十字花科黑腐病菌一对假定的双组份信号转导系统基因的功能研究-生物化学与分子生物学专业毕业论文

缺失突变体DM3067／3068。测定生长曲线实验结果显示，与野生型菌株相缺失突变体DM3067／3068。测定生长曲线实验结果显示，与野生型菌株相比，突变体DM3067、DM3068和DM3067／3068在根本培养基和丰富培养基中的生长没有变化；致病生化因子检测实验结果显示，与野生型菌株相比，突变体DM3067、DM3068和DM3067／3068的胞外多糖、胞外蛋白酶、胞外淀粉酶和胞外纤维素酶和游动性等均没有显著差异；抗逆性检测实验结果显示，与野生型菌株相比，DM3067、DM3068和DM3067／3068耐受蛋白质变性剂的能力下降，渗透压抗性和有机溶剂抗性没有变化；在寄主满身红萝卜的致病性检测实验结果说明，与野生型菌株相比，突变体DM3068和DM3067／3068的致病力有显著变化；在非寄主辣椒上的过敏反应实验检测结果说明，与野生型菌株相比，突变体DM3067和DM3068的过敏反响减弱。DM3067和DM3068的反式互补菌能根本回复表型至野生型水平，说明XC3068与致病性相关，而XC3067和XC3068与过敏反响和蛋白质变性剂抗性相关。RT-PCR实验结果说明，XC3067和XC3068位于同一转录单元，很可能组成一个双组份信号转导系统。RT-PCR实验结果还说明，XC3067和XC3068在MMX的表达量与在NYGB中的表达量一致，在MMX条件下中不受hrpG和hrpX调控。本研究结果显示XC3067和XC3068这对推测的双组份信号转导系统基因可能与野生型的致病力、过敏反响和蛋白质变性剂抗性相关。并且XC3067和XC3068位于同一转录单元，不被M^Ⅸ诱导表达，不被hrpG和hrpX在MMX培养基条件下调控。关键词：十字花科黑腐病菌双组份信号转导系统致病性过敏反响耐受性V万方数据IDENTIFICATIONIDENTIFICATIONOFAPAIR0FHYPOTHETICALTWO·COMPONENTSIGNALTRANSDUCTIONSYSTEMGENESlNXANTHoMoNASCAMPEsTRISPN．cAMPESTRISABSTRACTXanthomonas campestris pv．campestris(Xcc)，belonging to the),-subdivisionoftheproteobacteria，caninfectalmostallmembersofthecruciferfamilyintheworldwide，whichisoneofthemodelorganismsinstudyingplant—pathogeninteractions．Two—componentsignaltransductionsystem(TCSs)isoneoftheimportantsignaltransductionsystemsinbacteria．Typically,thissystemiscomprisedofahistidinekinase(HK)thatreceivestheinputstimuliandaresponseregulator(RR)thateffectsanappropriatechangeincellularphysiology．GenomeanalysisshowedthatXcc8004strainhasatotalof111two-componentsignaltransductionsystemgenes．Therearestillmanygenesfunctionsoftwo—componentsignaltransductionsystemsunclear,includingXC3067andXC3068，whichconsistofapairofhypotheticaltwo—componentsignaltransductionsystemgenes．BioinformaticsanalysisshowedthatXC3068locatedinthegenomenexttoXC3067,has14bpoverlappingwitheachother,atthe5'-endofXC3067andthe3’endofXC3068．Theywerepredictedtobetranscribedinthesamedirection．XC3067wasannotatedtoencodeahistidinekinase／responseregulatorhybridprotein．AndVI万方数据XC3068XC3068encodeasensorprotein．Inthepreviousstudy,theTnSgusA5insertioninXC3068geneimpactedonpathogenicity．Inordertostudythebiologicalfunctionsofthetwo．componentsignaltransductionsystemXC3067andXC3068，weconstructedXC3067andXC3068deletionmutantsDM3067，DM3068andthedoublemutantDM3067／3068byusinggeneshomologousdoubleexchange．TheresultsshowedthatthegrowthofDM3067，DM3068andDM3067／3068wereidenticaltothewild—typebothinminimalmedium(MMX)andnutrientmedium0',rVG)．Andtheproductionofextracellularpolysaccharide，extracellularprotease，extracellularamylase，extracellularcelluloseandmotilityofthemutantswerenotinfluenced．InordertostudysensingtheenvironmentsignalinXcc8004，wetestsomestress，includingosmoticpressure，organicsolventandproteindenaturant．Theresultsindicatedthatcomparedwiththewild·type，DM3067，DM3068andDM3067／3068couldonlyaffecttheadaptationtoproteindenaturant，butnotaffectosmoticpressureandorganicsolvent．TheresultofpathogenicitytestinhostplantChineseradishshowedthatthevirulenceofDM3068andDM3067／3068decreased．Hypersensitiveresponsetestinnon-hostpeppershowedthatDM3067，DM3068andDM3067／3068haddecreasedhypersensitiveresponse．ThecomplementationstrainsofDM3067andDM3068canrestorethephenotypestothewild-typestrain．TheresultssuggestthatXC3068mightcontributetothepathogenicityofthewild—typestrain．XC3067andXC3068wererequiredinhypersensitiveresponseandproteindenaturanttoleranceofthewild-typestrain．VII万方数据Th,reTh,rereersetrtranscriptio"ptionpopolymerasechaichainreactiI(RT-PCRreaction CRresultsshowedthatXC3067andXC3068werelocatedinthesametranscriptionunit，suggestingthattheyarelikelytoformatwo—componentsignaltransductionsystem．TheRT-PCRresultsalsoshowedthattheexpressionofXC3067andXC3068inMMXmediumweresametothatinNYGmedium．BothhrpGandhrpXcouldnotregulatetheexpressionofXC3067andXC3068inMMXmedium．ThisstudydemonstratedthatXC3068isrequiredforthefullvirulenceofXcc8004．XC3067andXC3068arerelatedtohypersensitiveresponseandproteindenaturingagentresistance．RT-PCRresultsshowedthatXC3067andXC3068werelocatedinthesametranscriptionunit．AndtheexpressionofXC3067andXC3068werenotinducedinMMXmediumandwerenotregulatedbyhrpGandhrpXinMMXmedium．KEYWORDS：Xanthomonascampestrispv．signaltransductionsystem；pathogenicity；hypotheticalresponse；toleranceVIII万方数据目 目 录目 录 Ⅸ第一章前言 11．1双组份信号转导系统的相关进展 11．1．1双组份信号转导系统的简介与分布 ．11．1．2双组份信号转导系统中HKs的功能域 ．．31．1．3双组份信号转导系统中RRs的功能域 41．1．4双组份信号转导系统的通路 ．51．2十字花科黑腐病菌研究进展 71．2．1十字花科黑腐病菌概述 ．71．2．2双组份信号转导系统在8004中的研究进展 ．．81．3本研究的主要目的、内容和意义 ．111．3．1本研究的主要内容 111．3．2本研究的主要目的和意义 11第二章材料与方法 ．122．1材料 ．．122．1．1应试植株 122．1．2应试菌株 122．2常规微生物学操作 ．142．2．1细菌培养基 142．2．2菌株的培养 152．2．3菌株的保存 152．2．4常用试剂与缓冲液 162．2．5突变体营养缺陷型检测 182．2．6胞外多糖的检测 182．2．7胞外酶的检测 182．2．8细菌游动性的检测 192．2．9抗逆性的检测 192．2．10生长曲线的测定 ．202．3分子生物学操作技术 ．20TX万方数据2．3．1十字花科黑腐病菌基因组DNA提取 2．3．1十字花科黑腐病菌基因组DNA提取 202．3．2细菌质粒的提取 212．3．3DNA的分子生物学操作 ．212．3．4聚合酶链式反响(PCR) 232．3．5RNA的分子生物学操作 一252．3．6Southem印记法 272．3．7细菌的感受态细胞制备与转化接合实验 292．3．8三亲本接合实验 302．3．9缺失突变体的构建与互补 302．4植株实验 ．312．4．1致病性实验 312．4．2过敏反响实验 3l第三章结果与分析 ．333．1生物信息学分析 ．333．1．1基因XC3067与瑚∞D卯的根本特征和结构域分析 ．．333．1．2XC3067与XC3068蛋白质序列比对 353．1．3小结 373．2缺失突变体的构建 ．373．2．1重组质粒的构建 383．2．2缺失突变体的验证结果 423．2．3小结 ．473．3反式互补菌株的构建 ．473．3．1重组质粒的构建 473．3．2互补菌株的验证结果 483．3．3小结 ．493．4突变体的生理生化表型检测结果 ．493．4．1营养缺陷性检测结果 493．4．2在MMX和NYG培养条件下生长曲线的测定结果 ．．503．4．3胞外多糖的检测结果 513．4．4胞外纤维素酶的检测结果 52X万方数据3．4．5胞外淀粉酶的检测结果 3．4．5胞外淀粉酶的检测结果 533．4．6胞外蛋白酶的检测结果 543．4．7游动性的检测结果 553．4．8胁迫实验结果 563．4．9小结 ．583．5植株实验结果 ．583．5．1致病力检测结果 583．5．2过敏性实验结果 593．5．3小结 ．603．6XC3067与XC3068的表达与调控关系 一613．6．1总RNA的提取 613．6．2RNA的消化 ．613．6．3共转录验证结果 623．6．4基因间的调控关系结果 633．6．5小结 ．63第四章讨论与结论 ．644．1讨{念 ．．644．1．1突变体DM3067与DM3068不是营养缺陷型 644．1．2基因XC3067与XC3068不影响8004的生长 644．1．3基因XC3067与XC3068不影响大多数致病生化因子 一644．1．4基因XC3067与XC3068影响蛋白质变性剂的耐受程度 一654．1．5基因XC3068与致病性相关，基因XC3067和XC3068与过敏反响相关654．1．6基因翔口舾7与．黝0础位于同一转录单元，共用一个启动子 一664．1．7初步判断基因XC3067与XC3068是一对双组份信号转导系统基因 一674．2结论 ．67参考文献 68致 谢 ．76攻读学位期间发表论文情况 78XI万方数据第一章第一章弗一早刖 苗1．1双组份信号转导系统的相关进展1．1．1双组份信号转导系统的简介与分布双组份信号转导系统(Two-componentsignalregulationsystems，简称TCSs)是微生物感受外界刺激的最重要的信号传导系统【l】。典型的TCSs由一个具有特殊细胞跨膜结构的组氨酸激酶蛋白(histidinekinase，HK)和一个存在于胞内的响应调节蛋白(responseregulator，RR)组成【1】。HKs经常以双体形式存在，每个HK的膜外的感应功能域感受不同的外部环境因子的刺激，通过与之相连的ATPase功能域利用ATP自磷酸化胞内的HisKA功能域保守的组氨酸残基，随后将磷酸基团转移到胞内相对应的响应调控蛋白接收功能域的天冬氨酸残基，从而改变响应调控蛋白输出功能域活性，最后激活下游靶标基因的转录【2，3】。不同的响应调控蛋白含有不同类型的调控功能域[4】，大多数调控功能域属于HTH(helix．turn．helix)DNA结合功能域(例如，OmpR、NarL和NtrC家族)，其他类型的调节功能域包括拥有酶功能的功能域(例如，CheB甲基化酶)[a】，磷酸化的接收功能域通过改变调控功能域的活性，继而通过结合目标基因的启动子区调控转录以及影响不同的细胞进程，例如，生物膜的形成、蛋白质降解、调节渗透压和对抗生素产生抗性等等【51。除了典型的两步式磷酸基团转移外，TCSs还存在更复杂磷酸基团的转移方式，激活RRs所需要的磷酸基团需要经过多步反响才z日‘匕l-,到达最终位置[2】。随着越来越多的微生物的基因组序列被公布，越来越多的编码双组份系统的基因被注释，然而在不同的微生物之中编码双组份系统的基因的数目存在很大的差异。HKs在基因组中所占的比例相对较少，HKs一般占全基因组的0．26％和O．65％之间【1】，一般来说，相比拟寄生微生物来说，非寄生微生物编码更多的信号系统【61。在己测序植物病原细菌中，Xylellafastidiosa编码的双组份系统最少，而Pseudomonassyringae那么拥有最多数目的双组份系统基因【71。双组份信号转导系统普遍存在于细菌界，感受蛋白基因和响应调节蛋白基因是两种重要的基因家族，不同的基因家族中的基因具有很高的同源性[8】。感受蛋白和响应调节蛋白都可以通过基因序列的同源性分析加以鉴别，许多不同种的细菌感受蛋白与调节蛋白数量相同(图1．1A)。通过分析知道双组份基因的数量与万方数据基因组大小是相关的，通常情况下，随着基因组长度的增加，所包含的双组份基因数量基因组大小是相关的，通常情况下，随着基因组长度的增加，所包含的双组份基因数量增加(图1．1B)。此外双组份基因的多少还与细菌本身适应环境相关[8,9,10,11】，细菌生长的环境越单一，危害性因素越少，那么细菌体内的双组份调控基因越少。例如，许多细胞内寄生虫或者内共生菌只有很少量的信号通路。相反，如果细菌抵抗外界变化多端的环境，那么会编码出大量的信号蛋白，Myxococcusxanthas有136个组氨酸激酶和127个响应调节蛋白，Nostocpunctifor朋P有160个组氨酸激酶和98个响应调节蛋白[12】。细菌基因组含有的双组份信号基因与它们所处环境的波动情况有关系。虽然大多数革兰氏阴性菌和蓝藻含有大量的双组份信号转导系统【10,13】，但是在古细菌和真核生物体内双组份存在的数量较少，在真核生物体内发现的多是杂合激酶和磷酸转移子，这是否与它们选择性压力来抵抗不标准的生活环境有关，目前还不清楚。古细菌和真核生物的双组份通路被认为起源于细菌【l，10,14]。植物获得双组份通路是通过染色体基因整合了叶绿体内的基因而得到的[15】。植物体内的双组份是通过复制，组织多样性和现在所谓的整适宜应环境的变化【16】。双组份系统还被发现存在于酵母，丝状真菌，黏菌，植物体内，但是在高级的真核生物和后生动物没有发现有双组份基因，包括人类也是没有双组份信号转导基因[17，18】。在真核生物体内，它们需要更长，更稳定的信号输出装置确保细胞与细胞之间的联系和磷酸转移，基于这样的原理许多双组份调控基因通路在真核生物体内是不转录的，而是用许多细胞质的其它蛋白质代替。例如，Saccharomycescerevisiae位于细胞膜上的Slnl．Ypdl．Sskl的磷酸转移调节机常lJ[19]。生物体内的双组份系统到底起源于哪里?目前尚无结论。但是有一条线索显示组氨酸激酶的远古起源与热激蛋白Hsp90，错配修复蛋白MutL，II型拓扑异构酶的ATP结合结构域相关[20,21]。这种蛋白质名叫GHKL亚家族，通常是结合ATP，在一定条件下可以使ATP水解，这样就解释了感受蛋白中的DHp结构域功能。但是到目前为止没有发现响应调节蛋白的起源。2万方数据4．1404．140粕肭12100 G6舯肌蛳∽蜘尺．metallidurans IP，撕uginoSa N·pu槭forme-◆〞℃．crescentus；Rj目bstii’8．thetaiotaomicronm∞cocI岍∞．J．IO．Joo广c3Z雹0 20 40 60 80 100 120 140 160 180Numberofhistidinekinases圄250 M．xanth盎N．punctiformeG．bemidji譬OSIs．·．C．crescentus ～麓徽瑚s150100 L尺．jostii。．b訾哪～脚￡UO?JIZ0 100020003000400050006000800090000000Totalnumberofproteinsingenome图1．1细菌中双组份信号基因的多样性【22】Fig．1一lDiversityoftwo—componentsignalinggenecontentinbacterialgenomesA中的点代表不同生物体内的组氨酸激酶和响应调节蛋白的数量。大多数基因组中组氨酸激酶和响应调节蛋白数量相等，正如典型的双组份信号转导系统的一个激酶对应一个响应调节蛋白，但是也有它们的数量不是1：l的时候。B中的点代表双组份信号转导系统的数量与基因组大小的关系，往往基因组越大，双组份信号转导系统的数量越多。A图和B图是基于504个细菌基因组绘制【23】。1．1．2双组份信号转导系统中HKs的功能域典型的TCSs主要由感受外界环境刺激的组氨酸激酶感受蛋白(histidinekinase，HK)和执行着调控下游基因表达的作用的响应调节蛋白(responseregulator，RR)组成。nKs经常以双体形式存在，每个HK的胞外感应功能域感受不同的外部环境因子刺激，通过与之相连的ATPase功能域利用ATP自磷酸化胞内的HisKA功能域保守的组氨酸残基，随后将磷酸基团转移到胞内相对应的响应调控蛋白接收功能域的天冬氨酸残基，从而改变响应调控蛋白输出功能域活性，最后激活下游靶标基因的转录【24】。3万方数据组氨酸激酶包括双体化和磷酸受体(HisKA和HisKA-_2)功能域和HATPase—c功组氨酸激酶包括双体化和磷酸受体(HisKA和HisKA-_2)功能域和HATPase—c功能域。典型的组氨酸激酶包含两个保守的结构域：保守的C端(CA)和组氨酸磷酸传递结构(Dimerizationandhistidinephosphotransferdomain，简称DHp)，又叫作HisKA(图1．2)。多数nKs包含多个感受功能域，如PAS、GAF、HAMP、PAC、HPt和CheA等125]，Hpt(Histidine．containingPhosphotransferdomain)功能域可将磷酸基团从一个接收功能域转到另一个接收功能域参与到多步磷酸基团传递链当中【261，从而形成复杂的信号转导网络。CheA功能域接收信号和接受趋化蛋白(methylacceptingchemotaxisprotei‘ns，简称MCPs)相互作用继而影响鞭毛旋转[271。PAS和GAF结构域，它们能感受包括胞内氧、一氧化碳、光和中间代谢产物等多种信号的刺激[28】。PAS功能域一般和PAC功能域直接相连一起形成PAS的3D构象，PAS功能域和PAC功能域的分化主要是因为两个功能域连接部位序列的差异【29，30】，有研究说明，PAS功能域是EAG-IikeK+通道【3l】。PAS结构域通常相邻并为于蛋白的N．端【32】，这种结构揭示感受蛋白之间的共同模式：感受蛋白N．末端的输入功能域如PAS感知的信号，往往通过配体结合或辅助因子的修饰，从而信息传送到C．端的输出功能域[331。PAS功能域通常是蛋白质相互作用的重要介质，例如和孢子形成有关的激酶KinA和群体感应蛋白LuxQ[34，351。PAS功能域也与信号传输和亚细胞定位有关，例如，突变植物光敏色素B在N一端PAS结构域将阻止光信号的传递【36】，而一个C一端PAS功能域提供一个核定位信号1371，PAS功能域在在序列上的相似性比拟低【38】。1．1．3双组份信号转导系统中RRs的功能域典型的响应调节蛋白根本都有两个结构域，一个是保守的N端(REC)，一个是磷酸输出功能域(outputdomain)(图1．2)。REC功能域催化磷酸基团的转移，并且调节输出功能域的活性，不同的输出结构域行使不同的调控功能，引起下游基因不同的响应应答【391。在己发现的REC结构域中，有17％的CheYREC存在于原核生物体【40J，大多数响应调节蛋白的输出结构域含有DNA结合结构域(DNA。bindingdomain，简称DBD)【4l】。另外还有酶催化结构域，例如，趋化性甲基酯酶CheB，GGDEF二鸟苷环化酶，HI)．GYP磷酸二酯酶等，这类蛋白主要调控c．di．GMP通路【42】。还含有类Hnr调控因子和6因子的HPt、GAF、RpoS、PAS和cNIV伊功能域【43】。响应蛋白的调控机理主要是磷酸化使非活性物质转化为有活性的调节蛋白质，非磷酸化的NtrC的ATPase处于非活性状态，REC结构域接收磷酸基团后促进ATPase结构域和邻近的ATPase组万方数据合，进而处于有活性状态【删。一合，进而处于有活性状态【删。一一一一一图1．2双组份调控系统转导结构域【22】Fig．1-2Overviewoftwo-componentsignaltransductiondomainTM：跨膜结构域；DHp：组氨酸磷酸传递结构域；CA：保守C端结构域；含有不保守结构域(PAS、HAMP、GAF)；RD：接收结构域；DBD：DNA结合结构域；AAA+：AAA+结构域；methyltrans：甲基转移酶结构域。1．1．4双组份信号转导系统的通路不同的环境刺激信号被不同的HKs的感受功能识别，形成不同的信号传导系统，同时控制RRs的磷酸化水平。大局部RRs仅在磷酸化以后起功能才被激活【45】，影响RRs磷酸化状况的任何外在条件或产物都将影响RRs的生化功能，因而，RRs的磷酸化不仅仅由一个特殊的HK所决定，同时一些基因的产物都将会刺激或者抑制RRs的磷酸化水平。理论上，这些产物可以作用于TCSs磷酸基因传递链的任何一步，包括nKs的自磷酸化，磷酸基团从aKs传递到RRs，RRs的去磷酸化以及RRs的输出功能域活性。双组份信号转导系统磷酸传递主要包括经典一步传递法(图1-3A)、感受蛋白杂合子传递法(图1-3B)和交叉传递法(图1．4)。磷酸一步传递方式是双组份信号转导系统应用最广泛的传递方式。组氨酸激酶感受外界信号后自身组氨酸残基发生磷酸化，然后将磷酸基团转移到响应调节蛋白的RECS万方数据结构域Asp残基上，发挥调控下游基因的功能。它是大多数原核生物主要的信号转导机制，在大肠杆菌诱导ato结构域Asp残基上，发挥调控下游基因的功能。它是大多数原核生物主要的信号转导机制，在大肠杆菌诱导atoDAEB操纵子表达的AtoS．AtoC系统属于该传导方法146]。感受蛋白杂合子传递方式是一些双组份信号转导系统，感受外界信号的组氨酸激酶不仅含有组氨酸激酶残基His，还含有REC结构域，有的甚至含有多个REC结构域，磷酸基团的传递如同“接力〞，在几个REC结构域之间依次传递【4刀。出现这种传递途径的原因可能有两方面，第一微弱的外界信号可以通过多级传递放大，第二复杂的双组份系统提供了多调控结合位点【躺】。A ClassicalTwo·ComponentSystemB HybridTwo-ComponentSystem面金宁夕图1．3经典和杂合双组份系统【481Fig．1-3Schematicdiagramofclassicalandhybridtwo—componentsystems．A：经典的双组份信号转导系统，包含一个有跨膜结构域的感受激酶，一个响应调节蛋白；B：杂合双组份信号转导系统，感受激酶和响应调节蛋白都位于膜上，组氨酸把磷酸基团传递给自身相连的天冬氨酸残基。TM：跨膜结构域；DHp：二聚体／组氨酸磷酸传递结构域；DBD：DNA结合结构域；AmCI-rrH：maC螺旋．转叠．螺旋DNA结合结构域。在研究双组份信号转导系统中，有人发现除了上述两种信号传导通路，还存在着一类被称为cross．talk的传导方式149】。交叉传递主要有三种情况：(1)一个组氨酸激酶对应两个或者多个响应调节蛋白，就是所谓的“onetomany〞模式，该模式主要存在于细菌的趋化性调节，例如，CheA接收信号后把磷酸基团传递给CheY和CheB[50l。(2)两个或者多个组氨酸激酶传递磷酸基团至同一个响应调节蛋白，就是所谓的“manyto6万方数据one〞one〞模式，该模式主要调节细菌的群感效应，例如，Vibriharveyi的LuxN／LuxQ／CqsS—LuxU系统【51】。(3)两对或者多对双组份调控系统的组氨酸激酶不仅将磷酸基团传递给自己的响应调节蛋白，还传递给其它双组份的响应调节蛋白。这种传递模式相对较复杂，也是细菌的复杂调控网络的重要组成局部。例如，大肠杆菌的NarQ-Narp和NarX-NarL属于此类复杂调控系统【52】。见图1—4。@ @l|O．．×掣-=■：；；；；，^，@>一RRl RR2图1．4信号转导模式㈣F远．1-4Thetwo-componentpathways1．2十字花科黑腐病菌研究进展1．2．1十字花科黑腐病菌概述十字花科黑腐病菌(Xanthomonascampestrispv．campestris，简称Xcc)是引起十字花科植物(如油菜、甘蓝和萝卜等经济作物)黑腐病的病原细菌【53】，能引起大局部十字花科类植物产生黑腐病，给世界上的农业经济造成重大损失【54】。Xcc是一个高G+C含量的革兰氏阴性菌，Xcc整个侵染植物的过程一般要经历腐生、到附生、再到内生和寄生阶段，Xcc遇到寄主植物之前该菌为腐生菌，当在环境中遇到适宜的寄主后，病原菌通过寄主植物叶表的水孔或着叶缘边上的伤口浸染植物体，并在植物体内快速增殖，菌体会沿植物的维管束蔓延，形成对植物的有力致病性感染【5l】。该病原菌引起的典型病症是在受害十字花科植物叶片部位形成倒三角型黑色病斑，随着病斑的蔓延，叶脉逐渐变黑，故称之为黑腐病【53】。目前，全世界常用的Xcc菌株是ATCC33913、B100和8004，本研究所用模式菌株为本实验室参与完成全基因组测序的菌株Xcc8004，以下简称为8004。7万方数据广西大学硕士学位论文 广西大学硕士学位论文 十字花科黑腐病菌一对假定笪墼塑堕堡量整曼壅塾叁固丝垫丝堑室8004的基因组共为5，148，708kb，其中包含着4273个开放阅读框，每个开放阅读框的平均长度为1033bp。此外8004的细胞内没有发现质粒，只含一条环状的染色体，其中的G+C含量为64．94％[551。该菌的致病机理的调控成为近些年研究病原菌致病机理的热点，主要的致病生化因子包括胞外多糖，脂多糖，胞外酶和III型效应物【561。目前认为黄单胞菌中的致病系统主要有两个，一个是基于nrpG和HrpX调控的T3SS效应物体系【571，另一个是受群体感应系统调控的致病生化因子体系[ss，591。1．2．2双组份信号转导系统在8004中的研究进展8004共有111个双组份信号转导系统基因，55个感受基因中的30个与回应调控基因成对存在，很有可能组成一个双组份信号转导系统，25个感受基因和26个回应调控基因独立存在于基因组中【删，另外，3个HKs和2个RRs未被注释。作为研究微生物与寄主相互作用分子机理的模式菌，8004的致病调控机制一直是人们关注的焦点，我们全面的分析了8004基因组中TCSs蛋白，感受外界环境因子的变化的过程中起到直接或间接的关键作用，如此大量的TCSs蛋白是8004适应不同环境和侵染不同的植物所必需的[61—62631。尽管二十多年来人们己从8004鉴定了近百个致病相关基因，但其中只有hpaS／hpaR2、hrpG、rp3℃／G、COIS／R、ravS／R、vemR和．毗K倪俘等几个属于双组份系统基因，并且它们调控致病过程的分子机制也还远没有研究清楚。根据对十字花科黑腐病菌前期研究可知，hrpG属于TCS的调控子OmpR家族成员【64J，是T3SS致病系统的主要调控子，也rJcc中目前己知的该致病系统的最上游的调控子【65】。最近相关文献报道，hpaS可能通过激活HrpO，从而调控T3SS的表达进而影响致病和过敏反响【52】。r#G／C是8004中研究最多、作用机理最清楚的TCSs基因，活化状态的IⅫfG能降解C—di．GMp[561。研究说明RpfC／Rpf系统通过感受包括DSF在内的信号来激活下游基因的表达，同时RpfC负调控DSF的合成157]。DSF／Rpf调控系统正向调控胞外酶和胞外多糖的合成【611，而且还负向调控细菌生物膜形成与解聚以及细胞群体感应等【66,67】。RavR／S参与对低氧胁迫的感受，并调控耐受相关基因的表达。推测RavR是通过响应群体感应系统感受低氧信号，经由全局调控子Clp来调控致病基因的表达的【681。COIRIS(也称vgrR／S)，在8004菌株中与叶表定殖、抗逆能力、致病力及过敏性相关【69】。研究结果说明，colR／S基因与8004的早期侵染有关[691，并只调控hrpC和励加两个hrp操纵子的表达而不调控其它hrp操纵子，也不受HrpG,ni-kpX的调控[691。vemR的编码产物仅具有REC结构域，在8004菌株中己被证实与该菌的胞外多糖产量、运动R万方数据性和致病力相关[601。SreK／SreR／SreS组成的三组分信号系统的研究说明性和致病力相关[601。SreK／SreR／SreS组成的三组分信号系统的研究说明，SreS参与到SreK／R的磷酸化，并调控eXcc在盐离子压力下的抗逆过程。去磷酸化的SreR反响调控sreK／sreR／sreS／hppK操纵子，从而调控叶酸合成调控基[]hppK的表达[70】。GntR家族的研究说明，hapRl感受外界信号后，通过调节hrpG基因的表达影n(可hrp基因簇的功能，从而影响致病力和过敏反响【7l】。一般认为，HKs和其对应的RRs在基因组上相互靠近并且转录方向一致，但也有例外，肥2227f配222删229在基因组上顺序排列，XC2227／XC2228转录方向为正向而XC2229转录方向为反向【72】，其在Xanthomonasoryzaepv．oryzae中的同源基因分别为PXO01020／PXO01019／PXO01018，其中PXO01020／PXO01019转录方向一致而尸如01018那么与它们相反。在Xanthomonascampestrispv．campestris中RavS(XC2227)／RavR(XC2228)组成一个TCS[681，而在Xanthomonasoryzaepv．oryzae中，PdeK(PXO01018)／PdeR(PxO01019)组成的一个TCSs通过调节c．di．GMP的浓度调节的致病性[73】。这种不同微生物间HKs和RRs组合的多样性也为我们研究TCSs的信号途径进化现象的可能机制提供了新的思路。8004中存在大量的HKs和RRs说明，TCSs在8004适应不同的寄主植物和非寄主植物环境中起着重要的调控作用。特别需要关注的是在8004的基因组中存在大量的不成对的HKs和RRs，称为“孤儿〞HKs和RRs。这些“孤儿〞HKs和RRs为8004感受不同的环境并作出反响提供了更多可能的信号转导途径。利用遗传和生化研究的方法将有助于在分子水平上探索某些TCS蛋白质介导的信号转导通路，如TCSs基因缺失突变体的构建和分析，以确定HKs的感受信号和每个系统中RR的靶基因。此外，这些信号转导通路解开也为防治8004病害提供了新的策略。在8004的55个HKs中，有23个HKs存在最少1个，最多12个跨膜结构域，30对TCSs中的19个HKs具有跨膜结构域，说明其感受功能域能够监测到外界环境的变化。而26个“孤儿〞HKs中只有4个HKs具有跨膜结构域，其中XC4167编码的HyHKs具有12个跨膜结构域，其功能目前还不清楚。HKs具有跨膜结构域的19对TCSs中，其RRs的输出功能域属于DNA结合功能域以及酶。没有跨膜结构域的HKs一般被认为不能感受胞外信号，例女1]CheA、NtrB、KinA、KinB和KinC等[74】，但在其N端，大局部具有胞内感受功能域，!／I]PAS和GAF，说明它们能感受包括胞内氧、一氧化碳、光和中间代谢产物等多种信号的刺激【74】，并且多数HKs包含多个感受功能域，见图1．5。8004的RRs功能域的组合区别十分大，根据RRs的功能域分析可把它们划分到不9万方数据同的类另Ut7sl，典型的RRs的功能域一般包括N．端的一个接收功能域REC以及C．端的一个输出功能域，该输出功能域包括DNA结合功能域(OmpR、NarL、NtrC和LytTR)，同的类另Ut7sl，典型的RRs的功能域一般包括N．端的一个接收功能域REC以及C．端的一个输出功能域，该输出功能域包括DNA结合功能域(OmpR、NarL、NtrC和LytTR)，RNA结合功能域ANTAR【76]，酶功能域(CheB、GGDEF、EAL和HDc)。27个RRs具有DNA结合功能域，10个RRs具有酶功能域，1个RRs具有RNA结合功能域，16个RRs只具有一个REC结构域，该类RRs被认为和蛋白质发生作用【77】。在8004的RRs中除了XC2233(包含CheW功能域)和XC2965(包含Hpt功能域)外，其他RRs没有与蛋白质或配体结合的输出功能域(CheW、PAS和GAF等)，这些蛋白质结合功能域一般在HKs中编码。Conservedcorestructure HKtypeTypelA0aytnid)TypeIB善詈一 TypeIC孵对一 0aybria)TypeIBTypeIDTypell叵)司<亟≥七亘三k套㈣T)t圮II(a一瓯＼鲤川竺鳖I TypelT!TypeIVTypeV图1．58004基因组中HK的保守结构域Fig．1-5TheconservedstructuresofilKtypesat8004genomelO万方数据1．3本研究的主要目的、内容和意义1．3．1本研究的主要内容1．3本研究的主要目的、内容和意义1．3．1本研究的主要内容8004共有111个双组份信号转导系统基因，目前仍有很多双组份信号转导系统基因的功能还不清楚，包括XC3067和XC3068这对推测的双组份信号调控系统基因。根据前期突变体库筛选结果，本研究结合生物信息学分析，确定了要研究的目的基因一一8004基因组中的一对假定双组份信号转导基因XC3067与XC3068。首先，采用同源双交换策略分别构建XC3067与XC3068的缺失突变体DM3067与DM3068，及双缺失突变体DM3067／3068，对突变体进行根本的生理生化表型检测、抗逆性检测、致病性检测和过敏反响检测，发现突变体与野生型在抗蛋白质变性剂，致病力和HR反响有差异，因此构建突变体的反式互补菌株。RT-PCR分析了基因XC3067与XC3068的表达调控关系。1．3．2本研究的主要目的和意义双组份信号转导系统是病原菌感受外界环境变化并作出反响的最重要的信号传导系统，但是目前对8004双组份信号转导系统基因功能的研究还比拟少，具体的作用和调控机制还不清楚。本研究将通过研究XC3067与XC3068这对假定双组份信号转导系统基因的调控机制，对深入了解XC3067与XC3068在病原菌信号转导和致病调控网络的作用都具有重要意义。万方数据第二章材料与方法2．1材料第二章材料与方法2．1材料2．1．1应试植株本研究用到的植物材料，如表2．1所示：表2．1本研究所用植物Table2—1Plantsusedinthisstudy本研究所用到的植物有满身红萝卜苗和ECW-10R辣椒苗。满身红萝b苗：满身红萝b的种子发芽后种植在塑料盆中，在温室培养一个月左右到达4．5叶龄期，用于黄单胞菌致病性实验。ECW-10R辣椒苗：辣椒的种子发芽后种植在小盆中，在温室培养2．3个月到达6叶龄期，用于黄单胞菌过敏反响实验。2．1．2应试菌株本研究需要用到的菌株和质粒，见表2．2。12万方数据表2．2本研究用到的菌株和质粒Table表2．2本研究用到的菌株和质粒Table2-2Strainsandplasmidsinthisstudy菌株与质粒 性质 源于ECOliDH5relA1△(1ac-proAB)F’【lacD，lacZAM15】 本实验室ED8767 RecA56，metB，hsdS，supE，supF,含有pRK2073，Spc’本实验室DH5a中含有pKD3067重组质粒 本研究DH5Ⅱ／pKD3067DH50【／pKD3068 DH50t中含有pKD3068重组质粒 本研究DH50．／DKD3067／3068 DH5ct中含有pKD3067／3068重组质粒 本研究DH5d／pLC3067 DH50t中含有pLC3067重组质粒 本研究DH5仅／DLC3068 DH5a中含有pLC3068重组质粒 本研究Xccstrains8004 野油菜黄单胞菌野油菜致病变种，Rif 本实验室DM3067 8004中XC3067的缺失突变体，Rif 本研究DM3068 8004中．配3D钾的缺失突变体，Rig 本研究DM3067／3068 8004中XC3067与XC3068的缺失突变体，Rif 本研究C3067 突变体DM3067中转入pL3067质粒，R．if，Tcr 本研究C3068 突变体DM3068中转入pL3068质粒，Rif，W 本研究PlasmidspLAFR3 广宿主接合转移载体，Tc‘ 本实验室pRK2073 帮助质粒，Tra+，Mob+，CoiEI，Spc‘ 本实验室pKl8mobXcc中自杀式质粒，Kan。本实验室pK18mobsacBpKl8mob上连有一段sacB基因，Kan‘本实验室pKD3067XC3067基因的左臂和右臂连接到pKl8mobsacB质本研究粒上，KanrpKD3068 XC3068基因的左臂和右臂连接到pKl8mobsacB质本研究粒上，KanrpKD3067／3068 XC3067与XC3068基因大片段的左臂和右臂连接到 本研究pKl8mobsacB质粒上，Kan‘pL3067 XC3067整个ORF序列连接到pLAFR3质粒上，W本研究pL3068 XC3068整个ORF序列连接到pLAFR3质粒上，Tcr本研究13万方数据2．2常规微生物学操作2．2．1细菌培养基2．2常规微生物学操作2．2．1细菌培养基本研究所要用到的培养基都是需要用去离子水配制，并且用灭菌锅进行湿热灭菌，方可使用。一般培养基可在121℃，101KPa，条件下灭菌15．20min；MMX，SOC等培养基在115。C条件下灭菌15min。2．2．1．1培养黄单胞菌的丰富培养基NYGB：其中1000mLNYGB培养基中的成分：Peptone 5．0gYeastextract 3．0gGlycerol 20．0g去离子水定容到1000mL，pH调至7．0。NYGA：按照NYGB培养基中含有1％(W／V)的量参加琼脂粉。2．2．1．2培养黄单胞菌的诱导培养基MMX：每1000mL液体MMX培养基中的成分如下，Glucose 5．0gNa3C6H507 1．0g(NH4)2504 2．0gK2HP04 4．0gKH2P04 6．0gMgS04‘7H20 0．2g去离子水定容至1000mL，pH调至7．02．2．1．3大肠杆菌培养基LB：每1000mLLB培养基中的成分如下，Yeastextract 5．0gTrytone 10．0gNaCl 10．0g14万方数据亡亘盔堂塑±堂垡鲨塞 亡亘盔堂塑±堂垡鲨塞 ±皇煎登墨煎煎堕=壁堡墨丝壑丝堕垡量蕉曼丕丝叁垦塑盟丝塑塞加水定容至1000mL，pH调至7．0。LA：LB培养基按照1％(WⅣ)的量参加琼脂。SOC：培养感受态的大肠杆菌的液体培养基，每1000mLLB培养基中所含成分如下：Trytone 10．0gYeastextract 5．0gNaCl 10．0gGlucose 4．0gMgS04‘7H20 2．5gMgCl2’7H20 2．03g加水定容至1000mL，pH调至7．0。2．2．2菌株的培养2．2．2．1细菌的活化从．80℃冰箱取出待活化菌株迅速置于冰盒上，在超净台内用灭菌的牙签挑取少量冰渣放在提前准备的培养基平板上，在超净台中静止晾干，倒置培养在适宜温度的恒温培养箱内1．2天。2．2．2．2大肠杆菌的培养固体培养基上培养：把菌种接种在LA培养基上，在37℃恒温培养箱内平板倒置，静置12—16小时；液体培养基内培养：把菌种接种在LB液体培养基中，于37"C，200rpm摇床内培养12．16小时。2．2．2．3黄单胞菌的培养固体培养基上培养：把菌种接种在NYGA培养基上，在28。C恒温培养箱内平板倒置，静置16．24小时；液体培养基内培养：把菌种接种在NYGB液体培养基中，于28。C，200rpm摇床内培养18．24小时。2．2．3菌株的保存用微量移液器取7509l新鲜过夜培养的菌液于灭菌的Eppendorf(EP)管内，再加入7509l无菌的50％甘油，将两者充分混匀，可以根据后期使用量选择保存一管或者多万方数据管，放置在．80。C冰箱长期保存或者放置在．20。C冰箱可以保存半年。2．2．4常用试剂与缓冲液管，放置在．80。C冰箱长期保存或者放置在．20。C冰箱可以保存半年。2．2．4常用试剂与缓冲液本研究经常用到的抗生素见表2．3。表2—3抗生素浓度表Table2-3Theantibioticusedinthisstudy注：抗生素在液体培养基内的使用浓度为在固体培养基的一半。抗生素的灭菌一般用过滤法除菌。下面的所有试剂均使用超纯水配制，局部溶剂需要经过高压湿热灭菌(1．0MPa，20min)后使用。有些试剂不能灭菌(如NaOH、SDS、HCl、IPTG、酚类、氯仿和冰乙酸等)。有些试剂易炭化变黄，需采用减压灭菌(115℃，15min)，或着是过滤除菌(如葡萄糖溶液)。常用溶液与缓冲液如下：16万方数据试剂： 试剂： 终浓度(或需要量)：(1)SolutionIGlucose 10mMEDTA(pH8．0) 25mMTris-HCI(pH8．01 10mM(2)SolutionIISDS l％NaOH 0．2M(3)SolutionIIIKAc(PH4．8) 3M(4)LysisBufferTris-Ac(pH7．8、 40mMNaAc 20mMEDTA 1mMSDS 1％(W／V、(5)10×TBE"Iris 108g／1000mLBoricacid 55g／1000mLEDTA(O．5M，pH8．0) 40mL／1000mL(6)电泳上样缓冲液Ficoll(聚蔗糖) 15％(WⅣ)溴酚蓝 0．1％(WⅣ)EDTA(pH8．0) 40mM(7)NaCI溶液 5M(8)50％甘油溶液 50％(V／V)(9)lO％甘油溶液 lO％(V～)(10)CuS04 500inM(11)葡萄糖溶液 20％(12)脱脂牛奶 10％(13)可溶性淀粉 10％(14)CMC 10％(15)20×SSC(1000m1)柠檬酸 88．23g氯化钠 175．329(16)马来酸buffer(1000ml，pH7．5)马来酸 11．61g氯化钠 8．775g(17)检测液(1000ml，pH9．5)Tris 12．1g氯化钠 5．85g万方数据2．2．5突变体营养缺陷型检测在2．2．5突变体营养缺陷型检测在根本培养基(MMX)平板上检测。取培养过夜的新鲜菌液，离心收集菌体，用MMX培养基重悬，紫外分光光度计测定OD600，用不加抗生素的MMX液体培养基统一调至OD600=0．1，用微量移液器吸取2uL菌液点在不含抗生素的MMX固体培养基平板上，在28。C恒温培养箱静止倒置二到三天，根据菌落直径大小和形态比拟，以8004为对照，观察菌株在MMX固体培养基平板上生长情况是否不同，实验需重复三次。2．2．6胞外多糖的检测接种待检测的菌体于小白盖瓶内培养，小白盖瓶内提前装入NYGB培养基，并加入抗生素，小白盖瓶固定在28℃，200rpm摇床过夜，再将过夜培养的菌液用紫外分光光度计测定ODs00，通过计算，用无抗生素的培养基调为OD600=0．1，用微量移液器取2此菌液点在不含抗生素，含有2％(WⅣ)葡萄糖，不含抗生素的NYGA平板上，超净台内待菌液晾干，倒置于28℃恒温培养箱培养48h观察，观察菌落的形态，并且测量菌落的直径。2．2．7胞外酶的检测2．2．7．1胞外蛋白酶的检测接种待检测的菌体于小白盖瓶内培养，小白盖瓶内提前装入NYGB培养基，并加入抗生素，小白盖瓶固定在28。C，200rpm摇床过夜，再将过夜培养的菌液用紫外分光光度计测定OD600，通过计算，用无抗生素的培养基调为OD600=0．1，用移液器吸取2此菌液接种于含1％(WⅣ)的脱脂牛奶，不含抗生素的NYGA平板上，超净台内待菌液晾干，在28。C恒温箱内静置二天，根据水解圈的有无或者大小来判断胞外蛋白酶产生情况，并且测量水解圈的直径(H)和菌落直径(C)，根据相对酶活力计算公式：相对酶活力=(H2．C2)／tC2。2．2．7．2胞外淀粉酶的检测接种待检测的菌体于小白盖瓶内培养，小白盖瓶内提前装入NYGB培养基，并加入抗生素，小白盖瓶固定在28。C，200rpm摇床过夜，再将过夜培养的菌液用紫外分光光度计测定OD600，通过计算，用无抗生素的培养基调为OD600=0．1，用移液器吸取2此万方数据菌液点在含0．1％(W～)可溶性淀粉，不含抗生素的NYGA平板上，超净台内待菌液菌液点在含0．1％(W～)可溶性淀粉，不含抗生素的NYGA平板上，超净台内待菌液晾干，倒置于28℃恒温培养箱培养24h，用1：100的12／Ⅺ(O．08M12，3．2MKI)溶液染色20min，用自来水冲掉多余染液，立即用75％的酒精脱色平板，用吸水纸吸掉多余酒精脱色液，根据水解圈的有无或者大小来判断胞外淀粉酶的产生情况，用尺子精确测量水解圈的直径。2．2．7．3胞外纤维素酶的检测接种待检测的菌体于小白盖瓶内培养，小白盖瓶内提前装入NYGB培养基，并加入抗生素，小白盖瓶固定在28。C，200rpm摇床过夜，再将过夜培养的菌液用紫外分光光度计测定OD600，通过计算，用无抗生素的培养基调为OD600=0．1，用移液器吸取2此菌液点在含0．5％(W／V)的羧甲基纤维素，不含抗生素的NYGA平板上，置于超净台待菌液晾干。在28℃恒温箱内静置一天，用0．1％的刚果红溶液染平板约30min，再用1M的NaCl溶液洗脱两次，每次用时约20分钟左右。根据水解圈的有无或者直径大小来判定纤维素酶的产生情况。用尺子精确测量水解圈的直径。2．2．8细菌游动性的检测接种待检测的菌体于小白盖瓶内培养，小白盖瓶内提前装入NYGB培养基，并加入抗生素，小白盖瓶固定在28℃，200rpm摇床过夜，再将过夜培养的菌液用紫外分光光度计测定00600，通过计算，用无抗生素的培养基调为OD600=0．1，用移液器吸取2止菌液点在含有0．3％(W～)的琼脂，不含抗生素的NYGA平板上，在超净台中静置培养72h，黄单胞菌的鞭毛组织可以使细胞运动，鞭毛运动的速度与致病力强弱也是相关的[，s】，也是重要的致病因子，培养三天后观察菌落的大小，并且测量菌落的直径。2．2．9抗逆性的检测接种待检测的菌体于小白盖瓶内培养，小白盖瓶内提前装入NYGB培养基，并加入抗生素，小白盖瓶固定在28。C，200rpm摇床过夜，再将过夜培养的菌液用紫外分光光度计测定OD600，通过计算，用无抗生素的培养基调为OD600=0．1，用移液器吸取2“1菌液接种在不含抗生素，分别点至含有不同浓度的检测渗透压的NaClNYGA板，检测有机溶剂的酚NYGA平板上和检测蛋白质变性剂SDSNGYA平板上，28℃恒温培养箱培养3天后观察菌落生长情况。以抗逆因子的最低抑菌浓度表示，观察菌落的生长差异万方数据情况。2．2．10生长曲线的测定情况。2．2．10生长曲线的测定2．2．10．1根本培养基(MMX)中生长曲线的测定接种待检测的菌体于小白盖瓶内培养，小白盖瓶内提前装入NYGB培养基，并加入抗生素，小白盖瓶固定在28。C，200rpm摇床过夜，再将过夜培养的菌液用紫外分光光度计测定OD600，离心收集菌体，用MMX培养基调整菌体浓度为OD600=1．0，按起始浓度为OD600=0．1转接到100ml的MMX培养基，放入28。C，200rpm摇床培养，隔8h取2mL菌液测定OD600值，到细菌生长的平台期。实验重复三次。记录菌液OD600值，绘制生长曲线。2．2．10．2丰富培养基(NYGB)中生长曲线的测定将过夜培养的菌液用紫外分光光度计测定OD600，离心收集菌体，用MMX培养基调整菌体浓度为OD600=1．0，按起始浓度为OD600=0．1转接到100ml的MMX培养基，放入28。C，200rpm摇床培养，每4h取2mL菌液测定OD600值，到细菌生长的平台期。实验重复三次。记录菌液OD600值，绘制生长曲线。2．3分子生物学操作技术2．3．1十字花科黑腐病菌基因组DNA提取(1)取过夜培养的8004菌液1～1．5mL参加到离心管中；(2)10000rpm离心30s-1min，弃去上清液，收集菌体；(3)加600此裂解缓冲液，用微量移液器快速轻柔地吹打混匀；(4)加300gL5MNaCI，上下颠倒，使溶液充分混匀，12000rpm，室温离心15min；(5)吸取750p1上清液到一个新的EP管，参加等体积酚／氯仿溶液，颠倒混匀，12000rpm，4。C离心10min，溶液分层，吸取600“1上层澄清溶液至新的离心管；(6)重复(5)步骤一次，吸取400gl上层溶液至新的离心管。(7)参加两倍体积无水乙醇，冰上静止30分钟以上，12，000rpm离心15min，弃上清液；万方数据(8)DNA沉淀用75％7,醇洗两次，室温静置枯燥(8)DNA沉淀用75％7,醇洗两次，室温静置枯燥，溶于50此1×TE中，电泳检测后，．20。C冰箱保存备用。2．3．2细菌质粒的提取(1)取过夜培养的8004菌液1～1．5mL参加到离心管中；(2)10，000rpm离心30s-1min，弃去上清液，收集菌体；(3)参加150gL溶液I，混匀；(4)参加300laL溶液II，轻轻颠倒混匀，室温静置不超过5min；(5)参加150此预冷的溶液III，混匀，室温静置10rain；(6)12，000rpm，4"C，离心10min；(7)吸取500gL上清液至新的无菌离心管，参加等体积苯酚／氯仿溶液，12，000rpm离心10min；(8)吸取400gL上清液到新的无菌离心管，参加等体积氯仿，12，000rpm离心10min；(9)吸取300gL上清液到新的无菌离心管，参加两倍体积的无水乙醇，冰上放置30min以上；(10)12，000rpm，15min；(11)用75％的乙醇洗DNA沉淀两遍，室温静置枯燥后溶于30—50gLI×TE或ddH20；(12)琼脂糖凝胶电泳检测合格后保存于．20"C冰箱。2．3．3DNA的分子生物学操作2．3．3．1DNA的纯化本研究用到的纯化DNA的方法有试剂盒纯化法和酚／氯仿提取法。PCR产物与酶切产物通常可以用酚／氯仿提取法，向DNA溶液中参加相同体积的酚／氯仿溶液，12000rpm，4。C离心15min，取上层清液参加新的离心管中，然后参加两倍体积的无水乙醇，冰上放置30min以上，离心15min后弃去上清液，用75％的乙醇洗DNA沉淀两遍，倒扣吸水纸上，尽量去除75％7,醇液体，室温下晾干，将沉淀溶于50gLddH20，保存在．20。C冰箱。万方数据需要胶回收的DNA片段，通常使用DNA胶回收纯化试剂盒，具体步骤参照说明书进行。需要胶回收的DNA片段，通常使用DNA胶回收纯化试剂盒，具体步骤参照说明书进行。2．3．3．2DNA的酶切DNA的酶切反响选用的内切酶为Promega公司的，根据相应的酶切缓中液，反响体积一般为20～100“L，通常酶的效力为1u的酶可以完全酶切1pg的DNA，质粒一般在37。C条件下酶切4-6小时，总DNA一般在37。C条件下酶切过夜，再在65。C水浴15分钟或苯酚／氯仿抽提终止酶切反响。在离心管中依次参加以下试剂：DNA片段 10此酶切buffer 5“LBSA 0．5UL限制性内切酶 0．5止ddH20定容 50uL2．3．3．3DNA的连接连接反响体积一般为5～20此，载体与外源的DNA分子数之比为1：3至1：6，反响体系的DNA通常为100-20塑高甏掣×黼Ⅱ警)=插入片断(馏ng。对于不同的长度的质粒于外源，可根据公式：载体的大小(肋) 1 。I 载体 J ～V’6(1)在离心管中依次参加以下试剂：载体 100ng外源片段 17ng10×Buffer 1“LT4DNA连接酶 O．1～1儿加ddH20至终体积 10此(2)室温下连接1．3h或4℃连接过夜。(3)转化到感受态细胞，检测连接反响效率。2．3．3．4DNA的电泳(1)凝胶的制备：检测不同大小的DNA片段，采用不同浓度的凝胶，一般DNA22万方数据片段越小，所需的琼脂浓度越大(见表2．4)。先做好制胶模具，在天平上称取适量琼片段越小，所需的琼脂浓度越大(见表2．4)。先做好制胶模具，在天平上称取适量琼脂糖，参加100mL0．5xTBE缓冲液，微波炉加热2min左右，冷却至适宜的温度，倒入制胶盒中，冷却约30min左右，从两侧轻轻地拔出样孔梳，假设不及时用先将胶放如O．5xTBE的盛胶盒，假设及时用可以把凝胶放入电泳槽。表2．4凝胶的制备条件Table2．4Thegelconcentrationusedinthisstu#琼脂糖凝胶浓度(％)DNA分子的别离范围(kb)0．3 5．600．6 1．200．7 O．8．100．9 O．5—71．2 0．4．61．5 O．2．3(2)上样电泳：将与上样缓冲液混合后的DNA样品参加加样孔中，100V，电泳约30min，停止电泳。(3)凝胶成像：用伯乐凝胶成像系统观察、照相。2_3．3．5DNA的测序提取待测菌株质粒，质粒质量、浓度要到达生物公司测序要求，质粒可以溶于ddH20中，送去上海生物工程有限责任公司商业测序。培养基中参加适量的抗生素，接种待检测菌体，过夜培养，取新鲜菌液，参加等体积的50％甘油，混匀，送测序公司测序。2．3．4聚合酶链式反响(PCR)2．3．4．1引物的制备本研究主要是用VectorNTI10．0软件设计引物，引物长度通常为18bp-一30bp，引物的退火温度一般在60℃左右。引物的特异性要高。根据需要可以在引物的5’端添加限制性酶切位点序列和保护碱基序列。引物序列送至生物公司合成，用灭菌超纯水将引物溶解为101．tM的浓度，．20。C冰箱存放备用。本研究所使用的引物见表2．5。23万方数据表2．5本工作使用的引物Table表2．5本工作使用的引物Table2-5Primersusedinthisstudy注：斜体表示限制性内切酶酶切位点。2．3．4．2PCR反响PCR反响体系(20¨L)：24万方数据110xBuffer 2rtLdNTP(2．5mM) 21．tLPrimer-F(10gM) 0．5laLPrimer-R(10gM) 0．5gLTaq聚合酶 0．5gLddH20 13．5gLDNA模板 1¨L反响总体积 20ULPCR反响条件为：PCR反响一般由变性，退火，延伸构成一个扩增循环。步骤l 95℃ 5min／15min步骤2 }7 95℃ 30S55～65℃ 30S72℃ 30s~5min循环30～35次步骤3 72℃ 10min步骤4 4℃ 59min2．3．5RNA的分子生物学操作2．3．5．1细菌总RNA的提取本研究提取8004的总RNA使用的是SVtotalRNAIsolationSystemKit试剂盒，操作流程严格按照试剂盒说明书进行。具体操作步骤如下：(1)取1mL的新鲜菌液(OD600=0．6)，13，000rpm，离心1min，彻底弃去上清；(2)参加100laL无核酶水重悬菌体，参加1“L新鲜配制的溶菌酶(40mg／m1)，轻柔地混匀，室温放置3．5min；(3)参加75gLBufferRLA(RLA)；(4)参加350gLBufferRDA，颠倒混匀；(5)参加200gL95％乙醇到裂解液中，用移液器吸打3．4次混匀，将混合液转移到吸附柱内，12，000rpm离心1min；25万方数据(6)倒掉收集管内滤液，将吸附柱放回收集管内。加600(6)倒掉收集管内滤液，将吸附柱放回收集管内。加600gLBufferRWA到吸附柱中，12，000rpm离心1min；(7)倒掉收集管内滤液，将吸附柱放回收集管内，将50¨L新鲜配制的DNase混合液(40gLYellowCoreBuffer，5uL0．09MMnCl2，5gLDNaseI按顺序混合)直接小心地参加到吸附柱内膜上，并且确认整个膜都被DNase混合液全部覆盖；(8)37。C孵育15min，立即参加200gLDNaseStopSolution(DSA)到吸附柱中，12，000rpm离心1min；(9)倒掉收集管内滤液，将吸附柱放回收集管内，参加600gLBufferRWA到吸附柱中，12，000rpm离心1min；(10)倒掉收集管内滤液，将吸附柱放回收集管内。加250laLBufferRWA到吸附柱中，13，000rpm离心2min，以除去残留的液体；(11)将吸附柱转移到新的离心管内，参加100gl无核酶水，室温放置1min，13，000rpm离心1min，弃纯化柱，离心管内的总RNA贮存于．80。C冰箱保存。2．3．5．2总RNA的消化处理本实验选用Promega公司的RQDNaseI处理，按下边的反响体系依次参加样品：总RNA 40uLRQDNaseI 2止Buffer 5“LRNaseinhibitor 1pLH20(DEPC处理) 2p,L(1)用微量移液器轻轻吸打混匀，37℃孵育1h：(2)短暂离心3-5S，加等体积酚／氯仿(pH4．5)，颠倒混匀，12，000rpm4℃离心15min：(3)收集上层水相于另一无菌的新的离心管中，参加1／10体积的新鲜配制的pH=5．2的3MNaAc，再参加两倍体积的无水乙醇，静止置于．80℃冰箱30min以上：(4)12，000rpm4。C离心15min，尽量弃掉残留液体；(5)用70％的乙醇洗RNA沉淀两遍，在通风橱中枯燥20min；(6)沉淀溶解在20止灭菌的、无核酸酶的水中，贮存于．80。C冰箱备用。(7)检测总RNA中的DNA是否消化完全，以16SrRNA内部片段引物进行常规万方数据PCR，如仍残留DNA成份需进行进一步DNase消化处理。2．3．5．3PCR，如仍残留DNA成份需进行进一步DNase消化处理。2．3．5．3cDNA的合成本研究cDNA的合成是使用RevertAidTM第一链合成试剂盒完成，具体操作步骤如下，(1)取无菌离心管置于冰上，按如下顺序参加试剂：TotalRNA 0．1-5嵋randomhexamerprimer(0．2“∥p．L)1此RNA．freewater定容体积为12“L轻轻混匀，瞬时离心；(2)75℃温育5min，迅速置于冰上；(3)按顺序参加以下组分：5xreactionbuffer 4ULRiboLockTMRibonucleaseInhibitor(20U／pL) 1“L10mMdNTPmix 2“L轻轻混匀并短暂离心；(4)25℃孵育5min；(5)参加1此RevertAidTMM-MuLVReverseTranscriptase(200u／}tL)：(6)短暂离心，25℃孵育10min；(7