌体对供体菌任何DNA小片段的“误包”而实现其遗传性状传递至受体菌的转导现象，称为普遍性转导当前143页，总共183页。普遍性转导的三种后果：外源DNA被降解，转导失败进入受体的外源DNA通过与细胞染色体的重组交换而形成稳定的转导子流产转导当前144页，总共183页。形成转导颗粒的噬菌体可以是温和的也可以是烈性的，但必须具有能偶尔识别宿主DNA的包装机制并在宿主基因组完全降解以前进行包装。普遍性转导的基本要求当前145页，总共183页。

原因：完全缺陷噬菌体感染受体后，所携带的DNA片段没有和受体菌的DNA片段交换、整合、复制，但可以转录、翻译产生相应的代谢产物，有相应的表型

结果：受体菌再经分裂、繁殖，子一代只有一半获得供体菌的DNA片段，另一半仅得到部分代谢产物表现出轻微的供体菌特征，在继续分裂的过程中，逐渐被稀释，此现象称为流产普遍转导

（2）流产转导（abortivetransduction）当前146页，总共183页。DNA不能复制，因此群体中仅一个细胞含有DNA，而其它细胞只能得到其基因产物，形成微小菌落。特点：在选择培养基平板上形成微小菌落当前147页，总共183页。当前148页，总共183页。Specializedtransduction（局限转导）定义：通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因携带到受体菌中，并与后者的基因组整合、重组，形成转导子的现象。缺陷噬菌体的形成方式：脱离宿主核染色体时，发生低频率的误切。当前149页，总共183页。2.局限性转导特点：●噬菌体对供体菌和受体菌都是温和噬菌体●只能转导供体菌的个别特定基因（一般为噬菌体整合位点两侧的基因）●该特定基因由部分缺陷的噬菌体携带当前150页，总共183页。局限转导的过程温和噬菌体感染整合到细菌染色体的特定位点上宿主细胞发生溶源化溶源菌因诱导而发生裂解时，在前噬菌体两侧的少数宿主基因因偶尔发生的不正常切割而连在噬菌体DNA上部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因转移到受体菌中当前151页，总共183页。Specializedtransduction当前152页，总共183页。Specializedtransduction当前153页，总共183页。2、局限性转导（specializedtransduction）温和噬菌体λ裂解时的不正常切割：包含gal或bio基因（几率一般仅有10-6）当前154页，总共183页。局限性转导与普遍性转导的主要区别a）局限性转导被转导的基因共价地与噬菌体DNA连接，与噬菌体DNA一起进行复制、包装以及被导入受体细胞中。而普遍性转导包装的可能全部是宿主菌的基因b）局限性转导颗粒携带特定的染色体片段并将固定的个别基因导入受体，故称为局限性转导。而普遍性转导携带的宿主基因具有随机性2、局限性转导（specializedtransduction）当前155页，总共183页。

溶源转变（lysogenicconversion）一个与转导相似又不同的现象温和噬菌体感染细胞后使之发生溶源化，因噬菌体的基因整合到宿主染色体上，而使后者获得了新性状的现象溶源转变与转导的不同？a）不携带任何供体菌的基因b）这种噬菌体是完整的，而不是缺陷的当前156页，总共183页。比较项目普遍性转导局限性转导能够转导的基因供体菌的几乎任何一个基因供体菌的少数基因。

噬菌体的位置不整合到寄主染色体的特定位置上整合到寄主染色体的特定位置上转导噬菌体的获得转导噬菌体可通过裂解反应或诱导溶源性细菌得到转导噬菌体只能通过诱导溶源性细菌得到。

转导子的性质转导子是属于非溶源型的转导子是属于缺陷溶源型的转导的物质主要是供体菌的DNA转导的物质有供体的DNA，也有噬菌体DNA，但以噬菌体为主。当前157页，总共183页。转导育种利用转导法选育目的菌，首要的任务是：获得转导噬菌体转导噬菌体的获得噬菌体侵染供体菌后，在感染末期，少数噬菌体会将供体菌的DNA误认为是它们自己的DNA，并以其外壳蛋白将细菌DNA包围起来，从而形成转导噬菌体。选择性标记：由于细菌DNA的任何部分都可以被包装，因此，要获得目的转导子必须要通过那些选择性标记。当前158页，总共183页。它们没有将宿主溶源化的能力，而是使宿主成为一个局限转导子，对噬菌体没有免疫性。当前159页，总共183页。外源DNA的来源及进入途径有差异原核微生物的几种基因重组方式汇总当前160页，总共183页。当前161页，总共183页。4、原生质体融合（Protoplastfusion）原生质体融合：通过人为的方法，使遗传性状不同的两个细胞的原生质体发生融合，借以获得兼有双亲遗传性状的稳定重组子的过程。当前162页，总共183页。（1）原生质体制备：亲本菌株须：①具有良好生产性状；②具有一些稳定的明显的遗传标记。

离心收集对数后期菌体，破壁，使用渗透压稳定剂（甘露醇、山梨醇、蔗糖、氯化钾、氯化钠等）进行保护，离心收集原生质体。2、原生质体融合的主要步骤当前163页，总共183页。（2）原生质体融合：加入促融合剂-聚乙二醇（PEG）及Ca2+、Mg2+，使原生质体表面形成电极性，相互易于吸引，形成聚集物。（3）再生成正常细胞：融合后的原生质体不具细胞壁，不能在普通培养基上增殖，无法表现，必须使其重新形成壁。再生培养基必须具有与原生质体体内相同渗透压，常用含Ca2+、Mg2+及渗透压稳定剂的完全培养基。（4）检出融合细胞；通过选择性培养基（5）筛选优良性状的融合子。进行生物测定当前164页，总共183页。原生质体融合当前165页，总共183页。适用范围：各种生物细胞都能进行原生质体融合，包括各种原核生物、真核微生物以及高等动植物和人体的不同细胞。意义：70年代后发展的一种育种新技术，继转化、转导和接合之后一种更有效的转移遗传物质的手段。原生质体融合不仅能在不同菌株或种间进行，还能做到属间、科间甚至更远缘的微生物或高等生物细胞间的融合。发展点：有关原生质体融合的遗传机制，尚未研究清楚，目前还在探索中。当前166页，总共183页。5、有性杂交（Sexualhybridization）有性杂交：不同遗传型的两性细胞间发生的接合和随之进行的染色体重组，进而产生新遗传型后代的一种育种技术。当前167页，总共183页。6、准性杂交（Parasexualhybridization）准性杂交：同种生物两个不同菌株的体细胞发生融合，且不以减数分裂的方式而导致低频率的基因重组并产生重组子。当前168页，总共183页。准性生殖①菌丝联结②异核体形成（质配）③核配形成杂合二倍体④体细胞交换和单倍体化。当前169页，总共183页。项目准性生殖有性生殖参与接合的亲本细胞形态相同的体细胞形态或生理上有分化的性细胞独立生活的异核体阶段有无接合后双倍体的细胞形态与单倍体基本相同与单倍体明显不同双倍体变为单倍体的途径通过有丝分裂通过减数分裂接合发生的几率偶然发现，几率低正常出现，几率高

准