实验室污染防治专家讲座

PCR污染监测

PCR强大扩增能力+检测敏感性经30个周期后，特定DNA片段数量在理论上可增加109倍极微量污染便可造成假阳性，尤其对定量造成很大问题NTC(NoTemplateControl):

必须设置一个不含模板DNA但含有PCR系统中全部其它成份对照反应，这一对照管须在准备好全部其它PCR以后才进行吸加。

实验室污染防治专家讲座第1页常见PCRcontamination常规PCR荧光定量PCRNTC432176598NTC实验室污染防治专家讲座第2页引发PCR污染原因模板间交叉污染容器被污染模板放置时,因为密封不严溢于容器外容器外粘有模板而造成相互间交叉污染模板吸收过程中,因气溶胶（aerosol）或其它原因引发移液器污染，从而造成交叉污染实验室污染防治专家讲座第3页引发PCR污染原因PCR试剂污染PCR试剂配制过程中,移液器、容器、水等原因造成试剂被PCR核酸模板污染。实验室污染防治专家讲座第4页引发PCR污染原因PCR产物污染-最主要最常见PCR产物拷贝量大，极微量PCR产物污染,就可形成假阳性。移液器吸收PCR产物进行电泳检测，同一支移液器去准备PCRmixPCR产物气溶胶污染：一个气溶胶颗粒可能含几万个拷贝气溶胶（aerosol）：悬浮于气体介质中粒径普通为0.001μm~1000μm固体、液体微小粒子形成胶溶状态散体系。

空气与液体面摩擦时就可形成气溶胶,在操作时比较猛烈地摇动反应管,开盖时、吸样时及移液器重复吸样都可形成气溶胶实验室污染防治专家讲座第5页引发PCR污染原因试验室中克隆质粒污染克隆质粒浓度高,另外在纯化过程中需用较多用具及试剂,其污染可能性也很大实验室污染防治专家讲座第6页预防PCR污染首要标准永远要设置NTC对照假如不能在污染出现第一时间发觉，会造成严重后果：一大段时间数据不可信准备PCR移液器要专用

千万不能用吸收PCR产物/克隆质粒移液器去准备PCR体系实验室污染防治专家讲座第7页预防PCR污染空间：

合理分隔试验区域:将样品处理、配制PCR反应液、PCR循环扩增及PCR产物判定等步骤分区进行，尤其注意样本处理及PCR产物判定应与其它步骤严格分开。

理想状态：各个区域试验用具及移液器专用，试验前应将该区域用紫外线消毒，破坏残留DNA或RNA。实验室污染防治专家讲座第8页预防PCR污染操作一旦进入吸加PCR试剂专用场所并开始工作，就应戴上一副新手套，并应勤于更换。准备专供自己使用PCR试剂，分装为小份。不要与样品存放在一起。选择质量好Eppendorf管--密封性好且开管不需要太大力气打开离心管前应先离心，将管壁及管盖上液体甩至管底部。开管动作要轻，以防管内液体溅出。试验结束后及时清理台面实验室污染防治专家讲座第9页预防PCR污染移液器操作因为操作时不慎将模板吸入枪内或粘上枪头是一个严重污染源，因而加样时要十分小心。1）准备PCR移液器专用2）吸样要慢，吸样时尽可能一次性完成，忌屡次抽吸，切勿形成喷雾，以免交叉污染或产生气溶胶污染。3）最好在加完全部其它反应成份后才吸加模板。4）推荐在准备PCR过程中使用滤芯枪头实验室污染防治专家讲座第10页选取含UNG（尿嘧啶DNA糖基酶Uracil-N-Glycosylase)试剂，有利于预防PCR产物引发污染。UNG：50摄氏度，2分钟，作用于含有dUDNA双链或单链然后开始PCR反应预变性步骤，同时UNG失活预防PCR污染对于不含dUPCR产物无效实验室污染防治专家讲座第11页出现污染后处理方法更换试剂更换新试剂和水，用确保无污染移液器分装备用清洁全部可能污染源：试验台面、小离心机、冰箱门把手等等1）试验台面、超净工作台用现配3%双氧水或10%次氯酸钠溶液擦拭清洁。2）或者用10%漂白粉溶液擦拭3)紫外光照射，照射距离应不超出90cm，照射时间最好过夜。试验过程中愈加小心，采取前面提到各种预防污染方法实验室污染防治专家讲座第12页参考文件

KwokS,HiguchiR.AvoidingfalsepositiveswithPCR[J].Nature,1989,339(6221):237-238.MifflinT.E.SettingUpaPCRLaboratory.

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