利用转基因植物修复汞污染环境的新技术

利用转基因植物修复汞污染环境的新技术摘要：随着工业业的发展，大大量的重金属属污染物不断断地排放到环环境中，造成成了日益严重重的重金属污污染，其中汞汞污染已成为为人类面临的的最严重的环环境问题之一一。作为植物物修复技术的的尝试，我们们将细菌中的的merA、merB、merT、merPHHx基因经过过序列改造，构构建在植物基基因表达载体体上，转入高高等植物烟草草中，目的是是促进土壤、水水体和大气中中汞污染物的的控制。所获获得的转基因因植物分别吸吸收有机态、离离子态和气态态的汞，并且且在植物体内内转化其存在在形态。通过过多基因的联联合作用，可可以将高毒的的有机汞转化化为低毒的无无机汞，也可可以将不同形形态的汞以离离子态的形式式积累在植物物中。在营养养液中附加不不同浓度氯化化甲基汞（mmethyllmercuurychhloridde,CH33HgCl）培培养大米草，测测定汞胁迫对对植物生长发发育、质膜透透性、MDAA含量和SOD酶活性性的影响。测测试结果表明明，大米草能能够将有机汞汞转化为无机机汞，并且在在体内超积累累汞。植物对对汞污染物的的吸收、转化化和积累作用用为汞污染环环境的修复提提供了一条新新的有效途径径。关键词：植物修修复，重金属属目前，世界许多多地区的大气气、土壤以及及水体中重金金属含量已达达到致毒水平平（Nriaggu19888,Nriiagu和Pacynna19888）。重金属属污染已日益益成为威胁人人类健康和影影响人类生活活质量的严重重环境问题。自自工业革命兴兴起以来,人类向环境境中排放出大大量污染物,目前全球每每年的重金属属排放量以指指数级速率增增长。以汞为为例，据世界界卫生组织（WHO）统计，全全球每年有10,0000吨汞排放到到环境中（Jeannna，2000）。造成环境污染的的重金属主要要包括镉（Cd）、铬（Cr）、铜（Cu）、铅（Pb）、汞（Hg）、镍（Ni）及锌（Zn）等(USEPPA19997)，其中汞污污染已成为人人类面临的最最严重的环境境问题之一。几几个世纪以来来，由于在化化工、造纸、国国防、冶金、石石油燃料、医医药等领域的的广泛应用，大大量的单质汞汞（Hg0）及汞离子子（Hg2+）以工业“三废”（废气、废废液、废渣）的的形式排放到到环境中。这这些毒性相对对较小的汞物物质在土壤、淤淤泥中沉积后后，被其中的的厌氧性还原原硫细菌转化化为剧毒的甲甲基汞化合物物并在食物链链中富集。甲甲基汞（CH3Hg+）极易被食食物链传递并并具有很强的的生物放大效效应，例如，经经水生生物食食物链富集后后，顶级消费费群中浓度增增长可高达百百万倍(Elizzabethh和Marinnus20000)，但直到19世纪50~60年代日本Miinamatta海湾地区区由于甲基汞汞污染而引起起水俣病的流流行才引起了了人类对其毒毒性的认识。汞汞中毒常表现现为运动性共共济失调、感感觉异常、感感观紊乱、心心血管萎缩等等病症并对患患者的脑、肾肾脏及发育的的胎儿造成严严重的损伤(Raskkin和Ensleey20000)。由于汞中中毒所引起的的损伤是无法法治愈的，故故而汞污染的的治理已刻不不容缓。另一方面，我国国作为矿业大大国，矿业“三废”（废气、废废水和废渣）很很多，生态环环境的损坏非非常严重。以以贵州万山汞汞矿为例，自自1950年建建成投产至11995年45年间，共共排放含汞烟烟尘废气2002亿m3，含汞废水水5192万t，炼汞炉渣渣947万t，采矿废石石263万t。其“三废”之一废气排排放含汞浓度度109～304mmg/m3，废水含汞汞0.09～11.866mg/LL，废渣含汞汞0.5～1.35mg/kgg，平均分别别超标54449倍、236倍和214..5倍，通过“三废”形式排放到到自然环境中中的金属汞含含量至少达2250t。境境内炼汞炉渣渣和坑道废石石堆积如山，且且点多面广，又又基本没有任任何维护措施施，自然堆弃弃于境内河流流源头的沟谷谷间，在12.5kmm2的矿区范围围内，堆积体体积达20万m3以上的渣堆堆就有8处，且均在在海拔8000m左右处处。每遇大雨雨或暴雨，近近500mm的落差使得得大量的含汞汞废水、炉渣渣、废石进入入河道，污染染水源和土壤壤。中国大型型矿山联合企企业—贵州汞矿，经经过600余年的开采采后，因资源源枯竭，企业业资不抵债，于2002年破产。我国贵州万山汞矿和陕西旬阳汞锑矿周围的老百姓深受其害，汞毒害的病例逐年增加。群众苦不堪言，怨声载道。贵州万山汞矿是我国众多矿山的缩影，大批矿山废弃地造成的环境污染问题严重地影响人民群众的身体健康，阻碍我国经济和社会的可持续发展，已到了非治理不可的地步了。汞是土壤、水和和空气重金属属污染的主要要元素之一[[1]，它以以液态、蒸汽汽、离子、有有机（如甲基基汞）和颗粒粒态多种形态态存在。在环环境中，汞循循环的途径包包括物理化学学过程和生物物学过程。生生物学过程在在汞化合物的的形态转化中中起决定性作作用。有些细细菌将甲基汞汞转化为离子子汞,有些细菌将将离子汞转化化为单质汞并并使之挥发，还还有一些细菌菌将离子汞转转化为HgSS等沉淀物,另外一些细细菌将金属汞汞转化为离子子汞。汞还能能同粘土矿物物、腐殖质、金金属水合氧化化物等结合为为颗粒态汞。从本质上说，汞汞形态的生物物学转化由生生物体内的酶酶和蛋白质来来完成的。长长期以来，人人们试图通过过研究污染物物的迁移环节节（来源、扩散散、分布、循循环等）和转化环节（形态、反应、归归宿等）发现细菌转转化汞污染物物形态的机制制。但是，多多种生物因子子和环境因子子的相互作用用和纵横交错错妨碍了人们们对污染形态态转化机制的的深入了解，而而传统的化学学及物理化学学方法无法解解释由生物体体代谢所主导导的生态化学学过程。人们们急需了解控控制汞代谢的的内在动力和和反应机制，包包括酶促反应应和影响酶促促反应的调控控机制。基因因表达调控网网络是生物体体控制汞和其其它污染物代代谢的开关和和调节器。近近年来，随着着分子生物学学技术的发展展，人们已经经从众多细菌菌中陆续分离离出与汞化合合物形态转化化有关的基因因，如汞还原原酶基因meerA，甲基基汞裂解酶基基因merBB，汞转运蛋蛋白基因meerT，金属属硫蛋白基因因MT。这些基基因的发现和和克隆为我们们清晰、准确确地了解汞代代谢的生物化化学机制创造造了基本条件件，同时也为为汞污染物形形态的生物学学控制提供了了科学基础。merA基因编编码汞还原酶酶（HR），催化离子子汞还原为金金属汞的生物物化学过程。merA基因的表达与否和表达强度直接关系到汞还原酶的有无和多少,而生物体内和介质中汞离子（底物）的状态和含量以及其它环境背景因子都会影响merA基因的表达。这种影响常常以激活或抑制基因表达的方式进行。因此，merA基因表达的调控是汞还原酶酶促反应强度的决定性因素。与merA基因不一样，merT基因所编码的蛋白负责汞离子在细胞内的转运，直接影响生物体内汞离子的积累或富集。merB基因编码有机汞裂解酶的合成，催化甲基汞裂解为离子汞的降解反应。生物体内甲基汞转化为离子汞的过程实际上是甲基汞的修复过程。MerPHx基因是一种汞的氧化酶基因，能够将空气中的单质汞氧化为离子态的汞。虽然merA、merB、merT、merPHx基因的生物学功能已经清楚，但是这些基因在植物体内表达的调控机理及其酶促反应机理还有待研究。植物是土壤中生生物链的重要要一环，利用用植物潜在的的修复作用治治理已经污染染的土壤是污污染环境修复复的重要方向向。正因为如如此，人们正正在设法发掘掘重金属超富富集的植物。遗遗憾的是，目目前还没有汞汞超富集植物物的报导。因因此说，利用用植物本身的的修复功能对对汞污染物进进行修复还缺缺乏必要的物物质基础。近近年来，有人人尝试将merA或merB基因因导入植物，采采用基因工程程方法创造转转基因植物，目目的是转化汞汞的存在形态态，修复有机机汞或无机汞汞污染的土壤壤和水体。MMeagheer博士领导导的研究小组组首先在模式式植物拟南芥芥上转移meerA和merB基因因，获得抗汞汞和挥发汞的的转基因植物物[4,5]]。此后，申申请者采用人人工改造的mmerA基因因和merB基因因分别转化烟烟草，获得了了高抗汞污染染物和离子汞汞挥发的转基基因烟草[66]。这些转基因因植物对汞污污染物有非常常强的吸收能能力，但是，merA基因和merB基因是如何调节植物对汞污染物的吸收目前还是一个迷。目前，merA基因和merB基因的转基因植物在美国已经进入实用阶段,这是迄今为止重金属植物修复方面最为成功的例子。植物对汞和其它它重金属的吸吸收主要受土土壤和本身特特性的影响。根根际是重金属属由土壤进入入植物体的主主要界面，根根际环境中pH和铁锰氧化化物、根分泌泌物、丛枝菌菌根真菌等有有关物质的特特性对植物根根系吸收重金金属有重要影影响。揭示重重金属在转基基因植物根际际这一特殊环环境中的行为为及进入植物物体过程的控控制机制，并并且利用植物物本身的特性性，定向转化化汞污染物的的形态，筛选选超富集的转转基因株系，以以研究超积累累植物修复汞汞污染的环境境是本项研究究的主要方向向。转merB基因因的烟草植株株吸收毒性很很大的有机汞汞，并且将有有机汞转化为为离子汞；转转merA基因因的烟草植株株大量吸收离离子态的汞化化合物并转化化成金属汞以以汞蒸汽的形形态挥发。这这就带来一个个有争议的问问题，在用mmerA转基基因植物吸收收和降解土壤壤汞离子时，同同时有金属汞汞的蒸汽挥发发到大气中。尽尽管金属汞的的毒性远远低低于离子汞和和有机汞，由由转基因植物物释放到大气气中的蒸汽汞汞大大稀释，但但是此举仍然然会影响大气气中汞的含量量。为了高效效控制环境中中的汞污染物物但同时防止止汞形态转化化过程中对大大气环境所造造成的负面效效应，我们设设计了一套汞汞污染物的控控制方案：利利用merAA、merB转基基因植物高效效吸收土壤中中有机汞和离离子汞，并且且将有机态的的汞转化为离离子汞，利用用merPHHx转基因植植物使汽态的的金属汞氧化化为离子态汞汞，通过meerT基因使使汞污染物在在植物组织内内富集，成为为汞的超富集集植物。这样样，通过超富富集植物的大大规模种植可可以回收土壤壤、水体和大大气中的汞污污染物，达到到缓解和控制制环境中的汞汞污染。应当看到，人们们对汞污染物物生物修复的的研究和应用用还处在初始始阶段，在确确定汞污染修修复途径和开开发相关基因因生物修复功功能时，我们们还需要回答答许多重要问问题：汞污染染物在植物和和土壤界面的的存在形态，merA、merB、merT和MT基因表达的调控机制，基因表达产物-酶或蛋白质之间的相互作用，汞形态转化的酶促反应机理及其生物化学反应，转基因植物控制汞污染的效率，提高汞超富集水平的有效组合。研究和回答上述问题将使我们明确植物控制汞污染物转化的生态化学过程，了解复合污染条件下植物降解汞污染物的机理以及修复新原理，为重金属污染物的植物修复和联合修复提供科学依据。材料和方法ⅰ)植物材料..试验用烟草草（Nicootianaatabaacum）品品种为革新一一号.采用常规方方法消毒烟草草种子，在MS培养基上上播种.在组织培养养条件下获得得无菌苗，取取25-300d苗龄的叶片片作为遗传转转化的受体材材料.(ⅱ)菌种、质质粒、工具酶酶.菌种包括大大肠杆菌DHH5α,农杆菌LBAA4404为为本实验室保保存；质粒RR8310为为吕玉平博士士赠送，实验验所用的克隆隆载体为T--easy((Promeega公司产产品)、pBlueescripptKS(++)；植物基基因表达载体体为pJR11.限制性内切切酶、修饰酶酶购自华美生生物工程公司司.(ⅲ)引物设设计、PCRR扩增和载体体构建.利用引物设设计改造meerB基因、merrA、merT和merPHHx基因的部部分序列.在不改变其其氨基酸序列列的条件下增增加A+T的含量.PCR产物物克隆在T--easy载载体中，随后后亚克隆在ppBluesscripttKS(++)质粒中.将基因片段段插入pJRR1载体中，构构建成表达载载体.采用冻融法法转入根癌农农杆菌LBAA4404..(ⅳ)遗传转转化.烟草的转化化参照叶盘法法进行[7]].将过夜培养养的农杆菌离离心，菌体用用MS液体培养养基10倍悬浮.将烟草叶片片切成0.5×0.5cm的小块，放放入菌液中浸浸泡10minn，吸干多余余的菌液后平平放在MS++6-BA3mg/L的培培养基预培养养２d.然后转接到到分化和筛选选培养基（MMS+6-BBA3mgg/L＋Km500mg/LL＋羧苄青霉霉素Cb5000mg/L）上上，在25℃下共培养.等芽长到2cm高时，切切下芽并转入入生根培养基基（1/2MSS+NAAA1mg/L+Cb3000mg/LL）上进行生生根.待根长出后后移栽到盆钵钵内，温室内内培养至开花花.每个转基因因植株标记为为一个转基因因株系，按每每个果实分别别收获种子并并编号.(ⅴ)转基因因种子的卡那那霉素抗性筛筛选.从转化植株株上收获的种种子经表面消消毒后播种在在含有45mg/L卡那霉素(Km)的1/2MS固体培养基基上筛选，21天后挑出绿绿苗移栽于蛭蛭石和珍珠岩岩的人工土中中，使其在人人工气候室中中生长.(ⅵ)汞抗性的的测定.以醋酸苯汞汞（PMA）代表表有机汞.在MS培养基基中加入PMMA，配制成成不同PMAA、HgCl2浓度处理的的培养基，将将转基因的种种子经表面消消毒后播种在在含汞的MS固体培养基基上，在培养养室内培养.能够发芽且且长出绿色真真叶的种子认认定为抗性种种子，不能萌萌发或发芽后后心叶变白的的种子视为不不抗的种子.为了确认转基因因植株在苗期期对汞的抗性性，在种有烟烟草转基因苗苗的土壤中加加入PMA，根据据幼苗的生长长状况判断其其抗性.(ⅶ)Souuthernn和Northhern杂交.CTAB法[8]提取烟烟草转化植株株总DNA，用EcoRI消化3小时后，在0.7%琼脂糖凝胶胶上电泳.将DNA转移到尼龙龙膜（Amerssham）上.用XbaⅠ／SalⅠ双酶切pJRR1::meerBhe载载体，得到，以以32p-dCCTP为标记记物合成探针针，在42℃预杂交4小时，预杂杂交缓冲液含含有25%甲酰胺、1000μg/ml变性的鲑精精DNA、10μg/ml酵母RNA、5×Denhaardt’s试剂、50mmol//L磷酸钠钠(pH66.5)、5×SSC和0.2%SDS.向预杂交缓缓冲液中加入入经过变性的的探针，在同同样的温度下下温育24h.在室温下用用漂洗缓冲液液（0.055mol/LLNaH22PO4,0.005moll/LNaa2HPO4,5×SSC和25%甲酰胺）漂漂洗杂交膜，然然后在42℃下用2×SSC/00.02%SDS继续续漂洗.滤膜烘干干后加增感屏屏对X光片曝光.从转基因烟烟草和野生型型烟草的叶片片中分别提取取总RNA，以32p-dCCTP为标记记的merBBhe基因片片段为探针进进行Nortthern杂杂交[8]，杂交交温度为58℃.结果与分析1．转基因烟草草对无机汞的的转化作用在农杆菌的介导导下，采用叶叶盘法转化，不不定芽诱导培培养基为MSS+6-BAA3mgg/L＋Km500mg/LL＋Cb5000mg/LL,生根培培养基为1//2MS++NAA1mg/LL+Cb3000mg//L.在卡那霉素素筛选培养基基上，转接14天后烟草叶叶片开始膨胀胀，增厚，叶叶缘开始产生生皱褶，并有有白色的愈伤伤组织生成.22天后可见芽芽的分化.此后，一部部分再生芽变变白而淘汰.培养绿色再再生芽至2cm左右后，进进行生根培养养，1个月左右根根系生长健壮壮，移栽到温温室的盆钵中中.本次实验得得到120株再生苗，移移栽成活86株.每个转基因因植株单独收收种、编号.分别将人工改造造的MerAA（MerAppe9）基因因导入烟草（Nicotianatabacum）。Southern杂交和Northern杂交的结果显示，两个基因已分别整合入烟草染色体中，并且得到了表达。MerApe9转基因植物的种子在50μMHgCl2的培养基上能够发芽，移栽后能正常的生长，其中10-20%的转基因株系抗HgCl2，其种子在350μMHgCl2的培养基上也发芽。与此不同，未转基因的对照种子在50μMHgCl2的培养基上没有发芽。利用汞汽测定仪仪测定植株对对汞离子的转转化作用，发发现转基因植植株汽化汞的的速率高出对对照植株5--8倍，根组组织的汞汽化化速率远高于于叶和茎。这这一结果显示示，转基因植植物的根系是是汞汽化的主主要部位，汞汞气不一定要要通过维管束束组织在叶面面上蒸发。根根系不仅是汞汞吸收的场所所，同时也是是汞汽化的场场所。２．转基因烟草草对有机汞的的转化作用以质粒R83110为模板，采采用上述正反反义引物扩增增，结果获得得长度约为600bpp的PCR产物.将该PCR产物克克隆在T-eeasy载体体上，经测序序得到与预测测序列相同的的merBhhe基因,其中编码区区为576bpp.由于两个引引物序列中GG+C的含量量明显降低，所所获得的meerBhe基基因的编码区区更加符合真真核生物的序序列特征.用XbaⅠ//SalI酶切pBluuescriipt载体，得得到merBBhe基因的的编码序列，以以同样的酶切切位点插入到到pJR1双元元载体中，构构建成pJRR1::meerBhe植植物基因表达达载体.用冻融法将将该载体转化化到农杆菌LLBA44004中.分别从转基因植植株的叶片中中提取总DNNA，以merBBhe基因的的DNA片段为为探针进行杂杂交，结果在在4个DNA样品中中有三个转基基因植株的DDNA样品显显示杂交信号号.其中MerBBhe-133和MerBhhe-14两两个转基因植植株中merrBhe基因因为单拷贝插插入.从上述两个个转基因株系系和野生型烟烟草的叶片中中分别提取总总RNA，以32p-dCCTP标记的的merBhhe基因片断断为探针进行行Northhern杂交交，结果在MMerBhee-13和MerBhhe-14两两个转基因株株系中均出现现了杂交带.说明merBBhe基因在在该株系上得得到了表达.由于植物表达载载体含有植物物选择标记基基因NPTIII(新霉素素磷酸转移酶酶基因)，利用含卡卡那霉素的培培养基筛选种种子，可确定定基因转化率率和转基因植植株.为了解转基基因植株抗卡卡那霉素和抗抗汞是否同步步，我们用含含有卡那霉素素、汞、卡那那霉素+汞三种培养养基筛选转基基因种子.汞的筛选浓浓度采用烟草草的致死浓度度，转merrBhe基因因种子用PMMA0.5μM筛选；卡那那霉素的筛选选浓度为500mg/LL.MerBBhe-133株系的种子子群体中，抗抗卡那霉素和和抗汞的比例例较高，几乎乎占所处理种种子的2/3；MerBhhe-14株株系群体中，抗抗卡那霉素和和抗汞的比率率较低，还不不到所处理种种子的1/3.在同时含有有卡那霉素和和PMA的培养养基上，MeerBhe--13株系中中双抗幼苗的的比例接近单单抗的比例，而而MerBhhe-14株株系的双抗比比例明显低于于单抗，说明明有些抗卡那那霉素的植株株并不抗PMMA，而有些些抗汞的植株株并不抗卡那那霉素.合同时导入meerBhe和和NPTⅡ基因.当卡那霉素素抗性和汞抗抗性不一致时时，最好的解解释是，有些些转基因植株株的merBBhe或NPTⅡ基因没有表表达或表达水水平很低.在含有0.5μμMPMA的培培养基上，野野生型的烟草草种子没有发发芽，而转基基因株系MeerBhe--13和MerBhhe-14的的种子发芽情情况基本正常常，并且能够够正常生长.当PMA浓度提提高到1.00μM时,转基因种子子虽然能够发发芽和生长，但但下胚轴和叶叶片的伸展开开始出现异常常现象，表现现在有些下胚胚轴短缩和倾倾斜，叶片变变小和扭曲.随着PMA浓度的的升高，幼苗苗生长的异常常程度增加.经PMA初步筛筛选的MerrBhe-113幼苗，移移栽于盆钵土土壤中，用含含PMA的营养养液浇灌.结果显示，野野生型烟草PPMA的死亡亡临界浓度均均为0.1μM，在此浓度度下，幼苗培培养5d后叶片开始始发黄并逐渐渐死亡.与此不同，MMerBhee-13幼苗苗在0.1μMPMAA的条件下健健康生长.随着PMA浓度的的增大，生长长开始受到不不同程度的抑抑制，表现在在叶片数的减减少，株高的的降低，叶色色变黄，根系系变小.其中2.0μM时，植株的的下部叶黄化化死亡，但上上部叶仍为黄黄绿色，新叶叶为淡绿色，可可维持生长.PMA浓度为2.5μM时，全部叶叶黄化，但若若在黄化时转转入不含PMMA的培养基基中，经1个星期后，新新叶转绿，表表明伤害可逆逆转.3.0μM的伤害出现现得早，也不不可逆.因此，2.5μMPMA是MerBhhe-13转基因株系系的致死临界界浓度，相比比未转基因的的烟草幼苗，抗抗汞性提高了了25倍.３．植物对有机机汞的转化作作用在营养液中附加加不同浓度氯氯化甲基汞（methylmercurychloride,CH3HgCl）培养大米草，测定汞胁迫对植物生长发育、质膜透性、MDA含量和SOD酶活性的影响。测试结果表明，大米草对有机汞耐性的阈值为2μmol/L。植株体内同时检测到有机汞和无机汞，其中47.5%的氯化甲基汞—Hg被转化为无机汞，42.5%为有机汞形式存在。无机汞和有机汞较多地分配在根系中，茎叶中无机汞含量为根系的70%，无机汞浓度也仅为根系的37.0%。根系中有机汞含量是茎叶含量的1.33倍，有机汞浓度是茎叶浓度的2.5倍。在汞的形态构成中，根系中无机汞含量与有机汞含量的比例是2.5∶1，茎叶中则为2.3∶1。结果表明，大米草能够将有机汞转化为无机汞，并且在体内超积累汞。有机汞对大米草草植株的影响响主要表现在在植物生长发发育、质膜透透性、MDAA含量和SOD酶活性性的改变。随随着营养液中中有机汞浓度度的增加，植植株的地下部部和地上部干干物重都有不不同程度的减减少，大米草草对营养液中中的有机汞表表现出较强的的耐性。有机机汞浓度为1μmol/LL时，植株的的形态和生长长状况无明显显改变；当氯氯化甲基汞的的浓度达到2μmol/LL时，培养7天的植株表表现出轻微的的失水萎焉状状，当有机汞汞浓度增加到到3μmol/LL时，培养7天就有明显的的失水萎焉状状，出现轻微微的受害症状状，生长减缓缓，培养14天后心叶呈呈淡绿色，老老叶叶脉间有有少量的黄色色斑点；生长长明显受阻，心心叶面积减小小，叶缘干枯枯，老叶均匀匀黄化。随着着有机汞浓度度的增加，受受害加重，心心叶停止生长长，老叶逐渐渐干枯脱落，根根系萎缩。4μmol/LL时地上部和和地下部干物物重分别只有有无汞胁迫时时的55.4%和65.7%，叶绿素含含量只有无汞汞胁迫时的58.2%。在含2μmoll/L氯化化甲基汞的HHoaglaand营养液液中培养7天后，取烟烟草和大米草草各3株测定细胞胞膜透性（电电解质相对外外渗率）、MMDA含量量和SOD活性。细细胞质膜透性性增大、细胞胞内部分电解解质外渗是非非生物胁迫对对植物伤害的的主要表现之之一。大米草草的电解质相相对外渗率小小于烟草，表表明其在PMMA胁迫下所所受的伤害小小于对照。丙丙二醛（MDDA）是常用用的膜脂过氧氧化指标，大大米草的MDDA含量小于于烟草，说明明其在PMAA胁迫下膜脂脂过氧化程度度小于烟草，受受害程度较轻轻。植物受非非生物胁迫伤伤害，细胞代代谢失调，同同时，植物也也有一些保护护和适应机制制。保护酶系系统就是植物物减轻胁迫伤伤害的机制之之一。PMAA胁迫下大米米草的SODD活性高于烟烟草，也表明明其自身调节节胁迫伤害的的能力强于烟烟草。因此，相相比烟草，大大米草在2μmol/LLPMA胁胁迫下的伤害害轻，耐性较较强。从各有机汞浓度度处理间烟草草地上部和地地下部干物重重以及叶片叶叶绿素含量的的差异显著性性分析看，1μmol/LL与2μmol/LL有机汞浓度度处理间差异异达极显著水水平（p<0.01），因因此，1μmol/LL可看作烟草草对有机汞的的耐性浓度。同同理，大米草草对有机汞的的耐性浓度为为2μmol/LL。大米草在含有11L2μmol/LL氯化甲基汞汞的营养液中中培养7天后，营养养液的体积变变为0.688L，植株根和和茎叶的干重重分别为72.5g和136.4g，根冠比为0.53。根、茎叶叶、营养液中中无机汞和有有机汞浓度与与含量见表2。开始培养养时，营养液液中的0.4mggPMA—Hg是唯一的的汞源，经过过7天的培养，在在营养液和根根、茎、叶中中不但检出了了有机形态的的汞，也有无无机形态的汞汞检出。其中中有机汞总量量为0.17mmg，为开始始培养时营养养液中汞总量量的42.5%，无机汞总总量为0.19mmg，为开始始培养时营养养液中汞总量量的47.5%。尚有0.04mmg未知形态态的汞未检出出，可能是被被培养箱所吸吸附，也可能能是因汞挥发发而损失。由于营养液中氯氯化甲基汞是是唯一的汞源源，因此，大大米草植株体体内的无机汞汞是根系吸收收的PMA—Hg转化而来来，即有42.5%的PMA—Hg被转化为为无机汞并分分布在植株体体内，其中根根系中分配25%，茎叶中分分配17.5%。可以看出出，大米草把把大部分的无无机汞分配在在根系，根系系可耐较高浓浓度的无机汞汞，而茎叶中中无机汞含量量仅为根系的的70%，无机汞浓浓度也仅为根根系的37.0%。同样，有有机汞也是较较多地分配在在根系中，根根系中有机汞汞含量是茎叶叶含量的1.33倍，有机汞汞浓度是茎叶叶浓度的2.5倍。在汞的的形态构成中中，根系中无无机汞含量与与有机汞含量量的比例是2.5∶1，茎叶中则则为2.3∶1。大米草培养7天天后，营养液液中也检测到到0.03mg//kg的无机机汞，这部分分无机汞可能能是根系分泌泌而来。营养养液中无机汞汞含量与有机机汞含量的比比例是5∶1。讨论植物修复技术((Phytooremeddiatioon)是近年年来发展起来来的一种绿色色生态技术，其其中利用重金金属超富集植植物(hyperraccummulatoor)进行修修复是当前环环境生物学研研究的热点领领域，它是经经济、有效的的污染治理方方法[9].目前已有Cdd、Co、Cr、Cu、Mn、Ni、Pb、Zn和As等超富集集植物发现的的报道，但相相对而言植物物不易富集汞汞，目前还没没有汞超富集集植物的报道道.因此，利用用汞的天然超超富集植物来来吸收富集，从从而从环境中中排除汞的可可能性很小.本文通过meerBhe的的修饰和转移移，创造转基基因植物，结结果得到对有有机汞表现高高抗作用的转转基因系，这这些转基因植植物可用来吸吸收和转化污污染环境中的的有机汞，是是汞污染土壤壤治理的有效效途径.在转基因植物体体内,merA基因因的表达产物物具有吸收和和挥发离子汞汞的解毒作用用，这一点在在转基因拟南南芥、北美鹅鹅掌楸和烟草草上得到了证证实[4，6，9-10]]；与此同时时，在转基因因拟南芥上mmerB基因因将有机汞转转化为无机汞汞[5].然而，merrB转基因植植物无法使无无机汞挥发.要使植物完完成有机态的的汞到气态汞汞的挥发，可可以有两种选选择：一是在在该植物中同同时导入meerA和merB两个个基因，二是是将merAA转基因植株株和merBB转基因植株株杂交，其后后代的染色体体组同时具有有这两个基因因.Bizilly等人将merrA和merB转基基因拟南芥作作为父母本杂杂交，所获得得的杂交后代代同预期的一一样能够将有有机汞直接转转化为气态的的单质汞[11].到目前为止止，大多数汞汞解毒的研究究集中在转基基因拟南芥上上.由于模式植植物拟南芥个个体很小，不不可能用于大大规模的植物物修复.要采用植物物修复的方法法处理土壤和和水体中的汞汞污染，必须须采用生物量量较大的植物物.在这方面，烟烟草是一种比比较理想的植植物.野生型的烟草植植株由于缺乏乏外源merrB基因，无无法有效地转转化醋酸苯汞汞，因此对醋醋酸苯汞表现现出高度的敏敏感性，转基基因烟草之所所以对醋酸苯苯汞表现出抗抗性，是因为为它吸收醋酸酸苯汞，并且且在merBB基因表达产产物的作用下下将有机态的的醋酸苯汞（有有机汞）转化化为离子态的的汞.其结果是，植植株体内的离离子汞浓度增增加，植株本本身也成为汞汞离子的超富富集载体。在在我们的实验验中，当醋酸酸苯汞浓度为为0.5μM时，merBB转基因烟草草的出苗和生生长是基本正正常的，而野野生型烟草不不能发芽，说说明此浓度下下转基因烟草草对醋酸苯汞汞表现出完全全的抗性；随随着醋酸苯汞汞浓度的升高高，转基因植植株虽然能够够生长，但受受到越来越大大的抑制.这是因为，转转基因植株体体内累积的离离子汞不断增增多，对植物物组织的危害害程度逐渐增增强.同时因植株株吸收醋酸苯苯汞也使苯环环的浓度增加加.植物体内的的苯环超过一一定量后也有有可能对生长长造成危害.但是，在此此类实验中，苯苯环的危害不不是明显的.Bizilly等人用甲甲基汞和醋酸酸苯汞筛选mmerB转基基因拟南芥，结结果发现两者者的筛选效果果是一致的[[5].merBhe转转基因烟草对对醋酸苯汞的的抗性高达33.0μM，由merBBhe基因作作用所产生汞汞离子可以进进一步转化为为低毒的单质质汞，这一过过程有赖于mmerA基因因的作用.在此之前，我我们已获得mmerA转基基因烟草，其其植株对g的抗性高达350μM，汞离子汽化化水平高达400。这些结果果表明，meer基因的导导入使烟草植植株对有机汞汞和离子汞的的抗性分别提提高了至少30倍和7倍。将merrB和merA基因因的作用结合合起来，就可可以使有机汞汞直接转化为为气态的单质质汞。我们准准备进行meerB转基因因烟草和meerA转基因因烟草的杂交交，获得既含含有merBB基因又含有有merA基因因的转基因杂杂种.这样的烟草草杂种既能够够将有机态的的醋酸苯汞转转化为离子态态的汞，又能能够将离子汞汞汽化为单质质汞，从而更更有效地控制制重金属汞的的污染.参考文献1.Hasssett-SSippleeB,SSwartooutJ,,SchooenyRR,MahhaffeyyKR,RiceGE.MMercurryStuudyReeporttoCoongresss:VoolumeV:HeealthEffecctsoffMerccuryaandMeercuryyComppoundss.EPAA-452//R-97--007.1997,,U.S..EnviironmeentalProteectionnAgenncy:WWashinngton,,DC.5:1--349.2.HaraddaM.MinammataDDiseasse-MMethyllmercuuryPooisoniinginnJapaanCauusedbbyEnvvironmmentall-Polllutionn.CrittRevToxiccol19995;225:1--24.3.SummeersAOO,BiootranssformaationofMeercuryyComppoundss,inReduccingRRisksfromEnvirronmenntalCChemiccalstthrougghBiootechnnologyy,GOOmenn,,Edittor.11988,PlenuumPreess:NNewYoork.RughCLL,WilldeHDD,StaackNMM,ThoompsonnDM,SummeersAOO,MeaagherRB.M