疫苗制造基本程序专家讲座

项目一细菌性灭活疫苗制造项目二细菌性活疫苗制造项目三病毒疫苗制造内容疫苗制造基本程序专家讲座第1页项目一细菌性灭活疫苗制造疫苗制造基本程序专家讲座第2页灭活细菌疫苗通用制造程序

菌种选择菌液培养灭活

配苗浓缩

菌种选择菌液培养灭活浓缩配苗细菌性灭活疫苗简称灭活菌苗，种类、苗型甚多，但制造基本程序差异不大。

一、细菌性灭活疫苗制造疫苗制造基本程序专家讲座第3页疫苗制造基本程序专家讲座第4页基本流程菌液佐剂+乳化分装和保留原料配置灭活菌液灭活疫苗制造基本程序专家讲座第5页一、细菌性灭活疫苗制造（一）菌种与种子

1.菌种

制苗用菌种多数为毒力强、免疫原性优良菌株，通常使用1-3个品系，均由中国药品生物制品检定所或中国兽药监察所传代、判定、冻干保留和供给。各种用于制造菌苗菌种应按要求定时复壮，并进行形态、培养特征、菌型、抗原性和免疫原性判定，合格菌种准许用于制苗。2.种子培养将经判定符合标准菌种接种于菌苗生产规程中所要求培养基进行增殖培养，经纯粹检验、活菌计数到达标准后即为种子液，用于菌苗生产。种子液通常保留于2-8C冷暗处，不得超出规程要求使用期限。菌种选择菌液培养灭活浓缩配苗疫苗制造基本程序专家讲座第6页（二）菌液培养

大量生产细菌培养方法甚多，现有手工式，也有机械化或自动化培养方式。机械化或自动化培养方式通称为反应缸培养法，可供选择菌液培养法有：液体静置培养法、液体深层通气培养法、透析培养法及连续培养法等。

菌液培养也可采取固体培养法，该方法易取得高浓度细菌悬液，易稀释成不一样浓度，且含培养基成份较少，所以比较适合用于制备诊疗用抗原。一、细菌性灭活疫苗制造菌种选择菌液培养灭活浓缩配苗疫苗制造基本程序专家讲座第7页（三）灭活

灭活菌苗通常依据细菌特征加入最有效灭活剂，采取最适当灭活条件进行，几个灭活菌苗灭活方法如表所表示。表几个灭活菌苗灭活方法

一、细菌性灭活疫苗制造菌种选择菌液培养灭活浓缩配苗疫苗制造基本程序专家讲座第8页（四）浓缩

为提升一些灭活菌苗免疫力，在培养过程中采取提升菌数基础上，再经过浓缩方法到达目标。惯用浓缩方法：氧化铝胶吸附沉淀法离心沉降法羧甲基纤维沉淀法

以上方法可使菌液浓缩一倍以上。另外，有些细菌在生长过程中产生分子量小可溶性抗原（如猪丹毒杆菌产生糖蛋白）也可经氢氧化铝吸附浓缩；将破伤风脱毒液按盐酸—食盐法处理，以作深入精制成提纯破伤风类毒素。一、细菌性灭活疫苗制造菌种选择菌液培养灭活浓缩配苗疫苗制造基本程序专家讲座第9页

（五）配苗与分装

因为灭活菌苗所用佐剂不一样，所以配苗方法也不相同。

氢氧化铝菌苗：可在加入甲醛灭活同时，按百分比加入氢氧化铝胶配制；也可在菌液经甲醛灭活后再按百分比加入氢氧化铝胶配苗。有厂油佐剂菌苗配制程序为：于灭菌油乳剂135m110号白油、11.4m1Span-85、3.6mlTween80混合液中，在边搅拌下加入等量甲醛灭活菌液配制。

配苗和分装：应充分混匀，及时塞塞、贴签或印字。一、细菌性灭活疫苗制造菌种选择菌液培养灭活浓缩配苗疫苗制造基本程序专家讲座第10页项目二细菌性活疫苗制造疫苗制造基本程序专家讲座第11页弱毒菌种多系冻干品，由中国药品生物制品检定所或中国兽药监察所传代、判定、保留与分发，少数由国家指定单位判定、保留与供给。菌种使用前应按规程要求进行复壮、挑选，并作形态、特征、抗原性和免疫原性判定，符合标准后方可用于制苗。将检定合格菌种接种子于要求培养基，按要求条件增殖培养，经纯粹检验及相关检验合格者即可作为种子液。种子液通常在0～4C可保留2个月，在保留期内可作为菌苗生产批量种子使用。

细菌性活疫苗多指弱毒菌苗，尽管种类与苗型甚多，但基本制造程序相同。（一）菌种与种子二、细菌性活疫苗制造菌种选择菌液培养浓缩配苗疫苗制造基本程序专家讲座第12页按1%～3%量将种子液接种于培养基，然后依不一样菌苗要求进行培养。如猪丹毒弱毒菌须在在深层通气培养中加入适当植物油作消泡剂，通入过滤除菌热空气进行培养制造菌液如人用炭疽活疫苗、卡介苗经固体表面培养完成后须按要求要求将菌苔洗下制成菌液菌液于0～4C暗处保留，待抽样经纯粹、活菌数等检验合格后使用。（二）菌液培养二、细菌性活疫苗制造菌种选择菌液培养浓缩配苗疫苗制造基本程序专家讲座第13页经检验合格菌液，按要求百分比加入保护剂配苗，充分摇匀后随即进行分装，分装量必须准确。分装好菌苗快速送入冻干柜进行预冻、真空干燥，冻于完成后马上加塞、抽闲、封口，移入冷库保留，并由质检部门抽样检验。（四）配苗与冻干为提升一些弱毒菌苗免疫效果，可进行浓缩，以提升单位活菌数，惯用依缩方法有吸附剂吸附沉降法、离心沉降法等，如于猪丹毒菌液内加入0.2%～0.25%羧甲基纤维素(CMC)进行浓缩，也可用离心沉淀浓缩。浓缩菌液应抽样作纯粹、活菌数等检验。（三）浓缩二、细菌性活疫苗制造菌种选择菌液培养浓缩配苗疫苗制造基本程序专家讲座第14页流程图1——细菌疫苗制造工艺流程蛋白质、肉浸液等原料培养基细菌分离菌种弱毒菌种配置、灭菌判定减毒检验配制灭菌检验配制灭菌原料佐剂灭活菌液配苗、乳化灭活疫苗培养菌苗原液配苗活疫苗保护剂菌液分装、冻干分装灭活原料活化种子疫苗制造基本程序专家讲座第15页项目三病毒疫苗制造病毒性禽胚培养疫苗制造病毒性细胞培养疫苗制造病毒性动物组织疫苗制造疫苗制造基本程序专家讲座第16页一、病毒性禽胚培养疫苗制造受精卵应来自SPF鸡群，最少源于未用抗生素药品非免疫鸡群，以免受母源抗体干扰和残留抗生素影响。从受精卵入孵开始至培养全过程都应保持无菌，要求一定温度和湿度，且需不停翻动，然后选择。选择一定日龄、发育正常胚用于接毒培养。

痘病毒、正粘病毒、副粘病毒和疱疹病毒等一类生物制品，当前依然利用禽胚尤其是鸡胚制备，如鸡新城疫苗、禽流感疫苗、犬瘟热鸡胚弱毒疫苗等。禽胚疫苗生产原材料起源方便、质量比较轻易控制，制造程序简单，不需要过高设备条件，生产疫苗质量可靠。（一）鸡胚选择鸡胚选择种毒与毒种继代接毒与收获配苗疫苗制造基本程序专家讲座第17页（二）种毒与毒种继代当前适应于鸡胚种毒多系弱毒，包含自然弱毒与人工培育弱毒两类。各种制苗用种毒多数由国家菌毒种保藏部门或指定单位保留，保留种毒多为冻干毒。冻干毒种需按要求要求在鸡胚继代复壮，通常继代3代以上，经检定符合标准后方可作力生产疫苗毒种，毒种检定内容包含无菌检验、毒价测定和其它项目标检定等。一、病毒性禽胚培养疫苗制造种毒与毒种继代鸡胚选择接毒与收获配苗疫苗制造基本程序专家讲座第18页（三）接毒与收获

鸡胚接毒包括接毒路径和接毒量两方面。依据不一样病毒与不一样疫苗生产程序，选择最正确接种路径和接种量。接种路径：绒毛尿囊膜接种11~12日龄胚尿囊腔接种9~11日龄胚羊膜腔接种10~12日龄胚卵黄囊接种5~8日龄胚如鸡新城疫I系和II系毒采取尿囊腔接毒，前者接种10-3稀释毒种0.1ml，后者接种10-4稀释毒种0.1ml。鸭瘟鸡胚化弱毒疫苗采取绒毛尿囊膜接种50-100倍稀释毒0.2ml。1.接毒一、病毒性禽胚培养疫苗制造接毒与收获鸡胚选择种毒与毒种继代配苗疫苗制造基本程序专家讲座第19页

鸡胚接毒后培养增殖时间和温度、湿度以及收获标准与内容物依不一样病毒和不一样疫苗而异。如鸡新城疫I系疫苗，接毒后于38.5~39C、相对湿度60%~70%条件培养增殖，搜集接毒后24~48h内死亡胚，置0~10C冷却4~24h，收获胚液，进行无菌检验，供制备湿苗用。也可收获胚液、胎儿及绒毛尿囊膜混合制成乳剂制备冻干苗。鸭瘟鸡胚化弱毒疫苗，则搜集接毒后48~120h内死亡鸡胚，冷却后采取绒毛尿囊膜、尿囊液、胎儿制造冻干苗用。2.培养收获疫苗制造基本程序专家讲座第20页

按要求收获胚液、胎儿和绒毛尿囊膜乳剂经无菌检验合格后即可进行配苗。

1.湿苗通常于鸡胚液内，按每毫升加入青霉素和链霉素500~1000U，放置0~10C冷暗处处理后分装。

2.冻干苗经无菌检验后合格胚液或胚液、胎儿、绒毛尿囊膜乳剂，按百分比加入保护剂，充分混合后滤过，于滤液内按每毫升加入青、链霉素500~1000U，混合后分装冻干。

3.灭活苗

收获鸡胚液经无菌检验及毒价测定合格后，按要求百分比加入平衡液，按不一样病毒灭活温度、时间进行灭活，加入对应佐剂，制备成灭活疫苗，放置4-10C保留。（四）配苗一、病毒性禽胚培养疫苗制造配苗鸡胚选择种毒与毒种继代接毒与收获疫苗制造基本程序专家讲座第21页流程图2——病毒性禽胚疫苗制造工艺流程受精卵禽胚毒株种毒灭活病毒液判定培育检验检验配制原料佐剂配苗、乳化灭活疫苗含病毒尿囊液或禽胚组织含病毒悬液配苗活疫苗保护剂分装、冻干分装灭活原料种子扩增收获配制纯化病毒悬液接种疫苗制造基本程序专家讲座第22页二、病毒性细胞培养疫苗制造

用于制苗用种毒应经毒力、最小免疫量、安全性、无菌检定合格，通常为冻干品，由国家指定苗毒种保藏部门检定分发。领取种毒应按要求在细胞继代培养适应后用作毒种，制苗用毒种应按要求控制在一定代数以内，或为湿毒毒种，或为冻干毒种。

细胞培养疫苗有细胞培养灭活疫苗和细胞培养活疫苗两类，前者多以强毒毒株培养增殖制造，后者则用弱毒毒株增殖生产，二者制造程序现有相同之处，又有区分。因为病毒不一样与疫苗性质不一样，所采取细胞及细胞培养方法也有所不一样（一）种毒与毒种继代接毒与收获种毒与毒种继代配苗细胞制备疫苗制造基本程序专家讲座第23页

制造疫苗用细胞大致为原代细胞和传代细胞两类，依据病毒种类、疫苗性质与工艺流程选择不一样细胞。

选择依据包含：病毒适应性高、毒价高、细胞起源方便、制备简单、生命力强。如猪瘟兔化弱毒牛睾丸细胞疫苗采取犊牛睾丸原代细胞；脊髓灰质炎活疫苗选择vero细胞；狂犬病弱毒细胞适应疫苗采取BHK21细胞增殖病毒等。（三）细胞制备接毒与收获种毒与毒种继代配苗细胞制备二、病毒性细胞培养疫苗制造培养细胞和增殖病毒用营养液又称培养液，通常分为细胞培养用生长液和病毒增殖用维持液，二者不一样之处通常只是生长液内含有5%-10%血清；维持液血清浓度为2%-5%。不一样细胞所需营养成份和生长条件不尽相同。当前惯用细胞培养方法为静止培养和转瓶培养，至于微载体培养和悬浮培养在我国尚处于试验之中。疫苗制造基本程序专家讲座第24页（四）接毒与收获

病毒接种培养有同时与异步之分，前者在细胞分装同时或很快接种毒种，进行培养，如猫、犬传染性肠炎疫苗(细小病毒)；后者在细胞形成单层后接种毒种，如流行性乙型脑炎细胞培养疫苗。通常在细胞形成单层后倾去培养液，按1%-2%量接种毒种，经吸附后加入维持液继续进行培养，待出现70%-85%以上细胞病变时即可收获。病毒培养液收获时间和方法依疫苗性质而定，可将培养瓶冻融数次后搜集；或加入EDTA-胰蛋白酶液消化分散收取；或在病毒增殖培养过程中可收获5-7次毒液，细胞毒液经无菌检验、毒价测定合格后供配苗用。

接毒与收获种毒与毒种继代配苗细胞制备二、病毒性细胞培养疫苗制造疫苗制造基本程序专家讲座第25页（五）配苗1．灭活疫苗不一样灭活剂对不一样病毒作用也不一样。向细胞毒液内按要求加入灭活剂，在一定温度下作用一定时间，有灭活剂还需加入阻断剂中止灭活。灭活疫苗配置通常都需加入佐剂，充分混合、分装，制成灭活疫苗。2．冻干苗细胞毒液内按百分比加入保护剂或稳定剂，充分混合、分装，进行冷冻真空干燥制成冻于疫苗。

接毒与收获种毒与毒种继代配苗细胞制备二、病毒性细胞培养疫苗制造疫苗制造基本程序专家讲座第26页流程图3——病毒性细胞疫苗制造工艺流程动物或胚胎组织毒株种毒灭活病毒消化判定培育培养检验检验配制原料佐剂传代细胞配苗（混匀、乳化）灭活疫苗细胞悬液生长细胞配苗活疫苗保护剂原苗分装、冻干分装灭活原料原料细胞培养液配制剪碎种子判定扩增收获配制灭菌疫苗制造基本程序专家讲座第27页疫苗制造基本程序专家讲座第28页三、病毒性动物组织疫苗制造病毒在易感动物体内可大量增殖，但在各器官组织、部位中增殖病毒量却有很大差异，利用病毒增殖快速、含毒量高组织制造疫苗称为组织疫苗(tissuevaccine)。动物组织疫苗包含动物组织灭活疫苗和动物组织弱毒活苗两类，前者多数由强毒株制造，如猪瘟结晶紫疫苗、狂犬病羊脑组织疫苗；后者均以弱毒株生产，如猪瘟兔化弱毒乳兔组织疫苗、牛瘟兔化弱毒组织疫苗等。动物质量直接影响到组织疫苗质量，尤其是对疫苗安全性和效力有着决定性作用，动物必须符合以下标准：(1)应该是清洁级(二级)以上等级试验动物，即无要求人兽共患性病原体动物；(2)应是对所接种病毒易感性高动物，即在品种、年纪和体重方面合乎要求试验动物。（一）动物选择观察与收获动物选择配苗种毒与接种疫苗制造基本程序专家讲座第29页种毒既可用抗原性优良、致死力强自然毒株脏器组织毒或强毒株增殖培养物，也可用弱毒株组织毒种。不论何种种毒都须经纯粹、抗原性和免疫原性检验合格后使用。接种路径依病毒性质和目标而异，比如猪瘟结晶紫苗，采取猪肌肉注射血液毒种；牛瘟兔化弱毒疫苗，以兔耳静脉注射脾淋毒种；狂犬病疫苗，用兔脑毒种接种绵羊脑内路径感染。几个动物惯用接种路径以下：1.脑内注射：颅前后中线5mm平行线与瞳孔横线交叉处。2.静脉注射：家兔由耳静脉注入；鸡自翅下肢静脉注入。3.肌肉注射：选择腿部、胸部、臀部等肌肉丰满处注射。4.皮下注射：家兔和豚鼠可选择在腹部或后腿内注射。5.腹腔注射：家兔与豚鼠可选腹股沟处刺入腹腔。（二）种毒与接种三、病毒性动物组织疫苗制造观察与收获动物选择配苗种毒与接种疫苗制造基本程序专家讲座第30页动物在接种感染后应天天观察和检验要求各项指标，指标或项目因不一样病毒而异。常规观察、检验项目如食欲、精神和活动状态、体温、粪便、尿和血液改变等。依据观察征象和检验结果选出符合要求发病动物按要求方式剖杀，采取搜集含毒量高器官组织。如猪瘟结晶紫疫苗采取发病猪血液制备；兔出血症组织灭活疫苗采集病兔肝脏生产；狂犬病疫苗利用发病羊羊脑组织制造。（三）观察与收获三、病毒性动物组织疫苗制造观察与收获动物选择配苗种毒与接种疫苗制造基本程序专家讲座第31页1．组织灭活疫苗采取收获组织经无菌检验及毒价测定合格后，按要求百分比加入平衡液和灭活剂（甲醛、酚、结晶紫等）制成匀浆，然后按不一样病毒灭活温度、时间进行灭活。如狂犬病疫苗配制按脑组织1:4加入含有甘油及1%酚蒸馏水，于360.5C灭活7天制成；猪瘟结晶紫疫苗配制，按血毒4份，结晶紫甘油溶液1份混合，于37C~38C灭活6~8天。2.弱毒组织疫苗在无菌操作下剔除脏器上脂肪与结缔组织等，称重后剪碎，加入适最保护剂制成匀浆，然后滤过扣除残渣量，再按滤液中实际组织量计算稀释倍数，加入余量保护剂和青链霉素5