蛋白质和多肽的氨基酸序列测定专家讲座

第五课蛋白质和多肽氨基酸序列测定蛋白质和多肽的氨基酸序列测定专家讲座第1页蛋白质和多肽是由20种氨基酸按照一定次序经过肽键连接成一长链，然后经过链内、链间离子键、疏水作用等各种作用力进行折叠、卷曲形成一定构象并发挥其独特作用。氨基酸排列次序即蛋白质一级结构决定了蛋白质高级结构及功效。所以，测定蛋白质氨基酸序列是进行蛋白质结构功效研究中不可缺乏部分。另外，蛋白质一级结构信息也有利于对其基因结构研究。当前，进行蛋白质序列测定有两个关键步骤，即：①氨基酸残基一个一个依次从蛋白质和多肽末端切割下来；②正确判定每次切割下来氨基酸残基。其中第一步可采取化学法或酶法进行裂解。因为化学法较之酶法含有裂解率高、易于自动化、花费少等很多优点，被蛋白质化学试验室普遍采取，能够从蛋白质和多肽N端进行裂解，也能够从C端进行分析。第二步通常是在氨基酸残基上衍生了一个生色基团，经过高效液相色谱进行分离分析。本章将就蛋白质和多肽N端、C端氨基酸序列分析原理和方法、进行序列分析前蛋白质和多肽样品准备作一介绍。蛋白质和多肽的氨基酸序列测定专家讲座第2页第一节N端分析原理一、耦联蛋白质和多肽自由α—氨基经与异硫氰酸苯酯(PITC)试剂耦联后，与其紧邻第二个残基键协力大大减弱，很容易断裂。蛋白质和多肽的氨基酸序列测定专家讲座第3页二、裂解在无水条件下酸裂解，仅仅切下反应那个残基。紧挨第二个氨基酸残基暴露出自由α—氨基，又可与PITC进行耦联反应。蛋白质和多肽的氨基酸序列测定专家讲座第4页三、转化ATZ—氨基酸不稳定，在三氟乙酸水溶液(25％)中可转化成稳定PTH—氨基酸。蛋白质和多肽的氨基酸序列测定专家讲座第5页蛋白质和多肽的氨基酸序列测定专家讲座第6页四、PTH—氨基酸判定能够经过薄层层析、气相色谱、高效液相色谱及质谱等各种伎俩进行分析。近年来因为高效液相色谱技术含有分析速度快、灵敏度高、定性定量准确等很多优点，而且仪器本身结构也日臻完善，被广泛应用于PTH—氨基酸判定。通常选取C—18反相柱进行分离。蛋白质和多肽的氨基酸序列测定专家讲座第7页第二节N端蛋白质序列仪三、气相序列仪自动化蛋白质序列仪刚问世时，需要样品量为1～2mg。1978年Tarr等将一个四级铵盐聚合物“polybrene”引入了蛋白质、多肽序列测定，它能和肽链中极性基团作用(非共价键合)而将蛋白质和多肽有效地固定在玻璃纤维支持膜上，预防了萃取时样品损失。为了适应分子生物学对蛋白质微量分析要求，20世纪80年代初，Hewick及Hunkpillar等人改进了自动化蛋白质序列仪中仪器结构，它用弹筒型玻璃反应室(内部体积约0.05m1)代替了液相序列仪中旋转玻璃杯，用polybrene固定样品，Edamn降解反应中有试剂如三甲胺以气体方式输送，其它试剂以流动或液相脉冲方式输送。此仪器较之以前几个序列仪含有以下显著优点：①灵敏度高，花费样品量少，通常仅需50～100pmol；②试剂和溶剂消耗少，大约是液相序列仪l／10，降低了费用；③缩短了每步降解循环时间，提升了分析效率。

20世纪80年代末又对气相序列仪进行了部分改进，即将原来三氟乙酸以气体方式输送改为液相脉冲方式，称为脉冲液相序列仪，以适应不一样样品分析需要。另外，因为载有活性基团功效性PVDF膜问世，蛋白质和多肽能够共价固定在这类膜上，直接在上述两种序列仪上进行固相序列分析。蛋白质和多肽的氨基酸序列测定专家讲座第8页

在这两种序列仪中，Edman降解后PTH—氨基酸衍生物可及时直接从转化腔中自动输入高效液相色谱仪中进行PTH—氨基酸衍生物定性及定量分析，这么不但快速可靠，而且预防了样品损失。这两台仪器统一用电脑控制，包含化学反应和分析判定以及数据自动统计和处理。图4.2为标准PTH—氨基酸色谱分离图。由图可见，欲在20min内将各组分很好分离，需选择适当色谱条件，表4.1列出了各种条件改变造成个别组分位置迁移及图谱改进。蛋白质和多肽的氨基酸序列测定专家讲座第9页蛋白质和多肽的氨基酸序列测定专家讲座第10页第三节影响N端Edman反应裂解率原因在测序中往往能够发觉，即使N端很均一蛋白质(第一个循环出现单个氨基酸残基)，经过十几个循环后背景显著不及第一个残基清楚。这是因为Edman反应是一个化学过程，在其耦联、裂解、转化等步骤都有可能发生一些副反应，从而影响最终裂解效率。当前最正确产率为95％～98％。所以，经过50次循环后，PTH—氨基酸分析谱中将出现较多杂峰，影响正确识别，也就是说对于普通蛋白质最多能分析至N端第50个氨基酸左右，欲知全次序，则需将蛋白质降解成一系列肽段分析后再拼接。①对于有些蛋白质因为含有较多对Edman反应敏感残基或肽键，裂解效率将更低。②循环至Ser和Thr时产率突然降低，这是因为在进行这两个氨基酸残基分析前一个循环中，三氟乙酸除起裂解作用外，可能与Ser和Thr上羟基反应，继而部分封闭Ser和ThrN端—氨基。③另外，丝氨酸和苏氨酸PTI-{{汀生物也会部分转化成其它产物，造成产率降低。

耦联试剂PITC本身也将发生以下副反应，形成一些“杂质”。测序完成后，电脑将每个循环产率处理，得出起始产率(initialyield)和重复产率(repetitiveyield)，其中经过起始产率能够预计蛋白质真实含量，有时能够推测N端是否封闭(和氨基酸组成份析测得含量相差甚远)，而重复产率则表明机器是否正常运转。另外，假如蛋白质或多肽中含有过多Ser、Thr、Glu、Trp等氨基酸残基，也将降低这两个数值。蛋白质和多肽的氨基酸序列测定专家讲座第11页第六节C端序列分析

即使建立在Edman化学法上自动化N端测序技术日趋成熟，但仍有不少问题需借助C端序列分析来处理。C端测序尤其适合于基因重组蛋白是否正确表示判定和大规模生产时质量控制、N端封闭蛋白分析以及DNA探针设计。因为选择性对C端羧基进行耦联修饰并从C端逐一将氨基酸残基切下较N端测序困难，在过去近20年里，即使为数不少蛋白质化学家致力于C端测序研究，但当前仍不能和N端测序技术程度媲美。蛋白质化学工作者曾利用羧肽酶分析C端氨基酸残基，不过因为不一样羧肽酶对个别氨基酸残基有选择性，使用时仍有一定困难。最近，因为对化学法测定C端技术进行了一系列改进，已经有了自动化C端序列仪问世。所以介绍一个自动化C端测序方法原理及应用。蛋白质和多肽的氨基酸序列测定专家讲座第12页一、C端分析原理基于与N端Edman降解类似原理，C端分析采取化学试剂与蛋白质和多肽α—羧基反应，反应后C端衍生物被切割下来，经过HPLC系统进行分离分析。一个完整C端序列分析包含以下几个步骤：(1)活化蛋白质和多肽C端自由羧基与乙酸酐反应生成混合酸酐，并深入环化成嗯唑酮，而侧链上羧基形成混合酸酐难以成环。C端嗯唑酮在硫氰四丁铵作用下，转化为乙内酰硫脲(thiohydantoin，TH)。蛋白质和多肽的氨基酸序列测定专家讲座第13页(2)酰胺化保护侧链羧基侧链羧基形成混合酸酐后，与硫氰哌啶深入作用形成酰胺，以保护侧链。蛋白质和多肽的氨基酸序列测定专家讲座第14页(3)烷基化因为C端环化形成TH衍生物较为稳定而不易被切割，因此产率不高。用溴甲基萘选择性地烷基化修饰硫原子，形成Alkylated-TH(ATH)衍生物，裂解产率将大大提升。蛋白质和多肽的氨基酸序列测定专家讲座第15页(4)修饰Thr和Ser羟基蛋白质和多肽中羟基会干扰测序，所以需要修饰。在活化过程中，乙酸酐也会与羟基反应将其乙酰化，但反应不完全，在N—甲基咪唑(NMl)和乙酸酐共同作用下，Thr和Ser上羟基基本被乙酰化。蛋白质和多肽的氨基酸序列测定专家讲座第16页(5)裂解和衍生C端ATH衍生物在酸性条件下与[NCS]—反应而被裂解生成ATH—氨基酸，新C端自动形成TH，而无须重新活化。所以，整个测序过程只需在开始时对C端进行一次性活化，并修饰Asp和Glu侧链羧基以及The和Ser羟基。实际上，循环反应只有烷基化和裂解两步，其全过程图解如下列图。蛋白质和多肽的氨基酸序列测定专家讲座第17页二、C端蛋白质序列仪近年来，已经有商品化C端序列仪问世。C端序列仪普通由N端序列仪改装而成，其基本结构与后者相同，二者不同之处主要在于：①反应所用试剂不一样，所以二者不可兼容，不然极易堵塞管道；②在C端序列仪中，全部化学反应均在弹筒型反应室中进行，切割下来ATH—AA仅在转化腔内干燥和溶解后即进入HPLC系统分离分析；而在N端测序仪中，ATZ—AA需在转化腔中转化为PTH-AA。蛋白质和多肽的氨基酸序列测定专家讲座第18页蛋白质和多肽的氨基酸序列测定专家讲座第19页

四、影响C端测序反应产率原因C端测序副反应较多，最高初始产率仅为20％，而对于Glu，Asp，Ser，Thr等氨基酸，其产率将更低。如C端富含上述几个氨基酸，测序将十分困难。另外，一旦碰到Pro，因为吡咯环存在而不能与乙酸酐反应成环，整个测序过程将终止。到当前为止，C端测序可测1～10个残基，一次测序需要量比N端测序要大得多，最少需1nmol。另外，因为不一样氨基酸反应产率不一样，所以，对图谱分析也比N端测序复杂，需要较