基因工程基因工程的工具酶

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:glzhou@:448953745基因工程

GeneticEngineering1当前1页，总共165页。Office:Room409ofExperimentBuildingNo.3

:06358230050,

:glzhou@:448953745第2章基因工程的工具酶2当前2页，总共165页。Enzymesinvolvedingeneticengineering1.Restrictionenzymes-cuttingDNA（切割）基因工程中常用的三大类工具酶分别与DNA的切割、修饰、连接有关。2.DNAmodifyingenzymes

（修饰）3.DNAligase-joiningDNA（连接）Nucleases（核酸酶）Polymerases（聚合酶）EnzymesthatmodifytheendsofDNAmolecules

（末端修饰酶）当前3页，总共165页。基因工程中常用的三大类酶分别与DNA的修饰、切割、连接有关。当前4页，总共165页。Contents1.限制性核酸内切酶2.DNA修饰酶3.DNA连接酶当前5页，总共165页。重点与难点内容各种工具酶概念及其基本性质各种工具酶在基因工程中的应用限制酶与修饰酶重点基因工程工具酶的应用难点当前6页，总共165页。1.Restrictionendonuclease（限制性核酸内切酶）一类能识别dsDNA分子内部的特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸酶来源：主要从原核生物中分离纯化而来II型核酸内切酶：2300种以上，可识别230种不同的DNA序列（1994年，美国，分子生物学百科全书）目前发现有限制性内切酶的生物主要是细菌，少数霉菌和蓝藻。Todate,over10000microbesfromaroundtheworldhavebeenscreenedforrestrictionenzymes.Fromthese,over3000enzymeshavebeenfoundrepresentingapproximately200differentsequencespecificities.*当前7页，总共165页。Discoverofrestractionendonulease这种大自然赋予基因工程学家的了不起的礼物是如何发现的呢?当前8页，总共165页。1.1寄主控制的限制与修饰限制

（Host-controlledrestrictionandmodification）大多数的细菌对于噬菌体的感染都存在这一些功能性障碍。如：目前尚未发现有任何一种既可感染假单胞菌又可感染大肠杆菌的噬菌体，且非寄主细菌的RNA聚合酶不能够识别“外源”噬菌体的启动子，即使噬菌体的吸附和转录能进行，也仍然存在这一功能障碍——即为寄主控制的限制和修饰现象——吴乃虎，基因工程（第二版，上册），P122*当前9页，总共165页。1.1寄主控制的限制与修饰限制

（Host-controlledrestrictionandmodification）瑞士学者W.Arber1952年发现这种现象，1978年获得诺贝尔奖。WernerArber*这种现象类似于人体的免疫系统，它可辨别自身的DNA和外来的DNA，并使后者降解——它是限制性内切酶被发现的基础。当前10页，总共165页。PhenomenonKλ（B）λ（K）λ（B）：能够在大肠杆菌B菌株上生长的λ噬菌体第一次感染K菌株，形成的噬菌斑很少，生长受寄主限制Kλ（K）存活下来的噬菌体再次感染K菌株，则形成的噬菌斑很多，不受限制为什么呢？当前11页，总共165页。说明K和B菌株中存在一种限制系统可排除外来的DNA；10-4的存活率是由宿主修饰系统作用的结果

EOP:Efficiencyofplating(生长在不同寄主中的λ噬菌体的成斑率，表示限制程度)。当前12页，总共165页。当前13页，总共165页。Whatisthereason研究发现：原来是由两种酶配合完成，一种是起修饰作用的甲基化酶，另一种是核酸内切酶（1962年）？甲基化酶：能使自身的内切酶识别序列的碱基发生甲基化，从而使自身DNA免受内切酶切割而降解——细菌的“防御”系统（盾）核酸内切酶：识别并切割酶解外源DNA（外来核酸在内切酶识别序列上没有甲基化修饰作保护）（矛）限制一修饰体系：其功能就是保护自身的DNA，分解外来的DNA当前14页，总共165页。用这两种酶来解释：

Host-controlledrestrictionandmodification再次感染K菌株，则形成的噬菌斑很多，不受限制（因为菌株的甲基化酶已经对其进行了修饰，加以保护）λ（B）噬菌体感染大肠杆菌K菌株后，形成的嗜菌斑非常少（因为其DNA大部分被胞内的内切酶降解了，但有极少部分能在特定序列甲基化，避免被酶解，因此有少量噬菌斑形成。）*Kλ（B）λ（K）Kλ（K）当前15页，总共165页。是指一定类型的细菌可以通过限制性内切酶的作用，降解入侵的外源DNA(如噬菌体DNA等)，使得外源DNA对生物细胞的入侵受到限制。*限制作用当前16页，总共165页。是指生物细胞(如宿主)自身的DNA分子合成后，通过甲基化酶的修饰，免遭自身限制性酶的破坏。限制一修饰体系，其功能就是保护自身的DNA，分解外来的DNA，以保护和维持自身遗传信息的稳定，这对细菌的生存和繁衍具有重要意义。*修饰作用当前17页，总共165页。1.2限制性内切酶的类型

Typesofrestrictionandmodification(R-M)systemTypeI(1%):种类少TypeII:98%TypeIII:(<1%)I型和III型:通常都是大型的多亚基的蛋白复合物，既有内切酶的活性，又有甲基化酶活性。辅助因子也较多，除了镁离子外，还需要ATP和S-腺苷甲硫氨酸（SAM），这样才能表现出正常的限制活性。当前18页，总共165页。TypeIRE识别位点：未甲基化修饰的15bp左右特异序列，非对称性。酶切位点：在距离特异性识别位点约1000—1500bp处随机切开一条单链当前19页，总共165页。作用机理：需ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）。I型限制性内切酶具有极强的ATPase的活性，每打开一个磷酸二脂键就需要消耗1000个分子的ATP。因酶切位点不特异，在基因工程中无意义【★】

。当前20页，总共165页。TypeIII

REIII型限制性内切酶兼有限制-修饰两种功能，可以特异地识别DNA，但酶切位点在识别位点下游5～15bp的地方。辅酶：ATP和Mg2+在基因工程的意义？？当前21页，总共165页。TypeIIRE：基因工程中重要的工具酶！！精彩马上开始！当前22页，总共165页。（一）TypeIIRE：限制性内切酶的性质特征1.Recognitionsequencessize：4-8bp，多数6bp*2.结构特征：rotationalsymmetry-“palindromes”（旋转对称的回文结构）3.切割后产生的末端：CohesiveterminusorBluntend（粘性末端或平末端）当前23页，总共165页。例1：EcoRI的识别序列回文序列：指在双链DNA序列中按确定的方向阅读，双链中的每一条链的序列都是相同的。Recognitionsequence(识别序列)当前24页，总共165页。简并识别序列有些酶的识别序列不是一个，而是多个。在基因重组时要尽量少用这些酶例2：当前25页，总共165页。Cuttingsite（切割位点）切割位点多数在识别序列的内部，少数在两端，部分在两翼。部分在两翼少数两侧/端多数在内部当前26页，总共165页。当前27页，总共165页。Sitepreference（偏爱位点）CertainrestrictionendonucleasesshowpreferentialcleavageofsomesitesinthesameDNAmolecule.相同的DNA分子，有些限制性内切酶会对一些位点表现出偏爱性的切割。这些位点就是限制性内切酶的偏爱位点。切割位点两侧序列的核苷酸组成与切割效率有关，即某些限制酶对同一介质中的有些位点表现出偏爱性切割。*当前28页，总共165页。Sitepreference（偏爱位点）原因1.边界碱基的辅助识别：与识别序列邻近的特异性边界碱基可以提高酶切速度，对酶的识别起到辅助作用。2.甲基化：限制酶识别序列内或其附近的胞嘧啶、腺嘌呤或尿嘧啶被甲基化后，会阻碍限制酶的活性。（限制与修饰现象。受甲基化影响的酶在商品说明书中都会有标示。）3.底物的构象：DNA分子的不同构型对限制酶的活性也有很大影响。有些酶切割超螺旋DNA和线状DNA时会表现出差异。*当前29页，总共165页。Cohesiveterminusandbluntend（粘性或平末端）1.Cohesiveterminus(end)(粘性末端）：在对称轴5’侧或3’切割底物,使得DNA双链交错断开，产生具有互补碱基的单链延伸末端结构，它们能够通过互补碱基间的配对而重新环化起来。*2.Bluntorflushend(平端)：在对称轴上同时切割DNA的两条链，产生的末端平整，不易于重新环化。3.非互补的粘性末端：酶切位点在识别序列之外的。当前30页，总共165页。①5’粘性末端(protruding5'ends)当前31页，总共165页。②3’粘性末端(protruding3'ends)当前32页，总共165页。③平末端（BluntEnd）当前33页，总共165页。④非互补的粘性末端当前34页，总共165页。粘性末端的意义或者在基因工程中的作用①连接便利a)不同的DNA双链：只要粘性末端碱基互补就可以连接。这比连接两个平末端要容易的多。b)同一个DNA分子内连接：通过两个相同的粘性末端可以连接成环形分子。当前35页，总共165页。②末端标记a)凸出的5’末端可用DNA多核苷酸激酶进行32P标记。或者用DNA聚合酶补平5’粘性末端来标记。b)凸出的3’末端可以通过末端转移酶添加几个多聚核苷酸的尾巴（如AAA或TTT等）造成人工粘性末端或标记。③补平或削平成平末端5’粘性末端可以用DNA聚合酶补平成平末端。3’粘性末端可以用T4DNAPol或S1酶削平成平末端。当前36页，总共165页。（二）TypeIIRE：稀切酶、同裂酶与同尾酶稀切酶（rarecuttingenzymes）在DNA分子中出现的几率低，故称之为稀切酶。识别序列比较长；富含AT或富含GC。当前37页，总共165页。同裂酶(Isoschizomer)【★】

来源不同的II型限制性内切酶，具有相同的识别序列时，称为同裂酶(Isoschizomer)。有2种情况：①酶切以后的残端完全相同：②酶切以后的残端不同：当前38页，总共165页。同尾酶(Isocandamers)【★】

来源不同，识别序列也各不相同，但酶切以后的残端相同，这种情况称为同尾酶(Isocandamers).由同尾酶所产生的DNA片段可通过粘性末端之间的互补作用而连接。在基因克隆中很有用！当前39页，总共165页。同尾酶的粘性末端互相结合后开成的新位点一般不能在被原来的酶识别,WHY？Q：你能推断出这两个酶的识别序列吗？I当前40页，总共165页。Qize用限制酶将Sau3AI(↓GATC)切割的DNA与经BamHI(G↓GATCC)切割的DNA连接起来后，能够被BamHI切割的几率有多少？当前41页，总共165页。（三）TypeIIRE：切点在DNA上出现的频率II型限制性内切酶的酶切位点在DNA上出现的频率受DNA的长度、识别位点的长度以及GC含量的影响。4bp的识别位点：1/44＝256bp如：HaeIIIGGCC6bp的识别位点：1/46＝4096bp如EcoRIGAATTC当前42页，总共165页。（四）TypeIIRE：甲基化对活性的影响大多数大肠杆菌菌株中含有Dam甲基化酶和Dcm甲基化酶，前者可以在GATC序列中腺嘌呤N-6位上引入甲基，后者在CCA/TGC序列的第一个胞嘧啶C-5位置上引入甲基。部分限制性内切酶对甲基化的DNA不能切割，如FbaI和MboI等。而要解除这种限制修饰作用通常有两种方法：当前43页，总共165页。①选用上述酶的同功酶，如Sau3AI，DNA识别切割位点与MboI相同，但不受甲基化影响；②利用甲基化酶缺失的受体细胞进行DNA的制备，如E.coliJM110和链霉菌等，前者Dam和Dcm甲基化酶已敲除，而后者细胞内本就没有甲基化酶，从这些细胞中抽提的DNA就能被上述酶切割。当前44页，总共165页。（五）TypeIIRE：对单链DNA的活性对单链DNA没有作用，但局部有双链结构时可以特异性地切断。DNA和RNA的杂交产物也是双链结构。可以切断。当前45页，总共165页。（五）TypeIIRE：对寡核苷酸的活性尽管是双链、有识别位点，但因为太短，酶不能与DNA有效结合，所以不能切割。当2个酶切位点距离非常近的时候，它们之间由于竞争结合位点，所以也会相互干扰。当前46页，总共165页。（六）TypeIIRE：Nomenclature(命名法)Thespeciesnameofthehostorganismisidentifiedbythefirstletterofthegenusnameandthefirsttwolettersofthespecificepithet

togenerateathree-letterabbreviation.Thisabbreviationisalwayswritteninitalics（属名的第一个字母+种名的头两个字母，拉丁文）.Whereaparticularstrainhasbeenthesourcethenthisisidentified.（菌株型号）WhenaparticularhoststrainhasseveraldifferentR-Msystems,theseareidentifiedbyromannumerals（在这个宿主中发现内切酶的顺序，罗马数字）.*当前47页，总共165页。注意：前三个字母一定要用斜体，各字之间没有空格！当前48页，总共165页。（七）TypeIIRE：reactivesystem（反应系统）Substrate(底物)：纯，线性，有保护序列Enzyme(酶)：样品，识别序列的密度，容积活性Buffer(反应缓冲液)。DNA（2ug/ul）5ul10X反应液5ul酶（5ug/ul）5ulddH2O

35ul总体积50μL37℃保温2-3小时（时间不定）当前49页，总共165页。Substrate（底物）1）DNA纯度：要求较纯因素：蛋白质、乙醇、EDTA、SDS、酚、氯仿以及某些高浓度金属离子措施：增加酶的用量；扩大反应系统体积;延长反应时间；添加亚精胺*当前50页，总共165页。Substrate（底物）核酸限制性内切酶是原核生物限制—修饰体系的组成部分，因此识别序列中特定核苷酸的甲基化作用，便会强烈地影响酶的活性。为避免产生这样的问题，在基因克隆中，所用的载体（质粒DNA）是来源于甲基化酶缺陷型的大肠杆菌菌株。

这样制备的质粒DNA，其中的内切酶识别序列没有甲基化，不受限制。*2)DNA的甲基化程度：不能有甲基化someorallofthesitesforarestrictionendonucleasemayberesistanttocleavagewhenisolatedfromstrainsexpressingtheDcmorDammethylases.

themodificationstateofplasmidDNAcanaffectthefrequencyoftransformationinspecialsituations.

当前51页，总共165页。3）DNA分子构型

效率：线性DNA分子>超螺旋质粒DNA\环状病毒DNA当前52页，总共165页。4）识别序列的侧面序列

限制酶切割DNA，对识别序列两侧的非识别序列有长度要求，只含识别序列的寡核苷酸其酶切效率很低，故PCR扩增目的序列时通常要在识别序列两侧多加若干个核苷酸，以便扩增后的序列方便切割（例：见下图）*当前53页，总共165页。Incorporationofextrasequenceatthe5’endofaprimer.Twoprimershavesequencesdesignedtohybridizeattheendsofthetargetregion.Primer1hasanextrasequencenearits5’endwhichformsaHindIIIsite(AAGCTT),andprimer2hasanextrasequencenearits5’endwhichformsanEcoRI(GAATTC)site.Eachprimerhasanadditional5’-terminalsequenceoffournucleotidessothatthehexanucleotiderestrictionsitesareplacedwithintheextremeendsoftheamplifiedDNA,andsopresentgoodsubstratesforendonucleasecleavage.当前54页，总共165页。小提示：试剂公司提供的包装说明书会标明酶活性单位数和容积活性，最佳作用条件内切酶决定酶的用量酶本身的催化活性底物DNA的样品1)用量当前55页，总共165页。2)酶活单位1个酶活单位：在最适反应条件下，在20l反应液中反应1小时，使1gDNA（标准DNA）完全消化所需的酶活性称为1个单位。1U核酸内切酶的酶活性：在最佳反应条件下反应1小时，完全水解1μg标准DNA（λDNA

）所需的酶量容积活性：1μL酶液中具有的酶活性单位，即U/μL。当前56页，总共165页。常规缓冲液(10X)

pH，Mg++，DTT/β-ME，①pH:7.0-7.9(at25℃)Tris-HCl②离子强度：NaCl

高中低100mM50mM0③Mg++:10mMMgCl2

，MgAc反应缓冲液对绝大多数限制酶来说，在pH=7.4的条件下，其功能最佳。0-50mM低盐酶100mM中盐酶150mM高盐酶酶活性的正常发挥，是绝对地需要二价的阳离子，通常是Mg2+。当前57页，总共165页。④反应条件大多数核酸内切限制酶的标准反应温度都是37℃一部分为50-65℃，少数25-30℃高温作用酶于37℃时,活性多数为10-50%。小提示：销售商在产品说明中会标明最佳反应温度不同的核酸内切限制酶，具有不同的最适反应温度，而且彼此之间有相当大的变动范围。当前58页，总共165页。（七）TypeIIRE：星号活性（staractivity）Underextremeconditions,suchaselevatedpHorlowionicstrength,restrictionendonucleasesarecapableofcleavingsequenceswhicharesimilarbutnotidenticaltotheirdefinedrecognitionsequence.Thealteredspecificityisknownasstaractivity.高浓度的酶（>100U/g）、高浓度的甘油（>5%）、低离子强度（<25mM）、极端pH值(>pH8.0)等，会使一些核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性（专一性降低），即所谓的staractivity现象低特异性：可在不是原来的识别序列处切割DNA是限制内切酶的一般性质，任何一种限制酶在极端非标准条件下都能切割非典型位点*当前59页，总共165页。引起星号活性的因素①反应体系中甘油的浓度大于5%。②酶用量过大，大于100U/μgDNA。③低离子强度，小于25mmol/L。④高pH，大于8.0。⑤含有机剂，如乙醇、二甲基亚砜、二甲基乙酰胺等。⑥Mn2+、Cu2+、Co2+、Zn2+等非Mg2+的二价离子的存在。常发生星活性的内切酶有：EcoRI、HindⅢ、KpnI、PstI、SalI、HinfI等。当前60页，总共165页。当前61页，总共165页。抑制staractivity的措施①减少酶的用量，避免过量酶切，减少甘油浓度②保证反应体系中无有机溶济或乙醇③提高离子强度到100～150mM(如果不会抑制的话)④降低反应pH至pH7.0⑤使用Mg2+作为二价阳离子*当前62页，总共165页。QuizQ：当两种限制性内切核酸酶的作用条件不同时，若要进行双酶切，应采取什么措施?为什么?注意staractivity，先低盐，后高盐；先低温酶，后高温酶；并且可以直接在换酶前将第一种酶失活，再加第二种酶，否则，易产生星号活性。或使用通用缓冲液同时使用两种酶进行酶切。当前63页，总共165页。（八）TypeIIRE：cuttingDNA单酶切双酶切部分酶切当前64页，总共165页。单酶切法环状DNA分子产生与识别序列数（n）相同的DNA片段，且DNA片段的两末端相同线形DNA分子产生n+1的DNA片段，即：采用一种酶对DNA进行切割当前65页，总共165页。双酶切法即：采用两种酶对DNA进行切割。环状DNA分子完全酶切DNA片段数为两种限制酶识别序列之和:n1+n2线状DNA分子完全酶切DNA片段数为两种限制酶识别序列之和加1:n1+n2+1当前66页，总共165页。重组克隆载体pMD18-T-RIP双酶切电泳图M:λDNA/HindⅢ+EcoRⅠ1:BamHI和SacI双酶切后的重组克隆载体18-T-RIP当前67页，总共165页。部分酶切即：选用的限制性酶对其在DNA分子上的全部识别序列进行不完全的切割。原因：底物DNA纯度低识别序列的甲基化酶用量的不足反应缓冲液不适宜温度不适宜反应时间不足缺点：

影响需要的DNA片段的得率优点：

根据重组设计的需要，专门创造部分酶切的条件，获取需要的DNA片段当前68页，总共165页。当前69页，总共165页。可以通过缩短保温时间、降低反应温度或减少酶用量来实现、增大反应体积。当前70页，总共165页。Quiz当前71页，总共165页。当前72页，总共165页。酶切反应如何终止？消化DNA样品后，在进一步处理DNA样品前往往需要钝化内切酶的活性，钝化大多数限制性内切酶的方法是65℃温浴5分钟。*当前73页，总共165页。1、限制酶十分昂贵！2、限制酶在50%甘油中保存于-20℃最稳定3、尽量减少反应中的加水量4、延长消化时间可使所需酶量减少使用限制酶的注意点：不太常用的限制性内切酶多保存在-70℃，每周或每天用的酶保存在-20℃。有一些酶需要不同的保存条件。小提示：使用限制性内切酶时，一定要将酶保存在冰上。

当前74页，总共165页。（九）TypeIIRE：影响RE活性的因素当前75页，总共165页。当前76页，总共165页。当前77页，总共165页。当前78页，总共165页。①在特异位点上切割DNA，产生特异限制性酶片段。②建立DNA分子的限制酶图谱。③构建基因文库。④用限制酶切出的相同粘性末端，以便重组。⑤改建质粒。（十）TypeIIRE：用途当前79页，总共165页。VariationsoncuttingandjoiningDNAmolecules

（对DNA分子进行切割、连接，综合运用各种酶，可产生不同的变化）ThegenerationofthreenewrestrictionsitesafterfillingintheoverhangsproducedbyendonucleaseEcoRIandligatingtheproductstogether.Notethattherearetwotargetsites,4bpapart,inthereconstitutedmoleculeforendonucleaseTsp509I.各种不同的工具酶组合，会产生不同的效果。这里需要DNA连接酶穿针引线。当前80页，总共165页。小结当前81页，总共165页。当前82页，总共165页。2.DNAmodifyingenzymesOtherenzymesusedingeneticengineeringmaybelooselytermedDNAmodifyingenzymes,withthetermusedheretoincludedegradation,synthesis,andalterationofDNA.Inadditiontorestrictionendonucleases,thereareseveralothertypesofnucleaseenzymesthatareimportantinthemanipulationofDNA.Someofthemostcommonlyusedenzymesaredescribednext.当前83页，总共165页。2.DNA修饰酶Nucleaseenzymesdegradenucleicacidsbybreakingthephosphodiesterbondthatholdsthenucleotidestogether.Restrictionenzymesaregoodexamplesofendonucleases,whichcutwithinaDNAstrand.*2.1Nucleases（核酸酶）当前84页，总共165页。核酸外切酶（exonuclease）

核酸内切酶(endonuclease)核酸酶从核酸链的一端开始按顺序催化降解核苷酸的酶。从核酸链分子内部切割3’，5’磷酸二酯键，使之断裂形成小片段希腊文exo为外部之意，endo为内部之意。*Q：核酸酶与核酶(ribozyme)之间有何区别？介绍几个概念按作用特性的差异,可分为单链的核酸外（内）切酶和双链的核酸外（内）切酶.当前85页，总共165页。2.1.1FourusefulnucleasesApartfromrestrictionenzymes,therearefourusefulnucleasesthatareoftenusedingeneticengineering.TheseareBal31andexonucleaseIII(exonucleases),anddeoxyribonucleaseI(DNaseI)andS1-nuclease(endonucleases).当前86页，总共165页。TheseenzymesdifferintheirprecisemodeofactionandprovidethegeneticengineerwithavarietyofstrategiesforattackingDNA.TheirfeaturesaresummarisedinFig.当前87页，总共165页。Fig.4.5Modeofactionofvariousnucleases.(a)NucleaseBal31isacomplexenzyme.Itsprimaryactivityisafast-acting3exonuclease,whichiscoupledwithaslow-actingendonuclease.WhenBal31ispresentatahighconcentrationtheseactivitieseffectivelyshortenDNAmoleculesfrombothtermini.(b)ExonucleaseIIIisa3exonucleasethatgeneratesmoleculeswithprotruding5termini.(c)DNaseIcutseithersingle-strandedordouble-strandedDNAatessentiallyrandomsites.(d)NucleaseS1isspecificforsingle-strandedRNAorDNA.当前88页，总共165页。具有单链特异的核酸内切酶活性和双链特异的核酸外切酶活性。当前89页，总共165页。Bal31用于定位当前90页，总共165页。应用Bal31

核酸酶诱发DNA分子的缺失突变（a）质粒DNA分子，A区段是准备诱发缺失突变的序列（b）用Bal31核酸酶不同时间长度分别消化线性DNA分子，得到缺失长度不等的分子群体（c）将带有另一种限制性内切酶识别序列的衔接物连接到这些缺失分子上并将它们环化起来（d）新形成的环状质粒分子具有新的限制性内切酶（HindIII）的切点，其A区段有缺失当前91页，总共165页。S1核酸酶的用途1）定位RNA2）用mRNA测定基因中的外显子序列不能配对的内含子区域形成的单链环被S1切掉！当前92页，总共165页。S1核酸酶的活性当前93页，总共165页。S1定位RNA当前94页，总共165页。当前95页，总共165页。当前96页，总共165页。当前97页，总共165页。2.1.2其它核酸外切酶1）大肠杆菌核酸外切酶VII（单链）能从5’或3’末端降解DNA分子,而且是所讨论的唯一的不需要Mg2+的核酸酶.当前98页，总共165页。2）大肠杆菌核酸外切酶III（双链）1.特点：来自E.coli，主要作用于ds-DNA,3’→5’外切酶活性，不降解ss-DNA.2.催化反应类型（1）外切酶活性（2）核酸酶H活性（RNaseH活性）（3）内切酶活性3.用途（1）核酸（DNA）标记（2）产生缺口（3）DNA序列顺序缺失

(4)还可作为双脱氧DNA序列分析法的反应底物,即制备单链DNA模板.

当前99页，总共165页。2）大肠杆菌核酸外切酶III（双链）RNaseH活性当前100页，总共165页。当前101页，总共165页。当前102页，总共165页。当前103页，总共165页。3）λ噬菌体核酸外切酶（双链核酸外切酶）从单、双链DNA的5’-PO4基末端逐步切下5’-PO4

单核苷酸，不能降解5’-OH端主要用途是将双链DNA变为单链，供测序使用；除去5’-端突起，产生3’-端突起，便于加尾当前104页，总共165页。当前105页，总共165页。2.1.3RibonucleasesInadditiontoDNA-specificnucleases,thereareribonucleases(RNases),whichactonRNA.ThesemayberequiredformanyofthestagesinthepreparationandanalysisofrecombinantsandareusuallyusedtogetridofunwantedRNAinthepreparation.当前106页，总共165页。However,aswellasbeinguseful,ribonucleasescanposesomeunwantedproblems.Why?当前107页，总共165页。Theyareremarkablydifficulttoinactivateandcanbesecretedinsweat.Thus,contaminationwithRNasescanbeaprobleminpreparingrecombinantDNA,particularlywherecDNAispreparedfromanmRNAtemplate.当前108页，总共165页。InthiscaseitisvitaltoavoidRNasecontaminationbywearingglovesandensuringthatallglassandplasticequipmentistreatedtoavoidribonucleasecontamination.当前109页，总共165页。Notallnucleasesarehelpful!RibonucleasescanbeaproblemwhenworkingwithpurifiedpreparationsofRNA,andcaremustbetakentoremoveorinactivateRNaseactivity.当前110页，总共165页。2.2Polymerases（聚合酶）Polymerasesarethecopyingenzymesofthecell;theyarealsoessentialpartsofthegeneticengineer’sarmoury.Theseenzymesaretemplate-dependentandcanbeusedtocopylongstretchesofDNAorRNA.Polymeraseenzymessynthesisecopiesofnucleicacidmoleculesandareusedinmanygeneticengineeringprocedures.当前111页，总共165页。2.2Polymerases（聚合酶）定义：EnzymesthatsynthesizeanewstrandofDNAcomplementarytoanexistingDNAorRNAtemplate.*当前112页，总共165页。Whendescribingapolymeraseenzyme,theterms‘DNA-dependent’or‘RNA-dependent’maybeusedtoindicatethetypeofnucleicacidtemplatethattheenzymeuses.Thus,aDNA-dependentDNApolymerasecopiesDNAintoDNA,anRNA-dependentDNApolymerasecopiesRNAintoDNA,andaDNA-dependentRNApolymerasetranscribesDNAintoRNA.当前113页，总共165页。Thesynthesisproceedsina5'→3'direction,aseachsubsequentnucleotideadditionrequiresafree3'-OHgroupfortheformationofthephosphodiesterbond.Thisrequirementalsomeansthatashortdouble-strandedregionwithanexposed3'-OH(aprimer)isnecessaryforsynthesistobegin.当前114页，总共165页。FourtypesofDNApolymereasesusuallyusedingeneticengineering（4种常见的聚合酶）:1.共同特点：把dNTP连续地加到dsDNA分子的3’-羟基端，催化DNA分子聚合，而引物不从DNA模板上解离。2.主要区别：持续合成能力和外切酶活性不同。T7DNA聚合酶可以连续添加数千个dNTPs而不从模板上掉下来。其它几种DNA聚合酶只能连续添加10多个dNTPs就会从模板上解离下来。当前115页，总共165页。2.2Polymerases（聚合酶）*1)DNApolymereaseI（FromE.coli,109kDa）2)Klenowfragment=E.coliDNApolymeraseIlargefragment(76kDa),枯草杆菌蛋白酶裂解DNApolymereaseI,从全酶中除去5’—3’外切酶活性片段，而聚合酶活性和3’—5’外切酶活性不受影响。3)TaqDNApolymerase4)Reversetranscriptase当前116页，总共165页。当前117页，总共165页。大肠杆菌DNA聚合酶I（DNAPOLYMERASEI）①基本性质当前118页，总共165页。②基本用途

当前119页，总共165页。大肠杆菌DNA聚合酶I大片段(KLENOWFRAGMENT)【★】

①Klenow酶的基本性质大肠杆菌DNA聚合酶I经枯草杆菌蛋白酶处理，PolI就裂解为大小不同的两个活性片段，较大的C端片段具有聚和酶和3’

-5’核酸外切酶活性但失去了5`→3`的核酸外切酶活性，即Klenow酶。当前120页，总共165页。目前以将DNA聚合酶基因内的相应编码序列克隆表达，并由重组大肠杆菌廉价生产。当前121页，总共165页。②KLENOW酶的基本用途A.补平由核酸内切酶产生的3′粘性凹进末端或5′粘性凸出末端；抹平DNA的3′粘性凸出末端当前122页，总共165页。B.DNA片段的同位素末端标记当前123页，总共165页。

C.cDNA第二链的合成

D.双脱氧末端终止法测定DNA序列当前124页，总共165页。T4DNA聚合酶(T4PHAGEDNAPOLYMERASE)【★】

①T4DNA酶的基本特性有3`→5`的核酸外切酶活性和5`→3的DNA聚合酶活性。在无dNTP时，可以从任何3`-OH端外切。在只有一种dNTP时，外切至互补核苷酸。在四种dNTP均存在时，聚合活性占主导地位。当前125页，总共165页。当前126页，总共165页。②基本用途

当前127页，总共165页。当前128页，总共165页。TaqDNApolymerase从栖热水生菌（Thermusaquaticus)中分离纯化的依赖DNA的DNA聚合酶。63kDaActivities:5´3DNApolymerase5´3exonuclease(无35´外切酶作用，因此无校正功能)特点：thermo-stable(耐高温)。应用：PCR反应中常用。*知识提升：TaqDNA聚合酶的特性:在DNA双链的3’端再加上一个多余的核苷酸(优先加A).当前129页，总共165页。SourcesofthermostableDNApolymerasewithproofreading(3’-5’exonuclease)acitivity当前130页，总共165页。T7DNA聚合酶1．来源从T7噬菌体感染大肠杆菌细胞中纯化出来的，由两个亚基组成：①T7基因5编码的大亚基，有5’-3’聚合酶和3’-5’外切酶活性。②大肠杆菌编码的小亚基：硫氧还蛋白，增加大亚基对模板的亲和性。当前131页，总共165页。2．T7DNA聚合酶的特点①持续合成能力强，一旦与模板结合就会不间断地合成互补链。②3’-5’外切酶活性高，单链和双链都能降解。③不受DNA二级结构的影响。其它DNA聚合酶受DNA二级结构的阻碍当前132页，总共165页。3．T7DNA聚合酶的用途①以大分子量DNA为模板的合成②进行末端标记。取代合成法标记3’末端，这与T4DNA聚合酶相同。③补平隐蔽末端。合成补平3’隐蔽末端；水解修平3’突出末端。

当前133页，总共165页。修饰后的T7DNA聚合酶T7DNA聚合酶的化学修饰是去除了其3’-5’外切酶活性，使DNA聚合能力和聚合速率提高了3倍。修饰后的T7DNA聚合酶的用途：①双脱氧法DNA测序；②标记DNA3’隐蔽末端；③更有效地补平末端。

当前134页，总共165页。Reversetranscriptase(反转录酶)反转录酶具有5’→3’的DNA聚合酶活性，以RNA为模板聚合cDNA链，同时又具有3’→5’和5’→3’的RNA外切核酸酶活性（

RNaseH活性）。*当前135页，总共165页。Reversetranscriptase(反转录酶)1．Variety：两种商品化的反转录酶（两个来源）AMV禽成髓细胞瘤病毒

Mo-MLV(M-MuLV)Moloney鼠白血病病毒2.Activities：

5’→3’DNA聚合活性（Mg++）

RNaseH活性3．Application：cDNA克隆5’突出DNA的3’端补平测序反应(代替Klenow大片段)*当前136页，总共165页。2.3EnzymesthatmodifytheendsofDNAmoleculesAlkalinephosphatase(碱性磷酸酶，去除5’磷酸基团)Function：Removesthephosphategrouppresentatthe5’terminusofaDNAmolecule.去除DNA分子5’末端的磷酸基团（若用于载体DNA5’末端，则可防止DNA片段自身聚合状）*当前137页，总共165页。Alkalinephosphatase

(碱性磷酸酶)ApplicationofalkalinephosphatasetreatmenttopreventrecircularizationofvectorplasmidwithoutinsertionofforeignDNA.碱性磷酸酶可使被切开后的载体去磷酸化，防止其自身环化。①克隆时去除载体的5’-P，以防载体自连它的应用当前138页，总共165页。②在用激酶进行5’末端标记前，去除DNA的5’-P当前139页，总共165页。2.3EnzymesthatmodifytheendsofDNAmolecules*Polynucleotidekinase(多核苷酸激酶，在5’端增加磷酸基团)Organism：FromE.coliinfectedwithT4phageFunction：Addphosphategroupsontofree5’terminus.给DNA5’末端增加磷酸基团，形成自由的5’-P，以利于DNA的连接。当前140页，总共165页。Polynucleotidekinase(多核苷酸激酶)TheforeignDNAplusligatedadaptorsisphosphorylatedatthe5’-terminibypolynuleotidekinase.多核苷酸激酶可使5’末端发生磷酸化，使之能与DNA3’末端正常连接。当前141页，总共165页。用途:1)5’-端末端标记当前142页，总共165页。2)分子克隆过程中获得5’-磷酸基末端，便于连接酶反应当前143页，总共165页。它能进行两种反应当前144页，总共165页。2.3EnzymesthatmodifytheendsofDNAmolecules*Terminaldeoxynucleotidyltransferase(末端脱氧核苷酸转移酶，末端转移酶)

Organism：Fromcalfthymus(胸腺)tissueFunction：Addsoneormoredeoxyribonucleotides(脱氧核糖核苷酸)ontothe3’terminusofDNAmolecule.催化脱氧核苷酸添加到DNA分子的3’-OH末端，催化作用不需要模板。当前145页，总共165页。terminaldeoxynucleotidyltransferase

(末端脱氧核苷酸转移酶,末端转移酶)底物：带有突出、凹陷或平滑末端的单双链DNA分子均可作为TdT的底物；以3’-突起端的双链DNA为最高，亦可用于双链DNA加尾*当前146页，总共165页。TdT的用途①同聚物加尾：给外源DNA片段和载体分子分别加上互补的同聚物尾巴，以使它们有效地连接。同聚物尾巴（homopolymerictail)：当反应混合物中只有一种dNTP时，就可以形成仅由一种核苷酸组成的3’尾巴。称这种尾巴为同聚物尾巴。当前147页，总共165页。再生酶切位点：克隆片段。当前148页，总共165页。放射性与非放射性标记DNA片段的3’端催化非放射性标记物参入DNA片段的3’端。如生物素-11-dUTP等。当前149页，总共165页。3.DNAligase(DNA连接酶)

E.coli

andphageT4encodeanenzyme,DNAligase,

whichsealssingle-strandednicksbetweenadjacentnucleotidesinaduplexDNAchain.Ingeneticengineeringitisusedtosealdiscontinuitiesinthesugar—phosphatechainsthatarisewhenrecombinantDNAismadebyjoiningDNA‘molecularglue’;withrestrictionmoleculesfromdifferentsources.Itcanthereforebethoughtofasmolecularglue(分子胶水).DNAligaseisessentially‘molecularglue’;withrestrictionenzymes,itprovidesthetoolsforcuttingandjoin