实验1大肠杆菌的培养与分离

实验目的:1.进行大肠杆菌的扩增，利用液体培养基进行细菌培养的操作2.进行大肠杆菌的分离,用固体平板培养基进行细菌的划线培养3.说明大肠杆菌培养的条件和操作要求的原理当前1页，总共49页。特点：结构都相当简单,个体多数十分微小.通常要用光学显微镜或电子显微镜才能看到，有的甚至没有细胞结构.微生物包括哪五类：病毒细菌放线菌真菌原生动物原核生物界原生生物界真菌界病毒界一、基础知识：

(一)微生物：是一切肉眼看不见或看不清楚的微小生物的总称．当前2页，总共49页。(二)细菌的常识1、结构2、分裂3、生殖4、变异类型5、在基因工程中的应用当前3页，总共49页。大肠杆菌当前4页，总共49页。细菌的外形与大小大肠杆菌属于杆状菌图1-1常见的三种细菌典型形态A.球菌B.杆菌C.弧菌当前5页，总共49页。根据细菌所利用的能源和碳源的不同将细菌分为两大营养类型。自养菌:异养菌:腐生菌寄生菌大部分病原菌细菌的营养类型光能自养型:光合细菌化能自养型:硝化细菌,铁细菌,硫细菌大肠杆菌属于异养兼性厌氧菌当前6页，总共49页。细菌的革兰氏染色革兰氏染色法是一种用于细菌的染色法。此法将细菌分为两类，即革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。所谓革兰氏阳性菌就是用革兰氏染液染色后，再用脱色液处理，细菌仍保留染色液的颜色；革兰氏阴性菌则相反。这两种菌的差别在于细胞壁的成分不同。大肠杆菌属于革兰氏阴性菌当前7页，总共49页。☆

培养基

培养基（培养液）是由人工方法配制而成的，专供微生物生长繁殖使用的混合营养液。固体培养基和液体培养基、半固体培养基。1.培养基的类型(三)细菌的培养成分区别：琼脂当前8页，总共49页。2.不同的微生物往往需要采用不同的培养基配方3.不管哪种培养基，一般都含有水、碳源、和氮源、无机盐、生长因子等营养物质，另外还需要满足微生物生长对pH、氧气、渗透压的要求．细菌喜荤，霉菌喜素大肠杆菌配方：酵母提取物

0.25g蛋白胨

0.5gNacl

0.5g琼脂

1g水:50ml当前9页，总共49页。4.培养基的用途液体培养基：扩增细菌、工业生产固体培养基：纯化（分离），鉴定、保藏菌种当前10页，总共49页。单个或少数细菌在固体培养基上大量繁殖时，就会形成一个肉眼可见的，具有一定形态结构的子细胞群体，叫做菌落。菌落是鉴定菌种的重要依据。☆菌落

当前11页，总共49页。液体培养基：表面生长均匀混浊生长沉淀生长当前12页，总共49页。☆无菌技术1.无菌技术的概念

无菌操作泛指在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法。成功地培养微生物的关键。当前13页，总共49页。（１）消毒定义：2.消毒与灭菌的概念及两者的区别

（2）灭菌的定义：3.常用的消毒与灭菌的方法是指杀灭大部分病原微生物的方法。是指杀灭或清除环境中一切微生物（包括芽胞、孢子）的方法当前14页，总共49页。消毒的方法：1、100℃煮沸5-6min2、巴氏消毒法：70-75℃下煮30min或80℃下煮15min3、用75%酒精、新洁尔灭等进行皮肤消毒4、氯气消毒水源5、紫外线消毒……当前15页，总共49页。灭菌的方法：1、灼烧灭菌2、干热灭菌：160-170℃下加热1-2h。3、高压蒸气灭菌：100kPa、121℃下维持15-30min.当前16页，总共49页。1、灼烧灭菌灭菌的方法：当前17页，总共49页。2、干热灭菌：160-170℃下加热1-2h。3、高压蒸气灭菌：100kPa、121℃下维持15-30min.当前18页，总共49页。1.无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？2.请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。（1）培养细菌用的培养基与培养皿（2）玻棒、试管、烧瓶和吸管（3）实验操作者的双手答：无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。答：（1）、（2）需要灭菌；（3）需要消毒。思考当前19页，总共49页。实验用具LB固体培养基大肠杆菌菌液（LB液体培养基）培养皿接种环酒精棉酒精灯镊子、火柴、记号笔当前20页，总共49页。当前21页，总共49页。配制培养基包器材灭菌菌种扩增倒平板接种、划线培养观察记录实验流程当前22页，总共49页。二、大肠杆菌的培养和分离实验操作（一）培养基的配置与灭菌取2个250ml的三角瓶中分别装入50mlLB液体培养基和50mlLB固体培养基（刚配好，尚未凝固），加上封口膜，牛皮纸包装后高压锅灭菌15min。LB液体培养基——细菌的扩大培养LB固体培养基——细菌的划线分离封口膜：既通气又不使菌进入当前23页，总共49页。（二）倒平板灭菌后的培养基在无菌操作台上倒入4个培养皿中，倒后立即置于水平位置上，轻轻晃动，使培养基铺满平皿底部，待凝，使之形成平面当前24页，总共49页。注意事项：1.培养基灭菌后，需要冷却到60℃左右时，才能用来倒平板2.灭菌及消毒：无菌操作台用超净紫外灯和过滤风灭菌；桌面及人手用酒精棉球消毒

3.操作时右手无名指和小指夹住封口膜,另外三指持三角瓶,左手拿培养皿并打开上盖的一边,在酒精灯火焰旁操作.4.需要使锥形瓶的瓶口通过火焰，灼烧灭菌5.平板冷凝后，要将平板倒置,既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染.当前25页，总共49页。（三）大肠杆菌的扩大培养将斜面上培养的大肠杆菌菌种接种到灭菌后的液体培养基中,使其在37℃摇床培养12小时。注意事项:1.火焰旁从斜面上用接种环取菌;2.取菌前接种环要用酒精灯灼烧灭菌,冷却后方能取菌;3.取菌后封口膜和棉塞复原.当前26页，总共49页。菌种扩增摇床震荡培养12h（于LB液体培养基中）本图来自十一学校当前27页，总共49页。（四）大肠杆菌的划线分离分离方法:划线分离法和涂布分离法当前28页，总共49页。1、划线分离法无菌操作台上用接种环取菌后在固体培养基的平板上连续划线.当前29页，总共49页。平板划线的操作当前30页，总共49页。不能使用脱脂棉，否则容易吸水，造成污染。当前31页，总共49页。一旦划破，会造成划线不均匀，难以达到分离单菌落的目的；二是存留在划破处的单个细胞无法形成规矩的菌落，菌落会沿着划破处生长，会形成一个条状的菌落。当前32页，总共49页。当前33页，总共49页。当前34页，总共49页。（四）大肠杆菌的划线分离注意事项:1.接种环只蘸一次菌液,但要在培养基不同位置连续划线多次.2.划线首尾不能相接3.划线后,培养皿倒置培养12~24h1、划线分离法当前35页，总共49页。当前36页，总共49页。问题讨论

1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？

答：操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。当前37页，总共49页。2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？答：以免接种环温度太高，杀死菌种。3.在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？答：划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。当前38页，总共49页。分离后,一个菌体便会形成一个菌落,这是消除污染杂菌的通用方法,也是用于筛选高表达量菌株的最简便方法之一当前39页，总共49页。2、涂布分离法:是指将培养的菌液稀释一定的倍数,然后取一定量稀释液加在固体培养基上,用玻璃刮刀涂布在培养基平面上.当前40页，总共49页。当前41页，总共49页。划线分离法和涂布分离法哪个更好呢？划线分离：方法简单，但单菌落较难分开。涂布分离：单菌落更易分开，但操作复杂。当前42页，总共49页。（五）大肠杆菌分离后保存1、临时保藏：接种到固体斜面培养基，菌落长成后置于4℃冰箱保存。2、长期保存：甘油冷冻管藏法当前43页，总共49页。1.如何操作才可以尽量避免被杂菌污染?(1)胆大心细，操作快捷。（2）注意灭菌操作原则，灭菌彻底，降低环境污染概率。（3）注意微生物生长条件，如PH、渗透压、温度等。细菌喜碱，喜蛋白质，喜37度；霉菌喜酸，喜糖，喜25-30度当前44页，总共49页。2.在培养后如何判断是否有杂菌污染?（1）菌落的形态看，是否湿润，透明，粘稠，颜色等。是区别细菌、酵母、放线菌和霉菌关键指标。（2）显微镜观察其形态、大小、看是否有菌丝、孢子、芽孢。是区别细菌、酵母、放线菌和霉菌关键指标。（3）上述方法较难区别同类的不同物种，需借助化学和进一步的形态观察，如用革兰氏染色法等。当前45页，总共49页。3.进行恒温培养时为什么要将培养皿倒置?恒温培养时，培养基中的水分会以水蒸气的形式蒸发，倒放培养皿则会使水蒸气凝结成水滴留在盖上；如果正放，则水分形成的水滴会落入培养基表面并扩散开。如果培养皿中已形成菌落，则会导致菌随水扩散，很难再分成单菌落，达不到分离目的。当前46页，总共49页。4.实验完成后,接种过细菌的器皿应如何处理?所有接触过菌的器皿都要先高压灭菌后再洗涤（特别是培养基）；使用后的废弃物也要高压灭菌后再抛弃当前47页，总共49页。5.如果分离的是转基因的大肠