蛋白质翻译后修饰的鉴定专家讲座

第六章蛋白质翻译后修饰判定蛋白质翻译后修饰的鉴定专家讲座第1页蛋白质翻译后修饰蛋白质翻译后修饰在生命体中含有十分主要作用，它使蛋白质结构更为复杂，功效更为完善，调整更为精细，作用更为专一N-端fMet或Met切除二硫键形成化学修饰剪切蛋白质翻译后修饰的鉴定专家讲座第2页泛素化对于细胞分化与凋亡、DNA修复、免疫应答和应激反应等生理过程起着主要作用磷酸化包括细胞信号转导、神经活动、肌肉收缩以及细胞增殖、发育和分化等生理病理过程糖基化在许多生物过程中如免疫保护、病毒复制、细胞生长、炎症产生等起着主要作用脂基化对于生物体内信号转导过程起着非常关键作用组蛋白上甲基化和乙酰化与转录调整相关蛋白质翻译后修饰的鉴定专家讲座第3页第一节蛋白质翻译后修饰判定一、生物体内蛋白质磷酸化修饰及其功效蛋白质磷酸化反应是指经过酶促反应把磷酸基团从一个化合物转移到另一个化合物上过程,是生物体内存在一个普遍调整方式，在细胞信号传递过程中占有极其主要地位蛋白质激酶催化把ATP或GTP上γ位磷酸基转移到底物蛋白质氨基酸残基上过程蛋白质翻译后修饰的鉴定专家讲座第4页蛋白质翻译后修饰的鉴定专家讲座第5页蛋白质磷酸化在细胞信号转导中作用在胞内介导胞外信号时含有专一应答特点胞内信使，cAMP，Ca2+，DG（二酰甘油）蛋白质磷酸化与脱磷酸化控制了细胞内已经有酶“活性”对外界信号含有级联放大作用蛋白质磷酸化与脱磷酸化确保了细胞对外界信号连续反应蛋白质翻译后修饰的鉴定专家讲座第6页

磷酸化类型丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸磷酸酯化精氨酸、组氨酸和赖氨酸亚酰胺化，天冬氨酸和谷氨酸酰化丝氨酸磷酸化：苏氨酸磷酸化：酪氨酸磷酸化=1800：200：1蛋白质翻译后修饰的鉴定专家讲座第7页被磷酸化修饰蛋白改变所带电荷改变催化基团性质改变蛋白质构象改变蛋白质亚细胞分步蛋白质功效改变多样性蛋白质翻译后修饰的鉴定专家讲座第8页蛋白质磷酸化研究有三个主要目标(1)对位于某一特定状态下细胞内给定蛋白质在体内磷酸化氨基酸残基定位(2)判定与磷酸化过程相关激酶(3)分析所观察到磷酸化现象对功效影响蛋白质翻译后修饰的鉴定专家讲座第9页二、磷酸化蛋白质分析概述磷酸化修饰蛋白质识别与检测是影响磷酸化蛋白质组学研究关键技术之一细胞内仅有少部分蛋白质被磷酸化,即使蛋白质表示量处于相对较高水平,该蛋白质磷酸化部分分析也很困难,普通一个发生磷酸化蛋白质其磷酸化部分仅占其总量10%

磷酸化蛋白质含量少，化学计量值低，磷酸化肽段很轻易淹没在大量非磷酸化肽段中蛋白质翻译后修饰的鉴定专家讲座第10页二、磷酸化蛋白质分析概述体外pmol体内fmol32p蛋白标识32p细胞标识蛋白质分离蛋白酶切蛋白酶切2DPP作图2DPP作图μLC－ESI-MS或MALDI-MSμLC－ESI-MSμHPLCIMAC磷酸氨基酸分析相关分析蛋白质翻译后修饰的鉴定专家讲座第11页二、磷酸化蛋白质分析概述双相磷酸多肽谱图

2D—PP多肽在薄层纤维板上进行电泳是第一相，在同一块板上进行薄层色谱(TCL)为第二相，分离得到磷酸肽用放射自显影或磷储屏检测此方法提供了其它方法不能提供相关蛋白质磷酸化状态主要信息

(1)磷酸化位点最大数目(2)放射自显影强度提供了在全部磷酸化肽中磷酸化相对化学计量(3)电泳和TCL正交分离提供了磷酸肽之间亲水性相对状态蛋白质翻译后修饰的鉴定专家讲座第12页二、磷酸化蛋白质分析概述磷酸肽本身所含有负电性使其在正离子模式质谱分析中信号受到抑制，在MALDI源质谱仪中磷酸肽信号丰度会比其对应未磷酸化肽段信号强度要低很多磷酰键较肽键轻易断裂，使磷酸化蛋白比非磷酸化蛋白判定要困难多蛋白质翻译后修饰的鉴定专家讲座第13页三、磷酸化蛋白质检测32P放射性标识法抗体免疫印迹检测法蛋白质翻译后修饰的鉴定专家讲座第14页1、32P放射性标识法32

P放射性标识法是最经典磷酸化蛋白质检测方法放射性32P标识ATP处理细胞，使32P掺入磷酸化蛋白质培养待标识细胞至适当生长久，在生长旺盛细胞中磷酸盐转运到达最高峰，用不含磷酸盐标识培养液替换原来细胞培养液，并加入32P标识磷酸盐共培养，使细胞ATP库与32P平衡，蛋白激酶利用被放射标识ATP使底物磷酸化蛋白质翻译后修饰的鉴定专家讲座第15页不足磷酸转换速率较低磷酸化蛋白质不能标识组织样本放射性污染蛋白质翻译后修饰的鉴定专家讲座第16页2、抗体免疫印迹检测法经过抗磷酸氨基酸抗体与磷酸化蛋白质免疫印迹反应(Westernblotting)来检出磷酸化蛋白质是较惯用方法在真核细胞中最常见磷酸化修饰是在蛋白质丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基侧链羟基磷酸化已经有商品化抗酪氨酸、丝氨酸和苏氨酸磷酸盐抗体,其中抗酪氨酸磷酸盐抗体特异性最好，磷酸化丝氨酸和苏氨酸抗原决定簇较小,抗原抗体结合位点有空间障碍,所以抗体结协力较差免疫印迹法与免疫沉淀相结合,能够在电泳之前先富集目标蛋白质,但这么也有可能丢失部分低丰度目标蛋白质,同时免疫沉淀技术反抗体要求更高,抗磷酸酪氨酸抗体含有很好亲和性能够进行免疫沉淀试验蛋白质翻译后修饰的鉴定专家讲座第17页样品制备（细胞、组织、体液提取蛋白质）制备型2D胶电泳分析型2D胶电泳考马斯亮蓝染色转印到膜找出对应磷酸化蛋白质磷酸氨基酸抗体免疫检测—得到磷酸化蛋白质染色—得到全部蛋白质点磷酸化蛋白质判定图谱比较蛋白质翻译后修饰的鉴定专家讲座第18页四、蛋白质磷酸化位点分析1、磷酸肽分离和富集分离浓缩分析物，提升信噪比假如磷酸肽被放射性标识，并含有相同比活度，那么每一个被分离肽段对应活度计数就表明这一组分中磷酸肽相对量，假如已知所用放射性标识物比活，就能轻易算出磷酸肽绝对量放射性标识磷酸肽分离谱能够用来定量检测不一样时间或细胞状态下蛋白质磷酸肽状态改变肽分离方法也有效地除去了非肽类杂质，更有利检测和分析低丰度磷酸肽蛋白质翻译后修饰的鉴定专家讲座第19页1、磷酸肽分离和富集方法反相液相色谱（PR-HPLC）免疫沉淀固相金属亲和色谱金属氧化物/氢氧化物亲和色谱离子交换和等电聚焦蛋白质翻译后修饰的鉴定专家讲座第20页免疫沉淀蛋白质翻译后修饰的鉴定专家讲座第21页原理当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在许多蛋白质－蛋白质间相互作用被保留了下来假如用蛋白质X抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合蛋白质Y也能沉淀下来免疫沉淀物蛋白质翻译后修饰的鉴定专家讲座第22页固相金属亲和色谱Immobilizedmetalaffinitychromatography,IMACIMAC柱：金属离子、螯合剂、填料原理：带正电金属离子，如Fe3+、Ca3+、Cu2+能够与带负电磷酸集团产生静电交互作用而结合，这种结合能力受pH值、离子强度和溶液有机相影响，在高pH或磷酸盐存在缓冲液中，金属离子与磷酸基团间结合被破环，磷酸肽被释放出来蛋白质翻译后修饰的鉴定专家讲座第23页不足丢失低丰度、没有结合到IMAC柱上磷酸化肽段含有多磷酸化位点肽因为较强亲和力较难被洗脱下来酸性基团（天冬氨酸、谷氨酸）、电子供体（组氨酸）也会结合到柱上，造成非磷酸化肽污染效果：依赖于所选择金属离子、填充柱材料及洗脱程序蛋白质翻译后修饰的鉴定专家讲座第24页金属氧化物/氢氧化物亲和色谱Metaloxide/hydroxideaffinitychromatography,MOACTiO2、Al(OH)3、ZrO2TiO2富集磷酸肽原理：

TiO2是一个两性物质，因为钛原子和氧原子原子表面化合价不饱和，TiO2在不一样pH值下能够表现为路易斯酸或路易斯碱在酸性溶液中，钛原子带正电表现为路易斯酸，能够与阴离子结合。磷酸盐、硼酸盐、硫酸盐都与TiO2含有高度亲和力，其中TiO2与磷酸盐结合能力最高调整pH值后，TiO2可用于富集磷酸肽蛋白质翻译后修饰的鉴定专家讲座第25页离子交换和等电聚焦离子交换（strongaionexchange,SAX/strongcaionexchange,SCX）:离子强度不一样进行分离IEF:等电点不一样进行分离主要用于复杂样本预分离，降低样本复杂程度结合金属亲和等其它富集技术，可取得很好效果蛋白质翻译后修饰的鉴定专家讲座第26页2、磷酸肽识别质谱技术质谱技术结合磷酸酶水解蛋白质翻译后修饰的鉴定专家讲座第27页MALDI-TOFMS

能够经过肽指纹谱(PMF)判定蛋白质，与磷酸酯酶处理相结合能够确定磷酸化位点原理：磷酸酯酶处理后，磷酸化肽丢失磷酸基团而产生特定质量数改变，MALDI-TOFMS经过检测这种质量数改变而确定磷酸化位点蛋白质翻译后修饰的鉴定专家讲座第28页原理经过MALDI-TOF/TOF一级质谱可发觉与肽段分子量理论值相差80Da

(HPO3=80Da)质谱峰,该峰二级质谱图中假如母离子与旁边最高强度质谱峰相差98Da(中性丢失H3PO4=98Da),则可确定该肽段为磷酸化肽段,

深入经过二级或多级质谱谱图确认详细磷酸化位点

利用β－消除反应使丝氨酸、苏氨酸磷酸化残基转化为氨乙基丙氨酸,后者为赖氨酸同形物,此位点可被胰蛋白酶和Lys-C

肽链内切酶等酶特异性识别、酶切,经过质谱即可很轻易地判断磷酸化位点。消除反应是从反应物相邻碳原子上消除两个原子或基团，形成一个π键过程1,2–消除反应（β-消除反应）蛋白质翻译后修饰的鉴定专家讲座第29页PSD-MALDI-MS分析源后衰变发生在源内离子化之后分子裂解MALDI-TOF-MS离子源内发生离子在真空无电场飞行管飞行过程中发生结构裂解，丢失一个中性分子后产生了碎片离子碎片离子含有与其前体离子相同飞行速度，但因为质量小，动能比前体离子小（亚稳离子）β－消除反应丢失HPO3或H3PO4，产生数降低80Da或98Da亚稳离子蛋白质翻译后修饰的鉴定专家讲座第30页图利用MALDI-TOF/TOF谱图判定磷酸化肽段a:酶切产物一级质谱图。磷酸化肽段质谱峰用星号标出,其相对未磷酸化肽段理论分子量位移80Da(HPO3=80Da);b:a中标识星号质谱峰二级质谱分析。在图中可见比母离子小98Da(H3PO4=98Da)中性缺失峰

蛋白质翻译后修饰的鉴定专家讲座第31页串联质谱(MS/MS)前体离子扫描经过检测磷酸基团产生特定片段来汇报磷酸肽存在；磷酸化肽经CID（碰撞诱导解离）后会产生磷酸基团特异性片段，这些特异性片段在用串联质谱进行前体离子扫描时可作为磷酸肽“汇报离子”蛋白质翻译后修饰的鉴定专家讲座第32页前体离子扫描在三级四级串联质谱采取使各种质荷比离子依次经过Q1分析器，Q2为碰撞诱导解离室，将Q3分析器电压和频率设定为只能传输某一特定质荷比，即特定质荷比子离子直接检测在碰撞诱导解离过程中丢失碎片离子蛋白质翻译后修饰的鉴定专家讲座第33页前体离子扫描分析磷酸肽负离子模式设定Q3中仅能经过子离子质荷比m/z79，即磷酸肽丢失PO3-，这么得到质谱图仅显示丢失m/z79离子谱峰丢失磷酸根离子磷酸肽谱峰多肽产生各种碎片离子中，质量数在79Da附近几乎没有蛋白质翻译后修饰的鉴定专家讲座第34页中性丢失扫描含有两级质量分析器和碰撞诱导解离室串联质谱仪Q1和Q2同时扫描，但扫描范围不一样，保持一个特定电压差值，这个电压差所代表质荷比m/z值代表一个中性分子质量将Q1输送来离子碰撞诱导裂解，再将碎片离子送入Q3只有在Q2中诱导裂解后能丢失这一特定中性分子离子才会被Q3传输到检测器蛋白质翻译后修饰的鉴定专家讲座第35页中性丢失扫描分析磷酸肽从带一个正电荷[M+H]+肽混合物中寻找丢失中性磷酸分子H3PO4磷酸肽，则Q1和Q3扫描电压差所代表质荷比应为m/z98从带两个正电荷[M+2H]2+肽混合物中寻找丢失中性磷酸分子H3PO4磷酸肽，则Q1和Q3扫描电压差所代表质荷比应为m/z49只能分析磷酸化丝氨酸和磷酸化苏氨酸蛋白质翻译后修饰的鉴定专家讲座第36页3、磷酸化氨基酸位点确实定用于确定磷酸化肽中磷酸化位点质谱方法基于两种不一样原理第一个方法取决于磷酸酯键化学稳定性如在ESI质谱仪碰撞室或离子源中，或在MALDI—MS源后裂解（PSD）过程中磷酸化肽可经过磷酸酯键断裂产生碎片离子判定蛋白质翻译后修饰的鉴定专家讲座第37页第二种方法基于肽段增加磷酸酯基团质量数假如蛋白是已知，可经过质量数来确定肽段在一些情况下，肽段只含有一个丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸残基，则很轻易找到磷酸化位点，但在大多数情况下肽段含有许多个丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸残基，则确定磷酸化位点发生困难

蛋白质翻译后修饰的鉴定专家讲座第38页五、蛋白质磷酸化定量分析定量：磷酸化蛋白与其对应非磷酸化蛋白质百分比研究蛋白样本酶切后等分成两部分,一部分直接用CH3OH甲酯化,另一部分经过磷酸酯酶处理后用CD3OH甲酯化,随即将二者混合进行串联质谱研究,即可得到磷酸化肽段磷酸化水平定量信息该技术设计巧妙,但甲酯化效率可能会影响定量结果蛋白质翻译后修饰的鉴定专家讲座第39页一个基于稳定同位素标识分析技术SILAC(stableisotopelabelingwithaminoacidsincellculture)采取含有轻同位素型和重同位素型氨基酸培养液对不一样细胞分别进行培养,使细胞内蛋白被同位素稳定标识,提取细胞蛋白并将其等量混合,酶切后进行质谱判定,经过分析不一样标识型肽段相对量而确定蛋白相对量15N稳定同位素标识法、磷酸肽同位素亲和标识法既能够研究全蛋白质组改变,也能够结合磷酸化肽段富集技术和串联质谱技术对磷酸化肽段进行定量研究蛋白质翻译后修饰的鉴定专家讲座第40页15N稳定同位素标识法一个正常培养基，一个由15N提供N源质谱图中，每一个水解肽段表现为一对峰15N/14N同位素丰度比能够表示出两种细胞起源蛋白质表示量相对水平两种细胞表示完全一致，全部15N/14N丰度比将在一个平均值范围内两种起源蛋白质磷酸化程度不一样，其含磷肽段与对应未磷酸化肽段15N/14N丰度比就与平均值不一样，依据其比值来进行磷酸化程度相对定量蛋白质翻译后修饰的鉴定专家讲座第41页15N稳定同位素标识法蛋白质翻译后修饰的鉴定专家讲座第42页磷酸肽同位素亲和标识法使磷酸肽或磷酸化蛋白在碱性环境下发生β消除，同时用亲核试剂攻击形成双键并发生加成反应对不一样起源磷酸肽或磷酸化蛋白使用不一样亲核试剂其中一个试剂上氢由氘代替再经过化学反应在加成亲核试剂上连接一个亲和标签（生物素）蛋白质翻译后修饰的鉴定专家讲座第43页磷酸肽同位素亲和标识法蛋白质翻译后修饰的鉴定专家讲座第44页磷酸肽同位素亲和标识法蛋白质翻译后修饰的鉴定专家讲座第45页磷酸肽同位素亲和标识法蛋白质翻译后修饰的鉴定专家讲座第46页磷酸肽同位素亲和标识法蛋白质翻译后修饰的鉴定专家讲座第47页第二节糖基化蛋白质判定糖蛋白是由短寡糖链与蛋白质共价相连组成分子糖蛋白包含酶、激素、载体、凝集素、抗体等糖蛋白携带一些蛋白质代谢去向信息寡糖链在细胞识别、信号传递中起关键作用蛋白质翻译后修饰的鉴定专家讲座第48页一、糖蛋白结构特征糖链与蛋白连接方式①N-糖苷键型：寡糖链（N-乙酰氨基葡萄糖GlcNACβ-羟基）与Asn酰胺基、N-未端α-氨基、Lys或Argω-氨基相连②O-糖苷键型：寡糖链（GalNACα-羟基）与Ser、Thr和羟基赖氨酸、羟脯氨酸羟基相连③S-糖苷键型：以半胱氨酸为连接点糖肽键④酯糖苷键型：以天冬氨酸、谷氨酸游离羧基为连接点蛋白质翻译后修饰的鉴定专家讲座第49页糖蛋白中糖链结构

糖蛋白中糖链改变较大，含有丰富结构信息，寡糖链往往是受体、酶类识别位点N-糖苷键型（N-连接）①高甘露糖型：由GlcNAc和甘露糖组成②复合型：除了GlcNAc和甘露糖外、还有果糖、半乳糖、唾液酸；③杂合型：包含①和②特征，五糖关键O-糖苷键型（O-连接）没有五糖关键蛋白质翻译后修饰的鉴定专家讲座第50页分类可溶性糖蛋白存在于细胞内液、各种体液及腔道腺体分泌粘液中血浆蛋白除白蛋白外皆为糖蛋白。包含酶（如核酸酶类、蛋白酶类、糖苷酶类）、肽类激素（如绒毛膜促性腺激素、促黄体激素、促甲状腺素、促红细胞生成素）、抗体、补体、以及一些生长因子、干扰素、抑素、凝集素及毒素等蛋白质翻译后修饰的鉴定专家讲座第51页膜结合糖蛋白肽链由疏水肽段及亲水肽段组成，疏水肽段可为一至数个，并经过疏水相互作用嵌入膜脂双层中；亲水肽段暴露于膜外糖链连接在亲水肽段并有严格方向性：在质膜表面糖链一律朝外，在细胞内膜普通朝腔面包含酶、受体、凝集素及运载蛋白等，常参加细胞识别，并可作为特定细胞或细胞在特定阶段表面标志或表面抗原蛋白质翻译后修饰的鉴定专家讲座第52页凝集素糖结合蛋白，能专一识别某一特定单糖或寡糖中特定糖基序列而与之结合富集、浓缩、分离、糖链结构分析蛋白质翻译后修饰的鉴定专家讲座第53页结构糖蛋白为细胞外基质中不溶性大分子糖蛋白胶原及各种非胶原糖蛋白(纤粘连蛋白、层粘连蛋白等)作为细胞外基质结组成份起支持、连接及缓冲作用，参加细胞识别、粘着及迁移，并调控细胞增殖及分化

蛋白质翻译后修饰的鉴定专家讲座第54页二、生物质谱技术判定糖蛋白糖蛋白糖苷内切酶还原、烷基化、蛋白酶解MALDI-TO-MS糖含量相对分子量MALDI-TO-MSESI串联质谱凝集素提取氨基酸序列糖基化位点糖肽片段蛋白质翻译后修饰的鉴定专家讲座第55页糖含量、糖苷键类型、糖基化位点是糖蛋白一级结构主要指标糖蛋白平均分子量及糖含量测定糖苷内切酶将糖链切掉，将反应前后质谱图比较，就能直接表述糖链平均质量，而糖蛋白平均糖含量可由糖链平均质量占糖蛋白平均相对分子质量百分比来表示蛋白质翻译后修饰的鉴定专家讲座第56页糖基化类型及糖基化位点确实定蛋白酶酶切和糖苷内切酶相结合先用蛋白酶将糖蛋白酶切成含有或不含有糖链肽片段，取得糖蛋白肽质量指纹谱，再用糖苷内切酶将糖链切除，其肽质量指纹谱将发生改变，原含有糖肽段质量因为糖链丢失在质谱图发生位移，经过网上数据库检索能够得到位移肽段氨基酸序列，从而确定糖基化位点蛋白质翻译后修饰的鉴定专家讲座第57页蛋白质翻译后修饰的鉴定专家讲座第58页1、MALDI-TOF-MS应用基质选择α-腈基－4－羟基肉桂酸蛋白质翻译后修饰的鉴定专家讲座第59页1、MALDI-TOF-MS应用糖蛋白平均分子质量及糖含量测定糖蛋白分子结构含有不均一性糖链微不均一性糖基化位点不均一性多羟基结构糖链使其质子化能力低糖链末端唾液酸干扰蛋白质翻译后修饰的鉴定专家讲座第60页1、MALDI-TOF-MS应用糖蛋白平均分子质量及糖含量测定糖链微不均一性质谱图上表现一簇峰G＋各峰之间约相差一个糖基有时还出现双电荷峰G2＋分子离子峰变宽，糖链分子质量越大，峰越宽，灵敏度越差蛋白质翻译后修饰的鉴定专家讲座第61页1、MALDI-TOF-MS应用经典糖蛋白出峰模式，不均一性造成各种糖形存在为51000双电荷峰杂质N-糖基化质谱分析图蛋白质翻译后修饰的鉴定专家讲座第62页1、MALDI-TOF-MS应用去糖基化处理质谱分析图去糖基化单电荷峰，图谱变得简单且峰形尖锐去糖基化双电荷峰完整未发生去糖基化单电荷峰蛋白质翻译后修饰的鉴定专家讲座第63页1、MALDI-TOF-MS应用经唾液酸酶去唾液酸化处理质谱分析去唾液酸化单电荷峰去唾液酸化双电荷峰非特异性降解产物蛋白质翻译后修饰的鉴定专家讲座第64页蛋白质翻译后修饰的鉴定专家讲座第65页1、MALDI-TOF-MS应用糖基化类型及糖基化位点确实定寻找质谱图上峰位移从位移峰肽段序列中，寻找出可能连接糖链氨基酸蛋白质翻译后修饰的鉴定专家讲座第66页2、LC-ESI-Q-TOF-MS糖链结构分析串联质谱母离子扫描技术选择特定糖链离子，经碰撞活化使用惰性气体将其打坏，从而推断糖链结构如人血清转铁蛋白糖链结构分析选择以HPLC分离一个糖链，其分子离子双电荷[M+2H]2＋在电喷雾串联质谱中为823.8，将其设为母离子，以惰性气体与其碰撞产生碎片蛋白质翻译后修饰的鉴定专家讲座第67页2、LC-ESI-Q-TOF-MS糖链结构分析蛋白质翻译后修饰的鉴定专家讲座第68页2、LC-ESI-Q-TOF-MS糖链结构分析中性丢失蛋白质翻译后修饰的鉴定专家讲座第69页3、凝集素在糖蛋白分析中应用伴刀豆蛋白（ConA）对高甘露糖型N-糖链有专一性麦胚凝集素（WGA）对杂合型N-糖链有专一性兵豆凝集素对亲和关键岩藻糖类糖链有专一性蛋白质翻译后修饰的鉴定专家讲座第70页糖蛋白结构质谱解析母离子蛋白质翻译后修饰的鉴定专家讲座第71页糖蛋白结构质谱解析因为N-糖蛋白壳二糖关键中与天冬酰胺连接乙酰葡萄糖胺残基会在碰撞过程中发生跨环断裂，先后产生质荷比相差120，80中性碎片丢失，这两个碎片是发觉糖基化位点及糖肽氨基酸序列标志蛋白质翻译后修饰的鉴定专家讲座第72页糖蛋白结构质谱解析蛋白质翻译后修饰的鉴定专家讲座第73页3、凝集素在糖蛋白分析中应用蛋白质翻译后修饰的鉴定专家讲座第74页第三节蛋白质相互作用判定免疫沉淀酵母双杂交系统噬菌体展示技术串联亲和纯化(tandemaffinitypurification，TAP)蛋白质片段互补分析（proteinfragmentcomplementationanalysis,PCA）蛋白质芯片蛋白质翻译后修饰的鉴定专家讲座第75页酵母双杂交（twohybridsystem）研究真核基因转录调控时建立利用真核生长转录因子两个不一样结构域：DNA结合结构域(DNAbindingdomain)和转录激活结构域(transcription-activatingdomain)，分别与目标蛋白X及可能与目标蛋白相互作用蛋白Y相连，并共同转入酵母细胞;假如蛋白X与Y能够发生相互作用就能使转录因子原来分开两部分结合，形成完整活性形式从而激活下游汇报基因;经过检测汇报基因表示产物就可判断两种蛋白是否发生相互作用

蛋白质翻译后修饰的鉴定专家讲座第76页蛋白质翻译后修饰的鉴定专家讲座第77页酵母激活因子GAL4：N端：147个氨基酸组成DNA结合域(DNAbindingdomain,BD)，C端：113个氨基酸组成转录激活域(transcriptionactivationdomain,AD)GAL4分子DNA结合域能够和上游激活序列(upstreamactivatingsequence，UAS)结合，而转录激活域则能激活UAS下游基因进行转录组成部分：（1）与BD融合蛋白表示载体，被表示蛋白称诱饵蛋白（bait）（2）与AD融合蛋白表示载体，被其表示蛋白称靶蛋白（prey）（3）带由一个或多个汇报基因宿主菌株酵母双杂交系统蛋白质翻译后修饰的鉴定专家讲座第78页YeastTwoHybrid原理BDXCOOHADcDNANH2

COOH共转化+BDX?ADGal4Gal4PromoterReporterTrp-Leu-cDNAlibraryNH2Gal4Gal4蛋白质翻译后修饰的鉴定专家讲座第79页蛋白质翻译后修饰的鉴定专家讲座第80页优点作用信号是在融合基因表示后，在细胞内重建转录因子作用而给出，省去了纯化蛋白质繁琐步骤检测在活细胞内进行，能够在一定程度上代表细胞内真实情况检测结果能够是基因表示产物积累效应，因而可检测存在于蛋白质之间微弱或暂时相互作用可采取不一样组织、器官、细胞类型和分化时期材料构建cDNA文库，能分析细胞浆、细胞核及膜结合蛋白等各种不一样亚细胞部位及功效蛋白以用作大规模蛋白筛选，在较短时间内对找到一些药品对相关组织主要作用蛋白，对于药品修饰和改进明确方向蛋白质翻译后修饰的鉴定专家讲座第81页不足(1)不能研究含有自激活特征蛋白质；(2)只能检测两个蛋白间相互作用；(3)检测相互作用需发生在细胞核内，对于不能定位到细胞核中蛋白质无法研究；(4)大部分试验中有快要50%假阳性率，且推测相互作用仅有3%在两种以上试验中得到验证蛋白质翻译后修饰的鉴定专家讲座第82页噬菌体展示技术噬菌体表面展示技术是一个对多肽功效非常有效筛选技术，即将外源蛋白分子或多肽基因克隆到丝状噬菌体基因组中，与噬菌体外膜蛋白融合表示，展示在噬菌体颗粒表面因为外源蛋白或多肽基因型和表型统一在同一噬菌体颗粒内，所以，经过表型筛选就能够取得它编码基因蛋白质翻译后修饰的鉴定专家讲座第83页蛋白质翻译后修饰的鉴定专家讲座第84页蛋白质翻译后修饰的鉴定专家讲座第85页LeadHvLinkLvEPIII融合蛋白PIII基因型表示型蛋白质翻译后修饰的鉴定专家讲座第86页蛋白质翻译后修饰的鉴定专家讲座第87页外源基因融合于噬菌体不一样区段外壳蛋白基因表示模式蛋白质翻译后修饰的鉴定专家讲座第88页SolidphaseselectionwithimmunotubesImmunotubecoatedwithantigencoatedwithsteptavidinandbiotinylatedantigenBBBBBBBvv蛋白质翻译后修饰的鉴定专家讲座第89页biotinantigenSolutionphaseselectionwithbiotinylatedantigen蛋白质翻译后修饰的鉴定专家讲座第90页BindtoStr