TCALAS 95-2020 实验动物 肝螺杆菌环介导等温扩增（LAMP）检测方法

ICS65.020.30B44中国实验动物学会团体标准T/CALAS95—2020实验动物 肝螺杆菌环介导等温扩增（LAMP）检测方法Laboratoryanimal-DetectionofHelicobacterhepaticusbyloop-mediatedisothermalamplification2020-12-01 发布 2021-01-01 实施中国实验动物学会 发布前 言本文件按照GB/T1.1—2020给出的规则起草。本文件附录A为资料性附录。本文件由中国实验动物学会归口。本文件由全国实验动物标准化技术委员会（SAC/TC281）技术审查。本文件由中国实验动物学会实验动物标准化专业委员会提出并组织起草。本文件起草单位：上海实验动物研究中心、扬州大学。本文件主要起草人：冯洁、张泉、谢建芸、高诚、朱立麒、钱淼。鏈鏈鏈鏈实验动物 肝螺杆菌环介导等温扩增（LAMP）检测方法范围本文件规定了实验动物肝螺杆菌LAMP检测方法。本文件适用于实验动物肝螺杆菌的检测。规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。凡是注明日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本标准。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB19489 《实验室生物安全通用要求》GB/T19495.2 《转基因产品检测 实验室技术要求》术语、定义和缩略语下列术语、定义和缩略语适用于本文件。3.1环介导等温扩增loop-mediatedisothermalamplification，LAMP62DNA聚合酶（BstDNApolymerase）60℃～65℃恒温15min～60min109～1010倍的核酸扩增，扩增产物由一系列复杂的大DNA混合而成。缩略语DNA 脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid）LAMP 环介导等温扩增（loop-mediatedisothermalamplification）PBS 磷酸盐缓冲液（phosphatebufferedsaline）flaB B（flagellinB）基因基本原理DNAflaB域设计一组LAMP引物，包括外引物F3和B3、内引物FIP和BIP以及环引物LB，对DNALAMP扩增结果判定样品中是否含有肝螺杆菌。设计的LAMP扩增引物包括外引物F3和B3、内引物FIP和BIP以及环引物LB，132132第三篇实验动物检测方法系列标准可特异性识别靶序列上的6个区域，利用BstDNA聚合酶（BstDNApolymerase）启动循环链置换反应，在flaB基因序列启动互补链合成，在同一链上互补序列周而复始形成有许多环的花椰菜结构的茎-环DNA混合物。在DNA合成时，从脱氧核糖核酸三磷酸底物（dNTP）中析出的焦磷酸离子与反应溶液中的镁离子反应，产生大量白色焦磷酸镁沉淀。焦磷酸镁沉淀与钙黄绿素结合，产生黄绿色荧光。因此，可以把浑浊度作为反应的指标，仅用肉眼观察反应液颜色变化，即可判定扩增与否，无需繁琐的电泳和紫外观察。设备和材料5.1 离心机：2000r/min～13000r/min。水浴锅或恒温孵育器：60℃～65℃。超净工作台。生物安全柜。电泳仪。振荡器。组织匀浆器。5.8 冰箱：2℃～5℃、–20℃。5.9 （0.1L～2L1L～10L10L～100L100L～1000及无菌吸头。无菌透明离心管：1.5mL、5mL、15mL。LAMP反应管（透明）。试剂*除特殊说明外，实验所用试剂均为分析纯或符合生化试剂标准，各溶液按照附录A所示方法进行配制。PBS。无水乙醇。钙黄绿素荧光染料。灭菌去离子水。DNADNA提取试剂盒[天根生化科技（北京）有限公司，货DP302]或其他等效试剂。LAMP试剂：LAMPDNA扩增试剂盒（SLP204）或其他等效试剂。1本文件给出试剂盒相关信息是为了方便本文件使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他产品具有相同的效果，那么可使用这些等效产品。实验动物肝螺杆菌环介导等温扩增（LAMP）检测方法实验动物肝螺杆菌环介导等温扩增（LAMP）检测方法133去离子水溶解，–20℃保存。表1肝螺杆菌LAMP检测引物序列引物种类引物名称引物序列（5′→3′）正向外引物F3GCAGCTTTAACATTAACTTGTGTA反向外引物B3AATGCGAATGTCGCTCAA正向内引物FIPGCCCAGCTTGATAAACTCCGTATAGTTGAAACAAGTTGAATCTGTG反向内引物BIPTCTGCCATATCCATAACTACCATTGATCTCCATTTTGATGGTATCG反向环引物LBCCTTTAAGGCTTGTAACCCCA检测方法采样及样本处理动物样本2.05mL离心管中，加入4mLPBS，经匀浆后充分振荡，3000r/min离心10min，吸取上清液转至干净离心管中编号备用。细菌培养物挑取固体培养基上的可疑菌落或液体培养物，用1mLPBS制备成菌悬液，置于无菌1.5mL离心管中编号备用。实验动物环境实验动物饲料、垫料、饮水BS1min～2min15mL无菌30min5mL无菌离心管中。取实验动物饮水直接转移5L无菌离心管中，备用。实验动物设施设备155min～105mL无菌离心管中。样本的存放3次。DNA提取1mL～5mL上述样本，10000r/min1min，尽量吸净上清。200μLGA，振荡至菌体彻底悬浮。20μLK溶液，混匀。134134第三篇实验动物检测方法系列标准220μL15℃10220μL15CB3中（吸附柱放入收集管中），12000r/min离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。CB3500μLGD，12000r/min30s，倒掉废液，将吸CB3放入收集管中。CB3600μLPW，12000r/min30s，倒掉废液，将吸CB3放入收集管中。72.C360L200/in30，CB3放入收集管中。CB3放回收集管中，12000r/min2minCB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。CB350200μL2min～5000r/min2DNA应尽快进行下一步反应。若暂不能进行，应冻存于–20℃备用。LAMP反应反应体系LAMP2。表2肝螺杆菌LAMP检测反应体系配制表成分 用量/μL2×反应缓冲液12.5F3（5μmol/L）1B3（5μmol/L）1FIP（40μmol/L）1BIP（40μmol/L）1LB（20μmol/L）1BstDNA聚合酶*1钙黄绿素1DNA模板1～5灭菌去离子水补足至25*表中给出聚合酶相关信息是为了方便本文件使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他产品具有相同的效果，那么可使用这些等效产品。反应程序将反应管中的反应体系混匀，置于63℃恒温反应45min。实验动物肝螺杆菌环介导等温扩增（LAMP）检测方法实验动物肝螺杆菌环介导等温扩增（LAMP）检测方法135实验对照DNADNA的样本作为阴性对照模板，以灭菌去离子水作为空白对照模板。结果观察LAMP2.0%色变化。结果判定和报告质控标准阴性对照和空白对照反应管液体显示为橙色，阳性对照反应管液体显示为黄绿色。否则此次试验无效，需重新进行LAMP扩增。结果判定琼脂糖凝胶电泳检测2L2.0%LAMP特征性的梯形带则判为阳性，未出现扩增条带则判为阴性。目测法LAMP扩增结束后，肉眼观察样品反应管液体颜色，显示为黄绿色判为阳性，橙色则判为阴性。生物安全GB19489相关资质的工作人员进行相应操作；检测过程中防止交叉污染的过程控制按照GB/T19495.2要求执行。结果报告根据判定结果，作出报告。136136第三篇实验动物检测方法系列标准附 录 A（资料性附录）溶液的配制磷酸盐缓冲液（PBS）A液0.2mol/L磷酸二氢钠溶液：称取磷酸二氢钠（NaH2PO4·H2O）27.6g，适量去离子水溶解，定容至1000mL，混匀。B液0.2ol/L（24·725.6g或24·122O71.6g，或Na2HPO4·2H2O35.6g），加适量去离子水溶解，定容至1000mL，混匀。0.02mol/L磷酸盐缓冲液（PBS）（pH7.2）的配制A14mLB36（NaCl）8.5800mL去离子水溶解稀释，HClpH7.21000mL12115min，冷却备用。50×TAE电泳缓冲液0.5mol/L乙二胺四乙酸二钠（EDTA）溶液（pH8.0）乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2·H2O） 18.61g灭菌去离子水 80mL5mol/L氢氧化钠溶液 调pH至8.0灭菌去离子水加至100mL，121℃、15min灭菌备用。50×TAE电泳缓冲液三羟甲基氨基甲烷（Tris） 242g乙酸 57.1mL0.5mol/LEDTA溶液（pH8.0） 100mL灭菌去离子水加至100mL，121℃、15min灭菌备用。溴化乙锭（EB）溶液（10mg/mL）溴化乙锭 10mg灭菌去离子水 1mL0.5g/mL2.0%琼脂糖凝胶琼脂糖 2g1×TAE电泳缓冲液 加至100mL10mg/mLEB5L，轻轻混匀，避免产50℃～553mm～5mm，需确认梳齿下或梳齿间没有气泡，待凝固后取出梳子备用。实验动物肝螺杆菌环介导等温扩增（LAMP）检测方法实验动物肝螺杆菌环介导等温扩增（LAMP）检测方法137参考文献FoxJG,DewhirstFE,TullJG,etal.1994.Helicobacterhepaticussp.nov.amicroaerophilicbacteriumisolatedfromliversandintestinalmucosalscrapingsfrommice[J].JClinMicrobiol,32(5):1238-1245.MählerConvenorM,BerardM,FeinsteinR,etal.2014.FELASArecommendationsforthehealthmonitoringofmouse,rat,hamster,guineapigandrabbitcoloniesinbreedingandexperimentalunits[J].LabAnimal,48(3):178-192.NotomiT,OkayamaH,TmitaN,etal.2000.Loop-mediatedisothermalamplificationofDNA[J].NucleicAcidsRes,28(12):e63.SuerbaumS,JosenhansC,SterzenbachT.2003.Thecompletegenomesequenceo