T淋巴细胞转化试验

PAGEPAGE3T淋巴细胞转化试验（Tlynrphocytetransformationtest）正常机体的T淋巴细胞在体外培养过程中，受到特异性抗原或有丝分裂原（植物血凝素或刀豆素等）刺激，T淋巴细胞的应答功能。这类方法称为淋巴细胞转化试验（lymphocyteleansformstointest）简称淋转试验，在临床上现已作为测定人体细胞免疫功能的指标之一。细胞免疫缺陷时，这种转化功能也降低。目前最常用植物血凝素（PHA）作为分裂原PHA体外引起T淋巴细胞转化的刺激物种类颇多，大致有以下几类：非特异抗原刺激物，如从豆类中提了的植物血凝素（PHA）和刀豆素A（ConA）素（mitogen）。特异性抗原刺激物，如结核菌纯化蛋白衍生物（purifegproteinderivativePPD）等。组织抗原和抗血清，如同种白细胞，抗淋巴细胞血清等。PHAT5-30%左右。虽然T淋巴细胞对非特异性和特异性抗原的识别过程不同，但被激活后，所发生的分裂和增殖反应却是相同的。因此根据PHAT淋巴细胞分列增殖反应的程度，可以推测T淋巴细胞识别特特异性抗原后的增植反应。从而利用PHA刺激淋巴细胞转化试验一项非常特异性体外免疫学检测指标，在一定程度上可作为刺激原，因此一般称为PHA淋巴细胞转化试验。PHA淋转试验有形态计数法和同位素计数法两种，前者测定转化的淋巴母细胞百分率，后者测定放射性同位素标记的DNA前身掺入细胞合成DNA的量。形态改变，则仍需应用形态观察法。淋巴细胞转化试验的操作方法主要有两种：1、形态学方法：加分裂原共同培养后，观察形态学变化，计算转化为母细胞的百分数；、3—胸腺嘧啶核苷掺入法：加分裂原共同培养结束前一定时间，加3H镊入细胞内的放射性物质的相对数量，以间接了发转化程度。3H好，但需要一定设备条件。PHA淋转试验形态学检查法一、目的：1、了解本技术的原理。2、掌握操作方法。3、学会分辨几类细胞形态学上的特点。二、原理：将人外周血液或分离的白细胞和PHAPHAT200（简称转化率）。在正常情况下，PHA淋巴细胞转化率为60-80%，50-60%则偏低，50%下则降低。三、试验材料：1、PHA溶液：PHA有粗制品两种。粗制品是含多糖的蛋白质成分，各为PHA-M。精制品为纯蛋白成分，名为PHA—P。国内虽有少数精制的PHA产品，但仍有待试剂标准化。目前国内在临床检验中作淋转试验所用PHA述正式试验方法检测同一标本。如PHA50-200Ug/mL。PHA粗制品亦可按下法自制：将广东红花云豆（PhaseolusVulgaris）研磨成粉末，取10g粉末加生理盐水100ml，放置4℃冰箱浸泡48小时，每隔数小时稍加搅拌。取出后用滤纸过滤或在4℃离心（2，500转/分）30分钟。取滤液或上清液加生理盐水补足至101%浓度。（力10（1:10,11:2560）0.25ml1-9101-101%0.25ml，混匀室6-8PHAPHA即为一个单位（U）ml501:128025淋巴细胞转化试验按每毫升培养液加入50U/ml的PHA0.1ml即可。2、小牛血清：未进食的新生小公牛，以无菌手续从颈动脉放血分离血清，分装后，56℃30分钟灭活，无菌试验阴性，冰冻保存可长期备用。3、肝素：取粉末状肝素用HanK’s（PH7.4）126/101ml0.1ml4、培养液：各实验室所用培养液颇多差异，以下仅列举几种：HanK’S1520%清，并加青霉素（100U/mL）和链霉素（100UG/mL），10%PH7.2—7.4。（2）RPMI—1640培养液：同型的同种异种血清，199营养液或EagieS液（内含小牛血清20%，青霉素100单位/毫升，链霉素100Ug/mL），用3.5%碳酸氢钠调整PH7.2—7.4。5、3%明胶：临用时配制。用生理盐水配成3%明胶，沸水融化，分装后，8磅10分钟灭菌。6、瑞特一基姆沙氏染液瑞特粉末 0.3g基姆沙粉末 0.03g甲醇 100mL先将两种粉末称好，放乳钵内研细后，慢慢加入甲醇，混匀，放棕色瓶中，塞紧瓶口，充分振荡，放室温待充分溶解后即可使用。7、其它：血球计算板，1%冰醋酸，显微镜，水浴，培养瓶试管，吸管等。四、实验方法：1、淋巴细胞分离，采集肝素抗凝外周血液（肝素用量20U/mL），可采用以下两种方法之任何一方法进行分离。（1）Ficoll-Comray （聚蔗糖——泛影钠）分离淋巴细胞法：用10毫升的试管，加入3毫升淋巴细胞分层液（比重介于1.0-1.090之间），在这种分层液的界面上，轻41500-2000/10-20和分层液之间，淋巴细胞多时，可呈现一层乳白层。用滴管直接插入淋巴细胞分层液吸取淋巴细胞放入含有Hank’S4-51500-2000/10HanK’S液进行计数，应用浓度为2-3×16/mL，每份需用1毫升。（2）3%明胶（分子量19万）分离法：将明胶用生理盐水配成3%的溶液，煮沸溶化后，分装试管中，以810-15331（37℃水浴中）。充分混匀，一般轻轻晃动动试管30-50次即可，但应注意防止出气泡。37℃20-3030量的粒细胞等）。将此细胞悬液充分混匀，吸取0.1毫升放在另一小试管中，加入1%醋酸0.9毫升，充分混匀，室温中放置片刻，取1滴放在血球计数板进行计算，其计算方法如下：0.12-31%5196%以上。PHA转化试验中似无明显影响。根据需要，亦可采用下述方法混入的红细胞，即将分得的淋巴细胞悬液经800-1000/分，离心10Tris-MHC151004转/5HanK’S度即可应用。23%1500转/心10-15200-300万/mL6培养液，分离的白细胞可混有少量红细胞，有利淋巴细胞培养。10.5mLPHA0.1/mL(50U/mLPHA)另管作为对照用。PH3772小时，加PHAPHA3、培养结束后，离心（1,000转/分）10分钟，倒尽上清液，待管壁残留少量液体回至管底，用毛细滴管吹打使沉淀细胞分散。吸取一滴细胞悬液，滴在清洁玻片上，用滴管前端作刮片，将细胞液轻轻推向一方，一般大细胞多在尾部，推完迅速用电扇吹干，待干燥后用姬姆萨氏染料固定染色，用油镜观察计数。4Wright-Giemsa1-21-23-55、镜检：可按头，体，尾三部分区域观察。如图1表示的方向进行镜检。6、结果观察，淋巴细胞加PHA分裂原经培养后，可转化为各种形态的母细胞，掌握其形态特点，在确定淋巴细如下（1）。细胞类别母细胞细胞类别母细胞转化的淋巴细胞过渡型未转化淋巴细胞细胞体积（直径）大小12-2012-166-8不增大胞 染色质增大疏松增大疏松密集胞增着多色+++嗜碱嗜碱浆空泡伪足+或-+或--无青色--核核仁清晰可见-4个有或无无有丝分裂+或1、[成熟的淋巴细胞]大小基本一致和末梢血液中未经培养的淋巴细胞相一致。核大类似圆形，匀质，用瑞特一基姆沙氏染色呈深紫色，原浆大多看不到，看到只在核的一边呈弯月形，染色呈蓝色。2、[过渡型淋巴细胞]大小比成熟的淋巴细胞稍大，和大淋巴细胞基本一致。核质和成熟的淋巴细胞构造相似或略有疏松，但具有明显的核仁。这点和成熟淋巴细胞是最明显的区别点，原浆嗜硷但不强。3、[淋巴母细胞]细胞休积明显增大，约12-20Um，达成熟淋巴细胞的3-4倍，甚至更大，形态不整齐。细胞核膜清楚核染色质疏松呈细网状结构，核内可见1-4个核仁。胞浆变宽，核与细胞比例变小，胞浆碱性明显增加，胞浆内有时可见小气泡出现，胞浆边缘个别呈伪足状突起。核较成熟淋巴细胞显著增大，核可达5-12U，核质疏松，核内有数个明显的核仁和分散的空泡，有的还可看到核有分裂象。4、[网状细胞样淋巴母细胞]细胞轮廓显著增大，其大小约为成熟淋巴细胞数倍以上，形态很不规则，大致呈阿米巴样。原浆嗜硷性不强，看起来有透明感。核质构造呈细网状，核仁明显，有一至数个。有的人也将此类型分为下面两类：过度型母细胞，它是未曾完全转化的细胞，但已具淋巴母细胞的某些特征，比小淋巴细胞大，约12-16Um，核染色质变松，有的见有核仁，胞浆增多，嗜碱性也见增强。4衰老退化母细胞：胞浆已部分或全部破碎，有时仅存细胞核（裸核），这类细胞一般不作计数。成熟的小淋巴细胞：与正常未培养的淋巴细胞一样，核染色体致密，核与细胞比例大，胞浆为轻度嗜碱性。上述所见，是淋巴细胞转化过程中最常见的形态变化，总的来说，不外1形态大小变化较成熟淋巴细胞为大，皆10-151核和原浆都增大，尤其原浆增大后，细胞呈阿米巴样，着色淡染；41-2每份标本至少计数200 转化的淋巴细胞数 转化率＝ 转化的淋巴细胞数＋未转化的淋巴细胞数在细胞培养物内，尚见有其他细胞，如多形核白细胞在培养过程不断变性死亡，经72小时后绝大部衰变或死亡灰色或红褐色，浆内有大小不等的颗粒或吞噬物。50060-80%间。按头，体尾三段，实际镜检数出的细胞数量往往超出500个以上，数的越多，则转化率计算也越正确。（三）影响培养结果的几个问题淋巴细胞培养时各种条件对淋转试验结果影响很大，分别叙述如下：1、全部操作过程都应严格无菌，这是体外淋巴细胞转化成败的关键问题。2、培养液：培养液的营养价值越高，转化率相对地较高，转化的淋巴母细胞形态也较典型，核丝分裂也稍多。19920%小牛血清，在培养淋巴细胞转化上可取得很好的成绩。但由于199清中有某种抑制转化的因子存在，所以在选择血清上也要注意。PH7.2-7.4HePeS羟乙基-呱嗪-N’-2-乙基磺酸（N-2-hydroxy-piperazine-N’-2-ethanesulphonicacid）的缩写，其分子有磺P7.210-25mM(2.38-5.95mg/mL)，用氢氧化钠溶液调至所需PH。培养液液面：为使细胞有足够的氧气以维持其新陈代谢，细胞与培养液的接触面要大。培养容器以斜放为宜。添加的血清：培养液中一般加20%AB较慢，从而更易于受干扰。用全血培养可以省去小牛血清并不影响结果。3、PHA浓度：PHAPHA501ml0.1ml，724、红细胞：用3%明胶分离淋巴细胞是便于推广的一种方法。操作中应小心地吸取上层液中白细胞，避免混入大量的红细胞，但无论如何小心，仍有多量的红细胞混入其中，一般来说，对淋巴