分子发光分析

分子发光分析第一页，共五十四页，2022年，8月28日某些物质的分子吸收一定能量后，电子从基态跃迁到激发态，在返回基态过程中，以光辐射的形式释放能量，这种现象称为分子发光，在此基础上建立起来的分析方法为分子发光分析法。较高激发态基态吸收能量受激光辐射退激分子在退激过程中以光辐射形式释放能量12.1分子发光分析概述第二页，共五十四页，2022年，8月28日根据分子受激时所吸收能源及辐射光的机理不同分为：

光致发光：以光源来激发而发光

化学发光：以化学反应能激发而发光—化学发光分析法

本章对分子荧光分析、磷光分析和化学发光分析这三种分子发光分析法进行讨论。荧光—荧光分析法磷光—磷光分析法第三页，共五十四页，2022年，8月28日一、荧光和磷光的产生1.分子能级与电子激发态的多重度

分子能级比原子能级复杂；每个电子能级中包含一系列的振动能级和转动能级。电子激发态的多重度：M=2S+1，S为电子自旋量子数的代数和(0或1)，因此M=1（激发单重态S）或M=3（激发三重态T）。平行自旋比成对自旋稳定(洪特规则)，三重态能级比相应单重态能级低；大多数有机分子的基态处于单重态。

12.2荧光和磷光分析基本原理第四页，共五十四页，2022年，8月28日S2S1S0T1吸收发射荧光发射磷光系间窜跃内转换振动弛豫能量l2l1l

3

外转换l

2T2内转换振动弛豫第五页，共五十四页，2022年，8月28日因此，电子激发态有：第一、第二、…电子激发单重态

S1，S2，…

;第一、第二、…电子激发三重态

T1，T2，…

。

激发过程：基态(S0)→激发态(S1、S2激发态振动能级)；

去活化过程：激发态→基态：多种途径和方式(见能级图)。第六页，共五十四页，2022年，8月28日S2S1S0T1吸收发射荧光发射磷光系间窜跃内转换振动弛豫能量l2l1l

3

外转换l

2T2内转换振动弛豫第七页，共五十四页，2022年，8月28日2.激发态→基态的能量传递途径（—荧光、磷光的产生）

电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射跃迁(发光)和无辐射跃迁等去活化过程失去能量。传递途径辐射跃迁荧光磷光内转换系间窜跃振动弛豫无辐射跃迁

以速率最快，激发态寿命最短的途径占优。荧光：10-7～10-9s,第一激发单重态最低振动能级→基态；磷光：10-4～10s；第一激发三重态最低振动能级→基态。外转换第八页，共五十四页，2022年，8月28日非辐射能量传递过程：

振动弛豫：同一电子能级内以热交换形式由高振动能级至低振动能级间的跃迁。这一失活过程极快（10-12s）。

内转换：同一多重态的两个电子能级间的非辐射跃迁过程，如S2→S1，T2

→T1等

系间窜跃：不同多重态有重叠振动能级间非辐射跃迁。如S1→T1等。改变电子自旋，禁阻跃迁，通过自旋—轨道偶合进行。

外转换：溶液中的激发态分子与溶剂或其他分子之间相互碰撞而失去能量，并以热的形式释放。常发生在第一激发单重态（或三重态）的最低振动能级向基态转换的过程中。外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭”。第九页，共五十四页，2022年，8月28日S2S1S0T1吸收发射荧光发射磷光系间跨越内转换振动弛豫能量l2l1l

3

外转换l

2T2内转换振动弛豫第十页，共五十四页，2022年，8月28日辐射能量传递过程：

荧光发射：电子由第一激发单重态的最低振动能级→基态(多为

S1→S0跃迁)，10-7～10-9s内发射波长为2的荧光。通常发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长长；2>2>1

；光照停止后，光线也随之很快地消失。

磷光发射：电子由第一激发三重态的最低振动能级→基态(T1→S0跃迁)产生。先发生从激发单重态S1→振动弛豫→内转移→系间跨越→振动弛豫→T1的最低振动能级。发光速度很慢：10-4～100s；光照停止后，可持续一段时间；磷光的波长更长：磷>荧>激。

因此，荧光是单重-单重态的跃迁产生；磷光是三重-单重的跃迁产生。

第十一页，共五十四页，2022年，8月28日

发射光谱（荧光或磷光光谱）

固定激发光的强度和波长(选最大激发波长),化合物发射的荧光(或磷光)强度与发射光波长关系曲线。二、激发光谱和发射光谱

激发光谱

固定测量波长(选最大发射波长)，化合物发射的荧光(磷光)强度与照射光波长的关系曲线。

两种光谱可用于签别荧光（磷光）物质，亦可作为进行荧光（磷光）物质定量分析时选择合适激发波长和测定波长的依据。第十二页，共五十四页，2022年，8月28日第十三页，共五十四页，2022年，8月28日第十四页，共五十四页，2022年，8月28日荧光光谱的基本特征a.Stokes位移

在溶液的荧光光谱中，荧光波长总是大于激发光的波长的现象。振动弛豫等消耗了能量。b.发射光谱的形状与激发波长无关

电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量(如能级图2,1)，产生不同吸收带，但均回到第一激发单重态的最低振动能级再跃迁回到基态，产生波长一定的荧光(如2)。

c.

镜像规则

通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状一样）成镜像对称关系。

第十五页，共五十四页，2022年，8月28日S2S1S0T1吸收发射荧光发射磷光系间窜跃内转换振动弛豫能量l2l1l

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2T2内转换振动弛豫第十六页，共五十四页，2022年，8月28日镜像规则的解释:

基态上的各振动能级分布与第一激发态上的各振动能级分布类似。第十七页，共五十四页，2022年，8月28日200250300350400450500荧光激发光谱荧光发射光谱nm蒽的激发光谱和荧光光谱第十八页，共五十四页，2022年，8月28日

三、荧光效率

分子能发射荧光取决于两条件：（1）具有合适的结构，能吸收激发光；（2）具有一定的荧光效率（荧光量子产率）。

荧光量子产率（）：

通常小于1，在0.1～1时具有分析应用价值。荧光量子产率低，是由于激发态分子释放激发能过程中除了荧光发射外，还存在多种非辐射跃迁与之竞争，而这些非辐射过程不仅与分子结构有关，还与所处的环境密切相关。第十九页，共五十四页，2022年，8月28日四、荧光与分子结构的关系

荧光素和酚酞结构相似，荧光素有很强的荧光，酚酞却没有。为什么？（1）具有共轭双键体系的分子：*→荧光效率高。共轭双键结构有利于发荧光。共轭度高，荧光效率高并产生红移。因此，绝大多数能发荧光的物质为含有芳香环或杂环的化合物。（2）刚性平面结构：可降低分子振动，减少了系间窜跃至三重态及碰撞去活的可能性，有很强的荧光。（3）取代基的影响：第二十页，共五十四页，2022年，8月28日

取代基的影响分成三类：增强荧光的取代基

:-OH、-OR、-CN、-NR2等给电子基团。由于基团的n电子云与苯环上的轨道平行，p-共轭作用，扩大了共轭体系，使荧光波长长移，荧光强度增强。减弱荧光的取代基：-COOH、-NO2、-COOR、-NO、-SH

吸电子基团，使荧光强度减弱。芳环上被F、Cl、Br、I取代后，使系间窜跃加强，磷光增强，荧光减弱。其荧光强度随卤素原子量增加而减弱，磷光相应增强，这种效应为重原子效应。影响不明显的取代基：-NH3+、-SO3H等第二十一页，共五十四页，2022年，8月28日第二十二页，共五十四页，2022年，8月28日(1)荧光定量关系式用强度为I0的入射光，照射到液池内的荧光物质时，透过光为It，并产生荧光If

。If=Ia=（I0-It）Ia为吸收的辐射强度I0为入射光强度荧光池I0ItIf荧光强度检测器If=（I0-I010-A）=I0

（1-10-A）It=I010-A将上式展开五、荧光定量分析原理第二十三页，共五十四页，2022年，8月28日当A﹤0.02时，方括号中其它各项与第一项相比可忽略不计，上式简化If=2.3I0A=2.3

I0bc当入射光强度、试样池长度不变时，对一给定稀溶液，I0、

、和b为常数，合并为K

If=KC

定量分析依据第二十四页，共五十四页，2022年，8月28日浓度低时，荧光强度与物质浓度呈线形关系，If=KC。浓度高时，If与C不呈线形关系（有时C增大，If反而降低）。因为公式[]中后面影响，且有时发生荧光猝灭效应或自吸效应。第二十五页，共五十四页，2022年，8月28日

①溶剂的影响一般来说，溶剂的极性增强，荧光波长长移，荧光强度增大。

②温度的影响——低温下测定，提高灵敏度因为辐射跃迁的速率基本不随温度变，而非辐射跃迁随温度升高显著增大。大多数荧光物质都随溶液温度升高荧光效率下降，荧光强度减弱。温度对磷光影响更大。（2）环境对荧光强度的影响第二十六页，共五十四页，2022年，8月28日③pH的影响大多数含有酸性或碱性基团的芳香族化合物的荧光性质受溶液pH的影响很大。因为，共轭酸碱对往往是具有不同荧光性质的两种型体，具有各自的荧光效率和荧光波长。例：苯酚离子化后，荧光消失pH≈1有荧光pH≈13无荧光第二十七页，共五十四页，2022年，8月28日但两个苯环相连的化合物，又表现出相反的性质，分子形式无荧光，离子化后显荧光例：—苯酚有荧光无荧光第二十八页，共五十四页，2022年，8月28日可能测得由溶剂产生的散射光（包括瑞利、拉曼散射）。溶质散射光有可能与荧光光谱重叠产生较严重的干扰（改变激发光的波长可避免）。⑤激发光照射的影响在激发光的照射下，有些荧光物质的稀溶液容易发生光分解，引起荧光强度的急剧降低。采用强度较低的激发光，同时缩短测定时间，可减少荧光物质的分解和由此引起的测量误差。④各种散射光的影响

第二十九页，共五十四页，2022年，8月28日荧光物质与溶剂分子或其它溶质分子相互作用，引起荧光强度下降或消失的现象称为荧光猝灭。能引起荧光猝灭的物质称为猝灭剂。荧光猝灭的形式有多种。最常见的是碰撞猝灭——

M+激→M*M*+Q→M+Q+热（无辐射）另外，某些猝灭剂分子与荧光分子发生作用，形成配合物或发生电子转移反应，也会引起荧光猝灭。⑥荧光猝灭第三十页，共五十四页，2022年，8月28日任何荧（磷）光都具有两种特征光谱：激发光谱和发射光谱。它们是定性分析的基础。通常以发射光谱作为定性的依据，若不同物质的发射光谱相似或重叠，激发光谱也可作为定性分析的另一依据。最常用的荧光定性方法是比较法：在相同的分析条件下，将待测物的荧光发射光谱或激发光谱与预期化合物的相应光谱进行比较，观察光谱的特征峰波长及形态是否一致，加以判断。六、荧光定性分析第三十一页，共五十四页，2022年，8月28日

测量荧光的仪器有荧光计和荧光分光光度计，它们主要由四个部分组成：激发光源、试样池、双单色器系统、检测器。特殊点：有两个单色器，光源与检测器通常成直角。基本流程图：12.3荧光和磷光分析仪

第三十二页，共五十四页，2022年，8月28日1、光源激发光源主要考虑其稳定性和强度，一般要求比吸收测量中的光源有更大的发射强度滤光片荧光计中，常使用高压汞灯；荧光分光光度计中常用氙弧灯利用汞蒸气放电发光的光源；常用其发射365nm、405nm、436nm三条谱线以365nm的谱线最强应用最广泛的一种光源，可发射250～800nm很强的连续光源第三十三页，共五十四页，2022年，8月28日2、单色器荧光计用滤光片作单色器，荧光计只能用于定量分析，不能获得光谱；大多数荧光分光光度计一般采用两个光栅单色器，有较高的分辨率，能扫描图谱，既可获得激发光谱，又可获得荧光光谱。第一单色器作用：选择所需的激发波长ex，用于激发试样池内的荧光物质。第二单色器作用：滤掉一些杂散光和杂质所发射的干扰光，用于分离出所需检测的荧光发射波长em。第三十四页，共五十四页，2022年，8月28日3、试样池盛放测定溶液，通常是石英材料的方形或长方形池，四面都透光，只能用手拿棱或最上边。4、检测器把光信号转化成电信号，放大，直接转成荧光强度。荧光光度计一般采用光电倍增管。

第三十五页，共五十四页，2022年，8月28日磷光分析仪器与荧光分析仪器相似，主要差异如下：1.试样室试样需在液氮温度（77K，-196℃）下测定低温磷光（将液池放在盛放液氮的杜瓦瓶内）室温磷光技术:以固体基质吸附磷光体，增加分子刚性，提高磷光量子效率。2.磷光镜有些物质既可产生荧光，又能产生磷光。用机械切光装置——磷光镜区别荧光和磷光。利用荧光寿命短，磷光寿命长消除荧光干扰。第三十六页，共五十四页，2022年，8月28日

即借助于荧光和磷光寿命的差别，采用磷光镜的装置将荧光隔开。第三十七页，共五十四页，2022年，8月28日1.荧光和磷光分析法的特点优点：（1）灵敏度高

比紫外-可见分光光度法高2～4个数量级；为什么？黑背景下检测，通过增加入射光强度或增大荧光或磷光信号的放大倍数可提高灵敏度。（2）试样量少（3）信息丰富

如激发光谱、发射光谱、荧光强度、荧光效率、荧光和磷光寿命等）。缺点：应用范围小（本身能发荧光或磷光的物质不多）。12.4荧光和磷光分析法的特点与应用第三十八页，共五十四页，2022年，8月28日⑴痕量分析荧光和磷光分析法的灵敏度很高，特别适合于微量及痕量物质分析通过一些间接的方法拓宽荧光分析法的应用范围●荧光试剂（也称荧光探针）的使用；●利用荧光猝灭法测定氟、氰等能使荧光减弱的离子。多种荧光分析新技术的应用●激光诱导荧光光谱分析法：激光光源、CCD等检测器，大大提高分析灵敏度，甚至实现单分子检测；●时间分辨荧光分析法：采用脉冲激光光源，延缓检测时间，提高测定选择性。2.荧光和磷光分析法的应用第三十九页，共五十四页，2022年，8月28日⑵联用技术的检测器高效液相色谱、毛细管电泳等分离分析法的检测器微型化分析方法如基因芯片、微流控芯片的检测手段⑶分子结构性能测定荧光激发光谱、发射光谱及荧光强度等荧光参数与分子结构及其所处环境密切相关，能为分子结构及分子间相互作用的研究提供有用信息。

目前：荧光分析法可用于测定多种无机物和有机物，在生物、医药和环境科学等领域获日益广泛应用；磷光分析法则主要用于有机化合物如药物、多环芳烃以及石油产品的测定。第四十页，共五十四页，2022年，8月28日第四十一页，共五十四页，2022年，8月28日第四十二页，共五十四页，2022年，8月28日第四十三页，共五十四页，2022年，8月28日第四十四页，共五十四页，2022年，8月28日一、概述化学发光分析法是利用化学反应所产生的光辐射现象所建立的分析方法。化学发光光谱与对应物质的荧光光谱和磷光光谱十分相似，其主要区别：受激发时所需的能量来源不同，需要化学反应过程中所提供的化学能。12.5化学发光分析第四十五页，共五十四页，2022年，8月28日二、化学发光反应

在化学反应过程中，某些化合物（反应产物）接受能量而被激发，从激发态返回基态时，发射出一定波长的光。

A+B=C+D*；D*→D+h能产生化学发光的反应，必须符合两基本要求：化学反应必须提供足够的能量，又能被反应产物分子吸收，使之处于激发态。

多为氧化还原反应，激发能与反应能相当E=170～300kJ/mol；位于可见光区。(2)吸收了化学能的激发态分子必须能释放出光子或者能够将它的能量转移给另一个分子，使该分子激发并以辐射光子的形式回到基态。

能够发光的化合物多为有机化合物(芳香族)。第四十六页，共五十四页，2022年，8月28日三、化学发光反应的类型常见类型有：气相化学发光和液相化学发光⑴气相化学发光反应：指化学发光反应在气相中进行。

如乙烯与O3反应，生成激发态甲醛而发光：

CH2O*→CH2O+h

最大发射波长：435nm；是对O3的特效反应；线性响应范围1ng·cm-3～1g·cm-3。第四十七页，共五十四页，2022年，8月28日⑵液相中的化学发光反应

机理研究较多，应用最多；如常见的发光物质鲁米诺（3-氨基苯二甲酰肼）在碱性溶液中与双氧水的反应过程：该化学发蓝光；反应速率慢，某些金属离子可催化反应，利用这一现象