五章 植物脱毒技术

千里之行，始于足下。第2页/共2页精品文档推荐五章植物脱毒技术第8章植物脱毒技术（4学时）

目的要求：

(1)掌握植物微茎尖培养的脱毒办法；

(2)普通掌握无毒苗木的鉴定办法；

(3)掌握组织培养脱毒苗在生产上的重要意义；

(4)普通掌握脱毒苗木的保存和利用办法

病毒在植物上的危害

通常危害植物的病毒有几百种，同时随着生产栽培时刻的延长，危害程度越来越严峻，种类越来越多。尤其是靠无性生殖的作物，如利用茎(块茎、球茎、鳞茎、根茎、匍匐茎)，根(块根、宿根)、枝、叶、芽(顶芽、侧芽、球芽、别定芽)等经过嫁接、分株、扦插、压条等途径来举行生殖的。像苹果、葡萄、草莓等。花卉的百合、唐菖蒲、水仙、郁金香、香石竹、菊花等，蔬菜的马铃薯、姜等。而以种子举行生殖的种类，除豆类外，其他均可随着世代的交替而去除病毒，即病毒只能危害一具世代。而在无性生殖的种类中，由于病毒经过营养体举行传递，在母株内逐代积存，危害日趋严峻。一些园艺植物以小规模集约栽培，造成连作危害咨询题，并加重土壤传染性病毒的危害。

病毒的危害给植物生产带来的损失是非常大的，如草莓病毒的危害，使草莓产量严峻落低，品质大大退化。葡萄扇叶病毒使葡萄减产10％～18％，为害马铃薯的病虫害则更多，大约有几十种，所以，给马铃薯生产带来严峻障碍。花卉病毒的危害普通会妨碍花卉的欣赏价值，其表现是花少而小，产生畸形、变群等。

为了提高植物的产量和质量，根除病毒和其他病原菌是很必要的。尽管经过防治细菌和真菌的药物处理，能够治愈受细菌和真菌侵染的植物，但如今还没有啥药物可治愈受病毒侵染的植物。若一具无性系的整个群体都已受到侵染，获得无病毒植株的唯一办法算是消除营养体的病原菌，并由这些组织中再生出完整的植株。一旦获得了一具别带病原菌的植株，就可在别致受到重新侵染的条件下，对它举行营养生殖。用组织培养法消除病毒是唯一行之有效的办法。

由于病毒对植物造成这样严童的危害。因此世界各国都开始重视这方面的研究，如XXX用柑桔茎尖微嫁接生殖无病毒柑桔营养系。美国用组织培养法，使苹果无病毒苗已工厂化育苗，并在全国普遍开展。

第一节无病毒苗哺育的意义

采纳生物、物理、化学等途径防治病毒病收效甚微，甚至毫无成效。自从50年代发觉经过组织培养的办法能够脱除严峻患病毒植物的病毒种类，提高产量、质量。所以，到60至70年代组织培养的技术在花卉、蔬菜和果树等得到广泛的应用。生产无毒苗已形成一种

产业，满脚生产者对这种苗的大量需要。用组织培养办法生产无毒苗，是一具积极有效的途径，由于排除了使用药剂，因此对减少污染，防止公害，爱护环境都有积极的意义。

第二节植物脱毒的办法

一、茎尖培养脱毒

（一）经过茎尖培养脱毒的原理

1.病毒在植物体内的分布

感染病毒植株的体内病毒的分布并别均匀，病毒的数量随植株部位及年龄而异，越靠近茎顶端区域的病毒的感染深度越低，生长点(约0.1～1.0mm区域)则几乎别含或含病毒非常少。这是因为分生区域内无维管束，病毒只能经过胞间连丝传递，赶别上细胞别断分裂和活跃的生长速度。

2.茎尖大小与脱毒效果

在切取茎尖时越小越好，但太小则别易成活，过大又别能保证彻底除去病毒。茎尖培养脱毒，由于其脱毒效果好，后代稳定，因此是目前哺育无病毒苗最广泛和最重要的一具途径。

（二）办法

1.取样与消毒

剪取顶芽梢段3～5cm，削去大叶片，用自来水冲洁净，在75%酒精中浸泡30s，用1%-3%次氯酸钠溶液消毒10～20min，最终用无菌水材料冲洗4-5次

2.剥取茎尖与接种

3.培养

接种后材料置25±2℃，光照度1500～5000lx,每日光照10～16h条件下培养.光照对茎尖培养的妨碍更大

4.生根诱导

一些植物茎尖培养形成绿芽后,基部非常快发生别定根.而另一些植物茎尖别产生别定根,需经再诱导、生根才干成为完整植株

(三)培养基与培养方式

1.培养基

MS培养基适于多种植物茎尖培养。

2.培养方式

在举行脱毒培养时，由于弱小的茎尖组织非常难靠肉眼操作，因而需要一台带有适当光源的简单解剖镜(8～40倍)。除了在举行植物组织无菌培养普通工具外，还需要一套解剖刀。剥离茎尖时，应尽快接种，茎尖暴露的时刻应当越短越好，以防茎尖变干。可在一具衬有无菌湿滤纸的培养皿内举行操作，有助于防止茎尖变干。和其他器官的培养一样，在举行茎尖培养时，首要是获得表面别带病原菌的外植体。所以，普通来讲，茎尖分生组织由于有彼此重叠的叶原基的严密爱护，只要认真解剖，无须表面消毒就能够得到无菌的外植体。有时消毒处理还会增加培养物的污染率，因此选取茎尖前，可把供试植株种在无菌的盆土中，放在温室中举行栽培。浇水时要直截了当浇在土壤中而别要浇在叶片上。另外，最好还要给植株定期喷施内吸杀菌剂，可用多菌灵0.1％和抗生素(如0.1％链霉素)。关于某些田间种植的材料，能够切取插条插入Knop溶液中令其长大，由这些插条的腋芽长成的枝条，要比由田间植株上直截了当取来的枝条污染小得多。

为了保险起见，在切取外植体之前普通仍须对茎芽举行表面消毒。叶片包被严紧的芽，如菊花、兰花，只须在75％酒精中浸蘸一下，而叶片包被松散的芽，如香石竹，蒜和马铃薯等，则要用0.1％次氯酸钠表面消毒l0min。关于这些消毒办法，在工作中应灵便运用，如在大蒜茎尖培养时，可将小鳞茎在75％酒精中浸蘸一下，再用灯火烧掉酒精，然后解剖出无菌茎芽。在剖取茎尖时，把茎芽置于解剖镜下，一只手用细镊子将其按住，另一只手用解剖针将叶片和叶原基剥掉，解剖针要常常蘸入90％酒精，并用火焰灼烧以举行消毒。但要注意解剖针的冷却，可蘸人无菌水举行冷却。当一具闪亮半圆球的顶端分生组织充分暴露出来之后，用解剖刀片将分生组织切下来，为了提高成活率，可带1～2枚幼叶，然后将其接到培养基上。接种时确保微茎尖别与其他物体接触，只用解剖针接种即可。将接种好的茎尖置于22℃左右的温度下。每天以16h2000～3000Lx的光照条件下培养。由于在低温柔短日照下，茎尖有也许进入休眠；因此较高的温度和充脚的日照时刻必须保证。微茎尖需数月培养才干成功。茎尖培养的继代培养和生根培养和普通器官的培养相同，这个地方别再叙述。

二、其他组织培养脱毒办法

（一）愈伤组织培养脱毒

经过植物的器官和组织的培养去分化诱导产生愈伤组织，然后从愈伤组织再分化产生芽，长成小植株，能够得到无病毒苗。感染烟草花叶病毒的愈伤组织经机械分离后，仅有40％的单个细胞含有病毒，即愈伤组织无病毒植株。愈伤组织的某些细胞之因此别带病毒，其理由是：①病毒的复制速度赶别上细胞的增殖速度；②有点细胞经过突变获得了抗病毒的抗性。对病毒侵袭具有抗性的细胞也许与敏感的细胞共同存在于母体组织之中。然而，愈伤组织脱毒的缺陷是植株遗传性别稳定，也许会产生变异植株，同时一些作物的愈伤组织尚别能产生再生植株。

(二)珠心胚培养脱毒

（三）茎尖嫁接脱毒

木本植物茎尖培养难以生根成植株，将实生苗砧木在人工培养基上种植哺育，再从成年无病树枝上切取0．4～1．0mm茎尖，在砧木上举行试管微体嫁接，以获得无病毒幼苗。这在桃、柑橘、苹果等果树上已获得成功，同时有的已在生产上应用。

(四)花药培养脱毒

三、理化办法脱毒

（一）物理办法

1.高温处理

又叫热处理或温热疗法。其基本原理是一些病毒对热别稳定，在高于常温的温度下即钝化失活。

2.低温处理

低温处理又称冷疗法。适当增加低温处理时刻可提高脱毒效果

（二）化学处理

1.病毒抗血清预处理

用齿舌兰环斑病毒（ORV）的血清处理兰属离体分生组织，提高了再生株中无ORV的植株频率，

2.RNA合成抑制剂处理

烟草愈伤组织培养基中加入2-硫脲嘧啶，可除去组织中马铃薯Y病毒

3.三氮唑核苷处理

三氮唑核苷又叫病毒唑，是防治动物RNA病毒和DNA病毒病的广谱性抗病毒制剂。

第三节脱毒苗鉴定

上述途径哺育得到的植株，必须通过严格的鉴定，证明真的无病毒存在，才是其正的无病毒苗，才能够提供给生产应用。鉴定的办法有多种。

一、直截了当检测法

直截了当观看待测植株生长状态是否异常，茎叶上有无特定病毒引起的可见症状，从而可推断病毒是否存在。

二、指示植物(indicatingPlant)法

利用病毒在其他植物上产生的枯斑作为鉴不病毒种类的办法，算是枯斑和空斑的测定法。这种特意选用以产生局部病斑的寄主即为指示植物，又称鉴不寄主。它只能鉴定靠汁液传染的病毒。指示植物法最早是美国的病毒学家Holmes1929年发觉的。他用感染TMV的一般烟叶的粗汁液和少许金刚砂相混合，然后在烟叶子上摩擦2～3d后叶片上浮现了局部坏死斑。在一定范围内，枯斑与侵染性病毒的浓度成正比。这种办法条件简单，操作方便，故向来沿用至今，仍为一种经济而有效的鉴定办法。枯斑法别能测出病毒总的核蛋白浓度，而只能测出病毒的相对感染力。由于病毒的寄生范围别同，因此应依照别同的病毒挑选适合的指示植物。此外还要求所挑选的指示植物别但一年四季都容易栽培，同时在较长的阶段内还能保持对病毒的敏感性和容易接种，而且在较广的范围内具有同样的反应。指示植物普通有两种类型：一种是接种后产生系统性症状，其病毒可扩展到植物非接种部位，通常没有局部病斑；另一种是只产生局部病斑，常由坏死、褪绿或环状病斑构成。

在接种时从被鉴定植物上取1～3g幼叶，在研钵中加10ml水及少量磷酸缓冲液(pH值7．0)，研碎后用两层纱布滤去渣滓，再在汁液中加入少量的500～600目金钢砂作为指示植物叶片的摩擦剂，使叶面造成小的伤口，而别破坏表面细胞。往后用棉球蘸取汁液在叶面上轻轻涂抹2～3次举行接种，后用清水冲洗叶面。接种时可用手指涂抹、用纱布或用喷枪等来接种。为确保接种质量接种工作应在防蚜虫温室中举行，保温15～25℃。接种后2～6d可见到上述症状浮现。木本多年生果树植物及草莓等无性生殖的草本植物，由于采纳汁液接种法比较困难，因此通常采纳嫁接接种的办法。以指示植物作砧木，被鉴定植物作接穗，常用劈接法。

三、抗血清(antiserum)鉴定法

物病毒是由蛋白质和核酸组成的核蛋白，因而是一种较好的抗原，给动物注射后会产生抗体，抗体存在于血清之中称抗血清。别同病毒产生的抗血清有各自的特异性。用已知抗血清能够鉴定未知病毒的种类。这种抗血清算是高度专一性的试剂，这种办法特异性高，测定速度快，普通几小时甚至几分钟就能够完成。因此抗血清法成为植物病毒鉴定中最实用的办法之一。抗血清鉴定法要举行抗原的制备(包括病毒的生殖，病叶研磨和粗汁液澄清等)，抗血清的采收，分离等。血清可分装到小玻璃瓶中，贮存在-15～25℃的冰冻条件下。测定时，把稀释的抗血清与未知的病毒植物在小试管内混合，这一反应导致形成可见的沉淀。然后依照沉淀反应来鉴定病毒。

四、分子生物学鉴定法

1.双链RNA法

在受RNA病毒侵染的植物体内,有相应复制形式的双链RNA存在,而在健康植株中未发觉病毒的dsRNA

2.互补DNA检测法

用互补DNA检测病毒的办法又称DNA分子杂交法

五、电镜检测法

由于人的双眼难以观看小于0.1mm的微粒，而借助于一般光学显微镜也只能看到小至200um的微粒，因此惟独经过电子显微镜才干分辨0.5um大小的病毒颗粒。如此采纳电子显微镜既能够直截了当观看病毒，检查出有无病毒存在，了解病毒颗粒的大小、形状和结构，又能够鉴定病毒的种类。这是一种较为先进的办法，但需一定的设备和技术。

由于电子的穿透力非常低，制品必须薄到10～100um，通常制成厚20um左右的薄片，置于铜载网上，才干在电子显微镜下观看到。近代进展使电镜结合血清学检测病毒，称为免疫吸附电镜(ISEM)。新研制的电镜铜网用碳支持膜使飘荡膜到位，用少量的稀释抗血清孵育30min，就能够把血清蛋白吸附在膜上，铜网飘荡在缓冲溶液中除去过量蛋白质，用滤纸吸干，加入一滴病毒悬浮液或感染组织的提取液，1～2h后，往常吸附在铜网上的抗体陷入同源的病毒颗粒，在电镜下即可见到病毒的粒子。这一办法的优点是灵敏度高和能在植物粗提取液中定量测定病毒。

无病毒苗的保存和生殖

一、无病毒苗的保存

无病毒植株并别是有额外的抗病性，它们有也许非常快又被重新感染。因此一旦哺育得到无病毒苗，就应非常好地隔离与保存。这些原原种或原种材料保管得好能够保存利用5~10年。通常无病毒苗应种植在隔虫网内，使用300目(网眼为0.4～0.5mm大小)的网纱，才能够防止蚜虫的进入。栽培用的土壤也应举行消毒，身边环境也要整洁，并及时喷施农药防治虫害，以保证植物材料在与病毒严密隔离的条件下栽培。有条件的地点能够到海岛或高岭山地种植保存，那儿气候凉快，虫害少，有利于无病毒材料的生长与生殖。另一种更廉价的办法，是把由茎尖得到的并差不多过脱毒检验的植物经过离体培养举行生殖和保存。

（一）隔离保存

植物病毒的传播媒介要紧是昆虫如蚜虫、叶蝉或土壤线虫，所以应将无病毒原种苗种植于防虫网室、盆栽钵中保存

（二）长期保存

将无病毒苗原种的器官或幼小植株接种到培养基上，在低温下离体保存，是长期保存植物无病毒原种及其他优良种质的办法。

1.低温保存

茎尖或小植株接种到培养基上，置低温、低光照下保存。

2.冷冻保存

用液氮保存植物材料的办法称为冷冻保存

二、无病毒苗的生殖

（一）无病毒苗的生殖办法

1.嫁接生殖

从经过鉴定的无病毒母本植株上采集穗条，嫁接到实生砧上

2.扦插生殖

硬枝扦插应于冬季从无病毒母本上剪取芽体饱满的成熟休眠枝，经沙藏后，于次年春季剪切扦插

3.压条生殖

将无病毒母株上1-2年生枝条水平压条，土壤踩实压紧，保持湿润，压条上的芽眼萌动长出新梢，别断培土，至新梢基部生根

4.匍匐茎生殖

一些植物的茎匍匐生长。匍匐茎上芽易萌动生根长成小苗，如草莓、甘薯

5.微型块茎（根）生殖

从无病毒的单茎苗上剪下带叶的叶柄，扦插到育苗箱砂土中，保持湿度，1-2月后叶柄下长出微型薯块，即可用作中薯

（二）无病毒苗繁育生产体系

无病毒苗在生产中的利用也要防止病毒的再感染。生产场所应隔离病毒感染途径，做好土壤消毒或防蚜等工作。在此种植区及种植规模小的地点，要较长时刻才会感染。而在种植时刻长、轮作及种植规模大的产地则在短期内就能够感染。一旦感染，便会妨碍产量和质量的保证。所以，应重新采纳无病毒苗，以保证生产的质量。

无病毒苗能够表现出明显的优良效果。如草莓可增产20％～50％，植株结果多，单果重增加，上等果比例提高。菊花切花品种的脱毒株，表现出株高增加，切花数增多，花朵大，切花较重等特点。

第四节几种植物的脱毒苗哺育技术

一、无病毒苗的保存生殖

无病毒植株并别是有额外的抗病性，它们有也许非常快又被重新感染。因此一旦哺育得到无病毒苗，就应非常好地隔离与保存。这些原原种或原种材料保管得好能够保存利用5-10年。

二、无病毒苗的利用

无病毒苗在生产中的利用也要防止病毒的再感染。生产场所应隔离病毒感染途径，做好土壤消毒或防蚜等工作。在此种植区及种植规模小的地点，要较长时刻才会感染。而在种植时刻长、轮作及种植规模大的产地则在短期内就能够感染。一旦感染，便会妨碍产量和质量的保证。所以，应重新采纳无病毒苗，以保证生产的质量。

三、无病毒苗的效果

无病毒苗能够表现出明显的优良效果。如草莓可增产20％~50％，植株结果多，单果重增加，上等果比例提高。菊花切花品种的脱毒株，表现出株高增加，切花数增多，花朵大，切花较重等特点。

第四节几种要紧植物的脱毒生产技术

1、马铃薯：

马铃薯在种植的过程中易感染病毒，危害马铃薯的病毒有17种之多。由于马铃薯是无性生殖作物，病毒在母体内增值、转运和积存与所结的薯块中，同时世代传递，逐年加重。

利用茎尖脱毒技术生产无病毒种薯，是本世纪50年代中期往后马铃薯种薯生产上的一大贡献。我国从70年代就引进了马铃薯茎尖脱毒技术，在全国马铃薯生产上发挥了积极的作用。

微型薯生产技术

无毒试管苗的保存时刻较短，且要求较严格的保存条件；在种质材料的交换中容易导致污染而使材料丢失。80年代初浮现的微型薯生产办法，为马铃薯种质保存、交换以及无毒种薯的生产和运输提供了一条便利的途径

甘薯

旋花科(Convolvulaceae)甘薯属一年生或多年生蔓生草本。又名番薯、山芋、红薯、白薯、地瓜等。甘薯是我国4大粮食作物之一，也是饲料和轻工业的原料。

甘薯是一种采纳无性生殖的XXX优势的作物，但营养生殖导致甘薯病毒病蔓延，致使产量和质量落低。在引起甘薯品种退化的诸因素中病毒占主导。病毒病已成为我国甘薯生产的最大障碍之一，每年造成