基于介孔碳的电化学酪氨酸酶生物传感器测定水体中的苯酚及高效液相色谱法

基于介孔碳的电化学酪氨酸酶生物传感器测定水体中的苯酚及高效液相色谱法第1页/共16页

酪氨酸酶（三维尺寸为6.5nmx9.8nmx5.5nm)生物传感器是催化氧化苯酚的核心部件，同时酪氨酸酶也是一种生物活性蛋白质(体外易失活)。酪氨酸酶易失活的特性决定了必须要有一个对酪氨酸酶分子生物相容性较好的固定材料来提供一个有利的微环境，以保持其生物活性和稳定性，同时要求这个固定基底具有较好的电化学换能力（导电性)和高的酶载量以提高生物传感器的灵敏度和检出限。因此，电化学酶基生物传感器发展的核心是传感材料，性能优良的固定材料能够显著提高酶的体外稳定性和生物活性。电化学酪氨酸酶生物传感器是一种非常有应用前景的苯酚污染物检测方法。第2页/共16页其对苯酚的检测原理是:电化学酪氨酸酶生物传感器能够利用分子氧催化苯酚生成邻苯酚和邻苯醌，而邻苯醌又可以在电极表面通过电化学催化还原生成邻苯酚形成信号循环放大。有序介孔碳具有可控的孔结构和孔径大小。大的比表面积和孔体积、良好的导电性、好的电化学稳定性，可以作为酪氨酸酶的理想固定基底。本研究将酪氨酸酶分子诱陷到合适孔径大小的介孔碳材料中，并由此构建了基于介孔碳材料的酪氨酸酶生物传感器。研究结果发现，当介孔碳直径与酶分子大小相匹配时，利用介孔碳的空间限制效应，可防止酶分子的去折叠失活，提高酶的长期稳定性和生物活性;同时酪氨酸酶分子与导电基底之间由于距离较近而减少了长程电子传输，利于电化学能转化。介孔碳多孔的网络骨架结构还可以为酪氨酸酶反应的底物和产物提供通畅的通道，提高传感器的响应速度和灵敏度。此外，介孔碳材料优良的电化学换能能力和高的酶载量能够满足环境中酚类检测对酪氨酸酶生物传感器在灵敏度和检出限等方面的要求，达到快速检测环境样品中苯酚污染物的要求。本研究采用高准确度的（HPLC）对电化学酪氨酸酶生物传感器检测结果的准确性、可靠性进行了评价。第3页/共16页1.1材料与试剂壳寡糖和酪氨酸酶(酶活力大于1000μ/mg,等电点5.92)都购自美国西格玛公司，甲醇(色谱纯)购自德国默克公司，苯酚和其他所有试剂都购自天津科密欧公司。整个实验过程中采用的水均为Milli-Q水(电阻率18MΩ•cm）。如果没有特殊说明，电化学实验过程中的电解质溶液均采用50mmol/L的磷酸盐缓冲液争（PH7.0)。酶活力（enzymeactivity）也称为酶活性，是指妹催化一定化学反应的能力。酶活力的大小可用在一定条件下，酶催化某一化学反应的速度来表示，酶催化反应速度愈大，酶活力愈高，反之活力愈低。测定酶活力实际就是测定酶促反应的速度。酶促反应速度可用单位时间内、单位体积中底物的减少量或产物的增加量来表示。在一般的酶促反应体系中，底物往往是过量的，测定初速度时，底物减少量占总量的极少部分，不易准确检测，而产物则是从无到有，只要测定方法灵敏，就可准确测定。因此一般以测定产物的增量来表示酶促反应速度较为合适。这里单位是每毫克酶蛋白所具有的酶活力。单位是u/mg。活力越高则酶越纯。1.2实验仪器透射电镜(TEM,JEM-2000EX，日本);高效液相色谱仪(按捷伦1200，配二极管阵列检测器，美国);物理吸附仪(康塔SI4，美国);CHI440B电化学工作站（上海辰华公司);三电极体系:玻碳电极（GC)为工作电极，Ag/AgCI为参比电极（KCl浓度3mol/L），铂电极为对电极;超声波清洗器。实验部分第4页/共16页1.310nm孔径介孔碳材料的制备

本研究以采用溶胶-凝胶法制备的直径为10nm的单分散硅球作为硬模板，然后以苯乙烯为碳源，经惰性气氛下的高温催化碳化一去除模板等步骤后，获得10nm孔径的有序介孔碳。步骤一在100mL的三颈烧瓶中加人0.0292gL-赖氨酸、27.8mL去离子水以及4mL的正硅酸乙酯，在70℃下磁力搅拌反应12h，于80℃缓慢蒸干溶剂，得到直径为10nm的纳米硅球。步骤二在石英研钵中研细上述硅球，然后向模板硅球中加人Ni(NO3)2·6H20的乙醇水溶液(乙醇/水的体积比为1:1），最终使Ni与Si的物质的量比为1:34。步骤三然后将浸渍过Ni(NO3)2·6H20的SiO2模板在80℃烘箱中干燥，然后在红外压片机上压成厚1mm的薄片（压力6Mpa）步骤四向10mL新鲜蒸馏的苯乙烯单体中滴加0.O5mL浓硫酸，使苯乙烯初步聚合;取1g浸渍Ni(NO3)2的SiO2模板置于25mL钳祸中，加人5mL初步聚合的苯乙烯，于160℃预碳化24h，然后将SiO2/C的复合物移人管式炉中，在高纯氮气保护下升温至850℃热解3h，升温速率为5℃/min。步骤五热解结束后将复合物冷却至室温，在20%氢氟酸溶液中搅拌12h去除SiO2，过滤、洗涤后干燥，得到孔径为10nm的介孔碳材料。步骤六将制备得到的纳米硅球（模板)和介孔碳材料进行透射电镜表征。采用物理吸附仪表征介孔碳材料的氮气吸附一脱附等温曲线和孔径分布。测定之前，需要将介孔碳样品于180℃脱气6h。介孔碳材料合成的具体步骤:第5页/共16页麂皮是一种野生动物麂的皮，粒面伤残较多，比羊皮厚实，纤维组织也较紧密，是加工绒面革的上等皮料。麂皮现己很少用，现多用优质山羊皮，绵羊皮，鹿皮代替，经油鞣法制成的清洁用革，质地相当柔软,对于硬度不高的玻璃或者是其他东西相当有保护性.而这种麂皮又分为生麂皮和熟麂皮,生麂皮一般用来擦拭汽车中的玻璃或者是反光镜的。1.4基于介孔碳材料的电化学酪氨酸酶生物传感器的构建首先将玻碳电极分别在含粒径1、0.3、0.05μm氧化铝微球的麂（jǐ)皮上打磨，然后用去离子水和无水乙醇分别超声清洗5min以去除电极表面弱吸附的氧化铝，用氮气将电极表面吹干。经过条件优化，选择的介孔碳、酪氨酸酶以及壳寡糖的质量浓度分别为0.2、2.5、1.5g/L。基于介孔碳材料的电化学酪氨酸酶生物传感器的具体组装步骤:首先，将10μL10g/L的酪氨酸酶溶液加人到20μL0.4g/L介孔碳溶液中振荡摇匀30min;随后，将具有极强成膜能力的壳寡糖溶液(10μL6g/L)加人到上述溶液中，得到酪氨酸酶与介孔碳的混合溶液;最后，取4μL上述溶液滴加到洁净的玻碳电极表面，用烧杯将玻碳电极盖住，使玻碳电极表面的水分缓慢蒸干形成均一的薄膜。电极表面的水分蒸干后得到酪氨酸酶修饰的玻碳电极。备注：电化学测定之前，所有修饰电极均需要在50mmol/L磷酸盐缓冲溶液（PH7.0)中搅拌30min以去除电极表面弱吸附的成分。第6页/共16页电化学酪氨酸酶生物传感器采用恒电位方法进行苯酚检测腔制电位为-0.1V，基底溶液为8mL50mmol/L磷酸盐缓冲溶液)。高效液相色谱法测定条件:DiamonsilC18（DiamonsilC18是北京迪马科技有限公司色谱柱品牌。）、色谱柱(250mmx4.6mm,5μm)为分析柱;流动相为甲醇-水(4:1,v/v)，流速1mL/min;检测波长为272nm;柱温为30℃;进样量为10μL。电化学酪氨酸酶生物传感器检测结果准确性（A）的评价公式:A=(CH-CE)/CHx100%，其中CH代表高效液相色谱法检测的浓度值;CE代表电化学酪氨酸酶生物传感器检测的浓度值。苯酚样品的测定取5个具有代表性的水样各1L，分别用25、15、10mL的苯萃取3次，合并3次萃取有机相，随后采用0.45μm微孔滤膜过滤，得到待测溶液。然后分别采用电化学酪氨酸酶生物传感器和高效液相色谱法进行苯酚检测。第7页/共16页2.1硅球及介孔碳材料的表征

通过透射电镜对按1.3节所述方法制备的纳米硅球进行了表征。从图1a中可以看出，这些硅球粒径均一((10nm左右)，呈单分散性。将这些纳米硅球采用红外压片机压成片状作为制备介孔碳的硬模板。以上述合成的硅球为模板合成的介孔碳的透射电镜图见图1b，可见合成的介孔碳孔径均一，排列规则有序，呈蜂窝状。结果与讨论第8页/共16页

图2给出了10nm孔径介孔碳材料的氮气吸附一脱附等温线及相应的孔径分布曲线。从图2a可以看出，介孔碳材料的吸附等温线由于毛细管浓缩现象呈现较大的滞后回路，是典型的介孔结构特征曲线，进一步说明制备的介孔碳材料具有典型的介孔结构。从图2b的孔径分布曲线可以看出，10nm孔径介孔碳的孔径分布较窄，主要集中在8~12nm，其比表面积为1060m2/g，孔体积为3.467cm3/g，介孔碳材料大的比表面积和孔体积为固载和容纳酶分子提供一个有利的微环境，与酪氨酸酶三维尺寸(6.5nmx9.8nmx5.5nm)相近的孔径能够发挥介孔碳材料的“空间限制效应”，防止酶分子去折叠失活，保持酶分子的体外稳定性。毛细管气相色谱仪的这一部分部件和填充柱色谱仪没有太大的区别，只是由于毛细管气相色谱要求的载气流量比填充柱小得多(每分钟只有几毫升)，如不用分流进样，则柱前压较小，流量指示部件的数值也很低，对控制和检测部件的要求要高，所以早期的毛细管气相色谱仪多用分流进样。第9页/共16页2.2酪氨酸酶修饰电极电化学性能的表征

电化学酪氨酸酶生物传感器的构建过程如图3所示:介孔碳材料((10nm)通过液相自组装将酪氨酸酶诱陷到介孔碳介孔中形成超分子组装体，然后将其固载到电极表面构建酶传感器。酪氨酸酶是一种铜蛋白，能够利用分子氧催化苯酚生成相应的邻苯酚和邻苯醌，而邻苯醌又可以在电极表面通过电化学催化还原生成邻苯酚形成信号循环放大。第10页/共16页图4是基于介孔碳材料的电化学酪氨酸酶生物传感器在除氧磷酸盐缓冲溶液中循环伏安图（扫描速度从10mV/s到100mV/s）。随着扫描速度的增加，酪氨酸酶电极的阴极和阳极峰电流同时增加，同时其峰峰电位差也随之增加。从图4b中可以看出，其阴极和阳极峰电流随着扫描速度的增加(10~100mV/s)线性增加，说明酪氨酸酶和玻碳电极之间的电子传输能够很容易地在复合膜修饰电极上实现，酪氨酸酶和玻碳电极之间的电子传输是一个表面控制的电化学过程。第11页/共16页2.3酪氨酸酶生物传感器对苯酚的定量检测

图5给出了不同传感器检测苯酚的电流一时间响应曲线。从图5可以看出，基于介孔碳的电化学酪氨酸酶生物传感器(Tyr-GMC10-Chi/GC)的性能高于基于电化学酪氨酸酶生物传感器((Tyr-Chi/GC)。通过对照可以看出，电化学酪氨酸酶生物传感器检测苯酚时的信号强度小，信号的噪声也较小，信号更稳定。由于介孔碳的比表面积很大，活性位点很多，苯酚在电极表面电催化生成的中间过渡态醒类等沉积在介孔碳表面，导致生物传感器的电信号产生较大的噪声。经过21d的存储后，基于介孔碳的电化学酪氨酸酶生物传感器能保持85%的最初响应信号，说明酪氨酸酶在介孔碳材料“空间限制效应”作用下有较好的体外长期稳定性。基于介孔碳的电化学酪氨酸酶生物传感器对苯酚在0.1-10μmol/L范围内线性相关，检出限为20nmol/L(1.88μg/L)，灵敏度为1385mA/(cm2·mol);而无介孔碳的电化学酪氨酸酶生物传感器对苯酚的检出限为100nmol/L，灵敏度为154.9mA/(cm2·mol)o第12页/共16页结果显示基于介孔碳的电化学酪氨酸酶生物传感器的灵敏度远远高于无介孔碳的电化学酪氨酸酶生物传感器的灵敏度(8.9倍);其检出限(1.88μg/L}低于中国国家饮用水标准((GB5749-2006中苯酚限量为低于2μ/L)。由于酪氨酸酶分子对苯酚的专一性生物催化作用，电化学酪氨酸酶生物传感器检测苯酚具有良好的选择性。这说明本生物传感器可以作为快速检测水体中苯酚的有用工具，可实现苯酚的高灵敏检测。第13页/共16页本研究采用新型的介孔碳材料作为固载酪氨酸酶的检测平台构建生物传感器，应用于水体环境中苯酚污染物的检测，并通过HPLC方法对其准确性进行了评价。介孔碳材料的“空间限制效应”提高了介孔中酪氨酸酶分子的